يوفر هذا البروتوكول طريقة يمكن استخدامها للمساعدة في التقييم ، وفي المستقبل ، المساعدة في تطوير علاجات لتكلس الأوعية الدموية ، وهو أهم مؤشر لأمراض القلب والأوعية الدموية. تسمح لنا القدرة على عزل EVs بإجراء مزيد من الدراسة للآليات التي تؤدي إلى تكلس الأوعية الدموية ، والتغيير الظاهري لخلايا العضلات الملساء الوعائية. توفر هذه التقنية نظرة ثاقبة للآليات الجزيئية المبكرة لتكلس الخلايا العضلية الملساء الوعائية.
فهم هذا يسمح بدراسة الخيارات العلاجية للآلية المفهومة. يمكن دراسة أي EVs ذات أهمية باستخدام هذه الطريقة. لا يقتصر على خلايا العضلات الملساء الوعائية أو بانيات العظم أو تكلس الأوعية الدموية.
بعد القتل الرحيم للفأر ، ارفع الجلد باستخدام الملقط ، وقم بعمل شق أسفل خط الوسط. إزالة أي الجلد الزائد ، أو الدهون. ثم قم بإزالة الأعضاء التناسلية والمثانة والدهون خارج خط الوسط.
ثم انقل أعضاء الجهاز الهضمي إلى الجانب الأيمن واتبع الأمعاء في خط الوسط. بمجرد العثور عليها ، ارفع خط الوسط ، واستأصل الجهاز الهضمي حتى المعدة. استئصال الكلى عن طريق رفعها بعيدا عن خط الوسط.
قطع بالقرب من الكلى قدر الإمكان. إزالة الكبد عن طريق رفع الفصوص وقطع بعيدا عن خط الوسط. ثم قم ببث القلب والشريان الأورطي عن طريق حقن برنامج تلفزيوني بارد في البطين الأيمن باستخدام حقنة سعة 10 ملليلتر.
انتظر حتى تنتفخ الرئتان وتتحول إلى اللون الأبيض. إزالة الرئتين وأي الحجاب الحاجز الزائد ، أو القفص الصدري. لإزالة العظم ، افتح مقصا عريضا وضعه في المنطقة السفلية من الماوس فوق الذيل.
قطع لأسفل ، ورفع العمود الفقري من الجلد ، وإزالة الدهون من جانبي خط الوسط. بمجرد فصل الجلد ، قم باستئصال العمود الفقري والأعضاء السليمة عن طريق القطع فوق القلب مباشرة. ضع العمود الفقري والأعضاء السليمة في دورق من PBS في دلو الثلج إذا تم نقله إلى مجسم.
بعد تحريك العمود الفقري والأعضاء إلى طبق التشريح ، املأه بالثلج البارد PBS ، وقم بتثبيت العمود الفقري والقفص الصدري باستخدام الإبر. تحت مجهر التشريح ، ارفع القلب بعناية باستخدام الملقط ، وابدأ في القطع فوق العمود الفقري وتحت الشريان الأورطي. استمر في هذا حتى يتم الوصول إلى الجزء السفلي من العمود الفقري.
قم بإزالة العمود الفقري من طبق التشريح ، وقم بتثبيت القلب وأي دهون أو عضلات غريبة. بدءا من المنطقة الواقعة أسفل القلب مباشرة ، حدد المريء والوريد الأجوف والشريان الأورطي. قم بإزالة المريء والوريد الأجوف للحصول على مجال بصري واضح للشريان الأورطي.
باستخدام ملقط ومقص التشريح الدقيق ، ابدأ في رفع الأنسجة الدهنية ، وقطع أقرب ما يمكن إلى الشريان الأورطي. استمر في ذلك أسفل الخط الإنسي حتى تنكشف جميع الشريان الأورطي والشرايين الفخذية. في القلب ، قم بإزالة جميع الأنسجة الدهنية التي تعرض الفروع الثلاثة في قوس الأبهر.
قم بإزالة جذر الأبهر من البطين الأيسر عن طريق إدخال مقص التشريح الدقيق في البطين الأيسر ، وقطع العضلات المحيطة بالشريان الأورطي. بمجرد عزل الشريان الأورطي وتنظيفه ، قم بتصوير الشريان الأورطي باستخدام ماسح ضوئي قريب من الأشعة تحت الحمراء لتصور تكلس الأوعية الدموية. باستخدام البرنامج النصي MATLAB المخصص ، حدد الإشارة الإجمالية لمقتفي الكالسيوم الطبيعي إلى إجمالي منطقة الشريان الأورطي الممسوحة ضوئيا.
قم بتوجيه MATLAB إلى موقع ملفات TIF من المسح بالأشعة تحت الحمراء القريبة من الشريان الأورطي ، وافتح الملفات الفردية ، واستخرج قيم كثافة البكسل من ملفات TIF. حدد الشريان الأورطي ذو التكلس الأكبر كأقصى مقياس على الصورة المعينة بالألوان. عندما يظهر الأمر ، كم عدد العينات الموجودة في الصورة ، على النافذة ، أدخل عدد الأبهر في الصورة الحالية ، وحدد كل شريان أورطي واحدا تلو الآخر.
