يقدم هذا البروتوكول نظام تنشيط SPH CRISPR كاستراتيجية بديلة للنواقل الفيروسية التقليدية لأداء فحوصات وظيفة الكسب في الخلايا الشحمية. يسمح بالإفراط في التعبير عن الجينات الداخلية للخلايا الشحمية المفردة أو المتعددة داخل البيئة الخلوية المعقدة للأنسجة الدهنية عن طريق تقديم الحمض النووي الريبي الموجه الفردي المخصص باستخدام فيروس مرتبط بالأدينو. ترتبط الخطوات الصعبة لهذا البروتوكول باستنساخ الحمض النووي الريبي الموجه الوحيد وإنتاج وحقن الفيروس المرتبط بالغدي في الأنسجة الدهنية.
للبدء ، صمم دليل واحد RNA أو sgRNA لتنشيط CRISPR باستخدام chopchop أو أي أداة أخرى مناسبة. صمم sgRNA الذي يستهدف جين PRDM16 باستخدام المعلمات التالية: الهدف ك PRDM16 في Mus musculus باستخدام CRISPR / Cas9 وللتنشيط. أضف الأجزاء المتدلية إلى sgRNA لتتناسب مع موقع تقييد Sac1 في العمود الفقري المتجه PAAVU6GRNACBHM الكرز.
تشمل 5'AGCT 3'حيث n يتوافق مع النيوكليوتيدات. احصل على تسلسل مكمل عكسي ل 3'sgRNA باستخدام الأداة المشار إليها. بعد ذلك ، لتلدين قليل النوكليوتيدات التكميلية المفردة التي تقطعت بها السبل ، أضف ميكرولترا واحدا من كل قليل النوكليوتيد 5'و 3's تقطعت بهم السبل ، وميكرولتر واحد من المخزن المؤقت T4 ligase ، و 0.5 ميكرولتر من كيناز T4 polynucleotide ، و 6.5 ميكرولتر من الماء لحجم تفاعل نهائي يبلغ 10 ميكرولتر.
قم بتلدين قليل النيوكليوتيدات المفردة التي تقطعت بها السبل باستخدام جهاز تدوير حراري عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، متبوعا بمعدل انخفاض يبلغ خمس درجات مئوية في الدقيقة. ثم لربط قليل النوكليوتيدات sgRNA الملدن ، أضف 25 نانوجرام من كرز البلازميد PAAVU6GRNACBHM إلى ميكرولتر من قليل النوكليوتيدات sgRNA الملدن ، وميكرولتر واحد من إنزيم Sac1 ، وميكرولتر من 10X T4 DNA ligase buffer ، وميكرولتر واحد من T4 DNA ligase والماء إلى حجم تفاعل نهائي يبلغ 10 ميكرولتر. باستخدام جهاز تدوير حراري ، قم بإجراء الربط عن طريق احتضان خليط التفاعل لمدة 15 دورة عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق و 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق متبوعا بالتثبيت عند أربع درجات سلزية.
بعد ذلك ، قم بتحويل خلايا Escherichia coli DH10B المختصة بأربعة ميكرولتر من منتج الربط عن طريق الصدمة الحرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية وانتشرت على صفيحة أجار تحتوي على 10 ميكروغرام لكل ملليلتر أمبيسلين. قم بتأكيد المستعمرات المحولة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرة أو تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام PCR Master Mix ، واختر المستعمرة واخلطها مع خمسة ميكرولترات من Master Mix ، و 0.1 ميكرولتر من التمهيدي العالمي ، و 0.1 ميكرولتر من التمهيدي العكسي sgRNA وخمسة ميكرولتر من الماء. قم بتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام تمسخ أولي عند 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، تليها 35 دورة من التمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، والتلدين لمدة 30 ثانية عند 60 درجة مئوية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، وخطوة استطالة نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بحل الحمض النووي باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز في 0.5X TAE Buffer عند 90 فولت لمدة 30 دقيقة. إرسال عينات إيجابية لتسلسل سانجر باستخدام التمهيدي العالمي. بعد ذلك ، قم بتنقية البلازميد من استنساخ إيجابي باستخدام مجموعة تنقية البلازميد باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
ضع الفأر المخدر في وضع الاستلقاء واحلق منطقة صغيرة على الأجنحة القريبة من مفاصل الورك للأنسجة الدهنية البيضاء الأربية أو حقن IWAT باستخدام ماكينة حلاقة. أضف كريم مزيل الشعر لمدة خمس دقائق. إزالة كريم المتبقية بالماء لتجنب حروق الجلد.
