يسمح هذا البروتوكول بتصور الخلايا الظهارية أثناء التئام الجروح في الحيوانات الحية. يسمح لنا برؤية كيف تتصرف الخلايا في بيئتها الطبيعية المعقدة. تقوم هذه التقنية بإدخال الكواشف في المصفوفة خارج الخلية وسيتوبلازم الخلية لدراسة تأثير هذه الكواشف على انتشار الخلايا وهجرتها أثناء التئام الجروح في الحيوانات الحية.
التئام الجروح الظهارية و Clytia يشبه بشكل ملحوظ الشفاء في الحيوانات الأكثر تعقيدا. لذلك ، يمكننا أن نتعلم الكثير من هذا النظام حول آليات التئام الجروح وكيف نشأت. ستوضح هذه الإجراءات إليزابيث لي وفني الأبحاث إميلي واتو.
لبدء عملية الجرح ، قم بإعداد ماصة نقل معدلة عن طريق قطع طرف الماصة بالمقص ، وإنشاء فتحة موسعة يبلغ قطرها حوالي 0.5 إلى 0.7 سم. باستخدام ماصة النقل المعدلة ، ضع ميدوسا التي تم جمعها من مستعمرات الاورام الحميدة المنشأة على شريحة منخفضة ، مع توجيه مظلة medusa X لأعلى. تأكد من أن ما يكفي من مياه البحر الاصطناعية ، أو ASW ، يغطي الحيوان.
لإنشاء جروح دقيقة داخل الخلايا وفيما بينها ، ضع غطاء فوق الحيوان. تضغط زلة الغطاء على الميزوجليا ويؤدي ارتداد الأنسجة المضغوطة إلى إبعاد الخلايا قليلا. تخيل الحيوان على الفور لمراقبة الجروح الدقيقة التي تم إنشاؤها.
لإنشاء جروح ظهارية صغيرة ، ضع ميدوسا على شريحة منخفضة مع توجيه مظلة medusa X لأعلى ، باستخدام ماصة نقل معدلة ، كما هو موضح سابقا. باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر ، خدش سطح ميدوسا برفق. قد يؤدي الخدش اللطيف إلى حدوث تمزقات في الغشاء القاعدي.
تغطية الحيوان مع زلة غطاء للتصوير. يكون وضع زلة الغطاء كافيا في بعض الأحيان لإنشاء جروح ظهارية صغيرة حتى بدون خدش. قم بإعداد إبرة حقن مجهرية ، باستخدام عمود ماصة صغير وأنبوب شعري زجاجي ، باتباع الخطوات الموضحة في النص.
ضع إبرة الحقن المجهري الفارغة في حامل حقن مجهري مثبت على مناور دقيق واقطع طرف الإبرة ، بحيث تكون الفتحة حوالي 20 إلى 40 ميكرون. اضبط ضغط الانتظار على الحاقن الدقيق على الصفر ، وضغط الطرد على حوالي 20 رطلا لكل بوصة مربعة. اضبط الحاقن الدقيق لتوصيل نبضة هواء لمدة ثانيتين.
لإنشاء جروح ظهارية كبيرة ، ضع ميدوسا على شريحة اكتئاب ، كما هو موضح من قبل. باستخدام المناور الدقيق ، اضبط طرف إبرة الحقن المجهري ليبقى فوق الماء مباشرة ، عن طريق غمس الطرف بعناية في الماء ، ثم سحبه بحيث يكون قريبا من السطح الظهاري للميدوسا. نبض الهواء عن طريق الضغط على ابدأ على الحاقن.
كرر النبض في نفس المكان مرتين إلى أربع مرات ، اعتمادا على عرض الحافة. تتطلب النصائح الأكبر نبضات أقل. قم بتغطية الحيوان المصاب بقسيمة غطاء لتصوير الجروح الكبيرة.
اضبط التركيز على المظلة x. يجب أن تكون الخلايا السداسية واضحة. حدد الجرح يدويا لتصويره.
ابدأ برنامجا يجمع الصور كفيلم في الوقت الفعلي ، أو برنامجا يجمع سلسلة من الصور على فترات منتظمة. راقب التقدم للتأكد من أن منطقة الجرح لا تنجرف خارج مجال الرؤية ، وأن الخلايا ذات الاهتمام تظل في بؤرة التركيز. لحقن الأصباغ والأدوية ، قم بعمل إبرة حقن مجهرية باتباع الخطوات الموضحة في النص.
