Этот простой и воспроизводимый протокол был успешно использован для выделения высококачественных ядер из здоровой и больной мышиной модели печени, а также печени человеческих и нечеловеческих приматов. Этот метод требует лишь небольшого количества замороженного тканевого материала. Кроме того, стимуляция по уровню плотности дает очень чистую ядерную суспензию со всеми основными типами клеток в печени, сохраненными в окончательной ядерной подготовке.
Этот метод экстракции ядер может быть использован в биоархивных образцах печени человека, которые хранятся в биобанках. Начните гомогенизацию ткани, вырезав кусок куба размером 2230 миллиграммов или пять миллиметров из ткани печени, помещенной в чашку Петри на сухом льду с помощью предварительно охлажденного скальпеля. Немедленно переложите чашку Петри на влажный лед и добавьте один миллилитр буфера гомогенизации.
Используя холодный скальпель, измельчите ткань как можно больше, позволяя ей аспирироваться с одним миллилитровым широким наконечником отверстия. Соберите тканевую суспензию и перенесите ее в предварительно охлажденный двухмиллилитровой стеклянный гомогенизатор. Вымойте чашку Петри дополнительным 0,521 миллилитра буфера гомогенизации и соберите все оставшиеся кусочки ткани, сохраняя все на льду.
Медленно и осторожно выполните пять ударов рыхлым пестиком А по льду, не создавая пузырьков. Убедитесь, что пестик осторожно перемещается сверху вниз гомогенизатора с каждым ударом. Впоследствии выполните от 10 до 15 медленных ударов тугой пестикой В по льду без образования пузырьков.
После этого отфильтруйте гомогенат через 50-микрометровый клеточный сетчатый фильтр, переместив его в предварительно охлажденную трубку объемом 1,5 миллилитра. Используйте более одного фильтра или трубки для гомогенатов, содержащих большое количество соединительнотканных сгустков. Промойте гомогенизатор и фильтры дополнительным 0,521 миллилитра буфера гомогенизации, чтобы тщательно собрать все гомогенаты тканей перед центрифугированием градиента плотности.
Для центрифугирования градиента плотности центрифугируют отфильтрованный гомогенат в предварительно охлажденной центрифуге с фиксированным углом при 1000 G в течение восьми минут при четырех градусах Цельсия. Пока образец центрифугируется, подготовьте 1,5-миллилитровую трубку, содержащую 250 микролитров 50%-годиксанолового разведения и одну двухмиллилитровую трубку, содержащую 500 микролитров 29%-годиксанолового разведения. Поместите обе трубки на лед.
Затем из суспензии центрифуги аспирируйте супернатант, не нарушая гранулу с помощью вакуумного насоса. Повторно суспендируйте гранулу в 250 микролитрах буфера гомогенизации, используя наконечник пипетки шириной в один миллилитр. Затем переложите 250 микролитров суспензии ядер в предварительно охлажденную 1,5-миллилитровую трубку, содержащую 250 микролитров 50% йодиксанола, и аккуратно и тщательно перемешайте ее для получения 25%-ной суспензии ядер йодиксанола.
Далее перекладывают 500 микролитров 25%-ной суспензии ядер йодиксанола в предварительно охлажденную трубку миллилитра, содержащую 500 микролитров 29%-гоодиксанолового разведения. Центрифугируйте трубку в предварительно охлажденной центрифуге с качающимся ведром при 12 500 Г в течение 20 минут с выключением перерыва. Непосредственно перед завершением стадии центрифугирования добавьте ингибиторы РНК в буфер хранения ядер или NSB, приступая к конвейерам секвенирования РНК с одним ядром.
После завершения центрифугирования аспирируйте супернатант, не нарушая гранулу с помощью вакуумного насоса. Осторожно повторно суспендируйте гранулу в 100-300 микролитрах NSB, используя наконечник отверстия шириной в один миллилитр, и перенесите суспензию ядер в чистую предварительно охлажденную 1,5-миллилитровую трубку. Подсчитайте ядра с помощью раствора трипан-синего с помощью ручного гемоцитометра и сразу же используйте полученную суспензию ядер для анализа геномики одного ядра.
Для сортировки клеток на основе проточной цитометрии фильтруйте суспензию ядер через 50-микрометровый фильтр в предварительно охлажденную пятимиллилитровую флуоресцентную активированную сортировку клеток или факсимильную трубку. Используйте сортировщик проточной цитометрии, оснащенный 100-микрометровым соплом, и загрузите факсимильную трубку на сортировщик перед предварительным просмотром образца. Настройте стратегию гатинга для сортировки ядер, начиная с затвора рассеяния, отображая прямую область рассеяния против области бокового рассеяния, затем мистификационную высоту против мистификационной области, а затем мистификационную ширину против мистификационной области.
Визуализируйте профиль плоидности ядер на гистограмме искаженной области. Для сортировки на 96 или 384 скважинные пластины установите задержку капель и оптимизируйте выравнивание пластин колорметрическим методом. Установите охлаждение образца и держатель пластины на четыре градуса Цельсия с включенным вращением образца при 300 оборотах в минуту.
Сортируйте одиночные ядра с концентрацией образца примерно в один раз от 10 до пятого ядра на миллилитр со скоростью потока от 200 до 500 событий в секунду. Микроскопическое исследование ядер, извлеченных из замороженной печени, показало, что стадия центрифугирования градиента плотности значительно облегчала удаление нежелательных клеточных и тканевых обломков. Эта методология сохранила все уровни плоидности, которая была подтверждена и количественно определена цитометрическим анализом.
Показатели высокого качества наблюдались на основе данных, полученных с помощью экстракции ядер. Равномерное многообразное приближение и проекция представляли собой количество подсчетов по всем ядрам и основным типам клеток, которые можно уверенно идентифицировать только с ядерным транскриптомом и относительно неглубоким секвенированием. Этот подход позволил исследовать специфические для печени факторы транскрипции и гены-мишени, участвующие в метаболизме ксенобиотиков.
Дополнительный паттерн отличительных генов, таких как процентральный CYP2E1 и перипортальный CYP2F2, показал, что извлеченные ядра сохраняют критическую информацию о донорстве печени. Библиотека экспрессии генов РНК была секвенирована на глубину 44 600 считываний на ядро, а библиотека ATAC на глубину 43 500 считываний на ядро. Взвешенный анализ ближайшего соседа, выполненный для нескольких измерений обеих модальностей, РНК плюс ATAC, с использованием пакетов Seurat и Signac, позволил идентифицировать и аннотировать основные и второстепенные типы клеток печени без заметных смещений из-за размера клеток или ядерной хрупкости.
В этом методе также были обнаружены регуляторы транскрипции и отличительные гены донорства печени. Важно избегать создания слишком большого количества пузырьков во время гомогенизации пуха при перемещении пестиков вверх и вниз и придерживаться количества штрихов, указанных в протоколе.