تطهير الجلد باستخدام ثلاث جولات بالتناوب من تطبيق محلول اليود البوفيدون على الجلد مع الشاش النظيف والكحول 70 ٪. بعد ذلك ، قم بعمل شق من سنتيمتر إلى سنتيمترين بمقص معقم في المنطقة القريبة من المفاصل وأمسك الجلد مفتوحا باستخدام ملقط لفضح مستودع الدهون. يمكن ربط WAT بالجلد على كلا الجانبين وتمديده من البداية من الخلف ونحو الخصيتين.
باستخدام الملقط ، اسحب مستودع الدهون برفق لأعلى من خلال الشق للتأكد من أن الحقن في المكان والعمق الصحيحين. املأ حقنة الميكرولتر ب 2.5 ميكرولتر من الفيروس المرتبط بالغدي أو AAV الذي يحتوي على sgRNA الذي يستهدف جين PRDM16 الداخلي. أدخل الإبرة بعناية بزاوية 30-45 درجة في IWAT.
كرر الحقن خمس مرات في مواقع مختلفة من الأنسجة لإصابة وسادة الدهون IWAT بأكملها بشكل متجانس. ضع الماوس على وسادة التدفئة حتى يتم استعادة الوعي. راقب الحيوان كل 10 إلى 15 دقيقة حتى يتعافى تماما.
بعد أن يستعيد الحيوان وعيه ، لاحظ التنميط القاطر ، والذي يجب أن يكون خطيا وليس له أي علامات على الضيق أو الألم. شاهد الخلايا الوعائية اللحمية أو SVF المشتقة من فأر adipo SPH IWAT في لوحة ذات 6 آبار تحتوي على وسط DMEM كامل لمدة ساعة إلى ساعتين ، ونضح الوسط ، واغسل البئر مرتين باستخدام PBS ، واستبدله بوسط جديد وكامل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ رطوبة حتى تصل الخلايا إلى التقاء 70-80٪.
في اليوم 0 ، حث التمايز عن طريق معالجة الخلايا بوسط الحث وبعد يومين استبدل وسط الحث بوسط الصيانة. مرة أخرى بعد يومين ، في اليوم الرابع ، استبدل وسيط الصيانة بوسيط صيانة جديد لمدة 2-3 أيام. قم بتغيير وسيط الصيانة كل 48 ساعة حتى يتم تمييز الخلايا preadipocytes بالكامل إلى خلايا دهنية.
راقب الخلايا الشحمية الناضجة باستخدام الفحص المجهري الضوئي حيث تبدو الخلايا المتمايزة محملة بقطرات الدهون. بعد زراعة الخلايا على صفيحة استزراع 6 آبار مع الوسط الكامل حتى تصل الخلايا إلى التقاء 70-80٪ ، امزج 5.6 * 10 ^ 10 جينوم فيروسي لكل ميكرولتر من sgRNA PRDM16 الحامل ل AAV مع ملليلتر من بروميد الوسيط الكامل وهيكساديثرين. قم بتحويل الخلايا عن طريق استبدال الوسط الكامل وإضافة الوسط الكامل الذي يحتوي على AAV.
احتضان الخلايا المحولة لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية 95٪ رطوبة و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. انقسام ورؤية الخلايا كما هو موصوف لتكاثر الخلايا والتمايز إلى الخلايا الشحمية البيج. أظهرت صور التألق المناعي من IWAT لفئران adipo SPH التعبير عن dCas9 في كل من المجموعة الضابطة و PRDM16.
من الواضح أن تعبير PRDM16 الناجم عن SPH قد أدى إلى تراكم واسع النطاق للخلايا الشحمية البيج متعددة العيون في IWAT. علاوة على ذلك ، كشف تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي عن زيادة التعبير عن PRDM16 وبرنامج الجينات الحرارية في مجموعة PRDM16 مقارنة بالسيطرة. وبالمثل ، أكد تحليل التعبير الجيني في المختبر زيادة التعبير عن جين PRDM16 الداخلي والجينات الحرارية في مجموعة التعبير المفرط PRDM16 مقارنة بالسيطرة.
أدى تعبير PRDM16 الناجم عن SPH إلى استهلاك أكسجين قاعدي وأقصى من ذلك الموجود في الخلايا الضابطة. الأهم من ذلك ، أشارت البيانات إلى تعزيز التنفس غير المنفصل في مجموعة PRDM16 مقارنة بالمجموعة الضابطة. نموذج Adipo SPH مناسب للتحقيق في جينات متعددة وعناصر تنظيمية داخل الخلايا الشحمية.
تفتح هذه الطريقة إمكانية فهم أعمق لبيولوجيا الدهون البيج.