ردم إبرة الحقن المجهري باستخدام طرف ماصة طويل مع حجم زائد من الصبغة أو الدواء للحقن في ميدوسا. باستخدام ماصة نقل معدلة ، ضع ميدوسا مع توجيه المظلة الفرعية لأعلى في طبق حقن polydimethylsiloxane ، أو PDMS ، مع ما يكفي من ASW لتغطية الحيوان. ضع الطبق على مرحلة من المجهر تشريح.
ركز على طرف إبرة الحقن المجهري ، وادفعها في الماء بالقرب من ميدوسا. باستخدام المناور الصغير ، اضغط على الإبرة في الطبق حتى تنحني وتنكسر. إنشاء فتحة طرف من حوالي 10 إلى 20 ميكرون.
باستخدام المناور الدقيق ، أدخل طرف الإبرة من خلال المظلة الفرعية في mesoglea دون ثقب المظلة X. على الحاقن الدقيق ، اضبط ضغط الانتظار على الصفر ، وضغط الحقن أقل أو يساوي 20 رطلا لكل بوصة مربعة. احقن في ربع واحد أو اثنين ، واملأ كل منهما ببقعة من الصبغة أو الدواء ما يقرب من ربع مساحة هذا الربع.
اعتمادا على الصبغة أو الدواء الذي يتم حقنه ، يتم وضع الحيوانات في دورق من ASW الطازج للسماح بنشر الصبغة أو الدواء وحضانته. للتصوير ، قم بتركيب ميدوسا على شريحة منخفضة باستخدام ماصة نقل معدلة ، مع وضع الحيوان مع توجيه المظلة X لأعلى. يمكن إصابة الحيوانات في هذه المرحلة لاختبار تأثير الكاشف المحقون.
شكلت الجروح الدقيقة داخل الخلايا وفيما بينها صفيحة صغيرة أثناء إغلاق الجرح. وأعقب ذلك تقلص ، وشفيت الجروح في أقل من دقيقة. تلتئم الجروح الظهارية الصغيرة أيضا من خلال تكوين الصفيحة وتمديد ملامسات الصفيحة.
سبق إغلاق الجرح السريع والتدريجي تقلص الأنسجة على طول خط الجرح المشكل حديثا. يشير معدل الشفاء الطبيعي لجرحين صغيرين معبرا عنه كنسبة مئوية من إجمالي مساحة الجرح بمرور الوقت إلى بعض التباين في ديناميكيات إغلاق الجرح. تم استخدام بيانات من 14 جرحا مختلفا لإنشاء متوسط منحنى التئام الجروح في الحيوانات غير المعالجة.
في جرح صغير به تلف في الغشاء القاعدي ، تنتشر الخلايا الهامشية حول المنطقة المتضررة ، وتغلق الفجوة بتقلص سلسلة المحفظة. عندما تكون الأنسجة مجففة أو تالفة للغاية بحيث لا يمكن إصلاحها ، يمكن أن تتوقف حركات الخلايا ، أو يمكن أن تنفجر ورقة الخلايا بأكملها. تلتئم الجروح الكبيرة على عدة مراحل.
تنعيم الحافة بعد الانقباضات على الهامش ، وتشكيل الصفيحة ، وتمديد ملامسة الصفيحة لهجرة الخلايا الجماعية عند ، وعدة طبقات من الخلايا بعيدا ، أغلق الهامش فجوات كبيرة. تم تحقيق تلطيخ النووي والأغشية عن طريق الحقن الدقيق للكواشف في ECM. الحقن المجهري للسيتوكلاسين B يثبط تشكيل الصفيحة بعد الإصابة.
تعامل مع الحيوانات بلطف. عند حقن الكواشف ، تأكد من أن طرف إبرة الحقن المجهري في الميزوجليا ، ولم يمر عبر الحيوان. حاليا ، يتم تصنيع الحيوانات المعدلة وراثيا باستخدام بروتينات علامة الفلورسنت ، وسيعطي الفحص المجهري المشترك للتألق والمجهر التماثلي المتداخل صورة أوضح للأحداث الخلوية في التئام الجروح الظهارية.