بمجرد اختيار الشريان الأورطي ، سيقوم MATLAB بإنشاء صور ثنائية مع قناع للمساحة الكلية والمنطقة المتكلسة من الشريان الأورطي. ثم يتم استخدام القيم من هذه الصور المقنعة لتحديد إجمالي المساحة المتكلسة ، والمساحة الكلية للشريان الأورطي ، والنسبة المئوية للمساحة الموجبة للتكلس ، ومتوسط شدة المنطقة المتكلسة. مباشرة بعد مسح الشريان الأورطي ، قم بتجميع اثنين إلى ثلاثة من الأورتا لإنتاج تركيز كاف من البروتين.
احتضان اثنين إلى ثلاثة من الأبهر المجمع في 1.5 ملليلتر من محلول الهضم لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. جمع الحل وأجهزة الطرد المركزي في 1،000 غرام لمدة 15 دقيقة لإزالة حطام الخلية. بعد ذلك ، لإزالة الحويصلات الدقيقة ، قم بطرد المادة الطافية مرة أخرى لمدة 30 دقيقة عند 33،000 جم.
جمع وتقييم الطافية لإمكانية التكلس. بعد إزالة حطام الخلية من الوسط المجمعة المشروط عن طريق الطرد المركزي ، قم بتدوير المادة الطافية المجمعة عند 33،000 جم لمدة 30 دقيقة. جمع طاف ونقله إلى أنبوب جديد.
ثم أضف 1٪ من 300 مليمول فوسفات هيدروجين الصوديوم إلى عينات الحويصلة خارج الخلية ، واخلط المحلول عن طريق الماصة. انقل 200 ميكرولتر من محلول الخليط إلى صفيحة 96 بئرا ، واحتضن الصفيحة المكونة من 96 بئرا في قارئ الصفيحة الدقيقة عند 37 درجة مئوية. اضبط قارئ اللوحة لتسجيل الامتصاص بطول موجي يبلغ 340 نانومتر كل دقيقة واحدة.
ماصة 300 ميكرولتر من محلول الكولاجين في كل بئر من زجاج من ثماني آبار ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة. بعد الحضانة ، أضف 300 ميكرولتر من DMEM كعنصر تحكم في الآبار. أضف 300 ميكرولتر من عينات وسط الحويصلة خارج الخلية التي تم جمعها مسبقا إلى الآبار المتبقية ، واحتضانها لمدة ستة أيام ، كما هو موضح سابقا.
في اليوم العاشر ، ماصة 2.5 ميكرولتر من خليط OsteoSense و DMEM في كل بئر ، واحتضانها لمدة 24 ساعة. في نهاية الحضانة ، قم بتصوير الهلاميات المائية مع مرشحات لمضان OsteoSense من خلال الجزء السفلي من غرفة الغطاء الزجاجي باستخدام مجهر مقلوب ، أو من الأعلى بهدف مسافة عمل طويلة. قم بتقييم عدد التكلسات وحجم التكلس والصور التي تم جمعها باستخدام خيارات تحليل الجسيمات المتاحة في ImageJ.
ثم انتقل إلى الصورة، وحدد ضبط، وانقر فوق عتبة لتدوين الصور، بحيث تظهر إشارة OsteoSense فقط باللون الأبيض. ثم استخدم أمر تحليل، وانقر تحليل الجسيمات للحصول على معلومات لكل تكلس في الصورة. استخدم نفس معلمات العتبة للتناسق لكل صورة تم تحليلها.
أظهر التصوير بالماسح الضوئي بالأشعة تحت الحمراء القريبة من الأورتا التي تم تشريحها إشارة OsteoSense أعلى في جميع أنحاء الشريان الأورطي للفأر المصاب بمرض الكلى المزمن من اثنين من الأورتا من الفئران الضابطة. أظهر الوسط المكيف الذي تم الحصول عليه من خلايا العضلات الملساء الوعائية المزروعة في وسط مؤيد للتكلس امتصاصا أعلى عند 340 نانومتر من وسط التحكم. حدثت زيادة الامتصاص أسرع بمقدار 1.5 مرة في العينة المؤيدة للتكلس مقارنة بعينة التحكم.
احتوى الوسط المكيف من الخلايا المستزرعة في ظروف مؤيدة للتكلس على رواسب معدنية. عند التشريح الدقيق للشريان الأورطي ، من المهم قطع الدهون المحيطة بالشريان الأورطي بعناية. تريد تحليل أكبر قدر ممكن من الشريان الأورطي ، لكن هذا قد يكون مملا للغاية.
بمجرد عزل المركبات الكهربائية ، يمكن إكمال اختبارات إضافية ، مثل فحص نشاط الفوسفاتيز القلوي ، أو الجسم المناعي. ستظهر هذه الاختبارات أيضا الآليات والبروتينات الموجودة في المركبات الكهربائية.
