Ce protocole permet la visualisation des cellules épithéliales pendant la cicatrisation des plaies chez les animaux vivants. Il nous permet de voir comment les cellules se comportent dans leur environnement complexe naturel. Cette technique introduit des réactifs dans la matrice extracellulaire et le cytoplasme cellulaire pour étudier l’effet de ces réactifs sur la propagation et la migration cellulaires pendant la cicatrisation des plaies chez les animaux vivants.
La cicatrisation épithéliale des plaies et Clytia ressemble remarquablement à la guérison chez les animaux plus complexes. Par conséquent, nous pouvons apprendre beaucoup de ce système sur les mécanismes de cicatrisation des plaies et leur origine. Elizabeth Lee et la technicienne de recherche Emily Watto feront la démonstration de ces procédures.
Pour commencer le processus de blessure, préparez une pipette de transfert modifiée en coupant la pointe de la pipette avec des ciseaux, créant ainsi une ouverture élargie mesurant environ 0,5 à 0,7 centimètre de diamètre. À l’aide de la pipette de transfert modifiée, placez la méduse recueillie dans les colonies de polypes établies sur une lame de dépression, avec le parapluie de la méduse X tourné vers le haut. Assurez-vous que juste assez d’eau de mer artificielle, ou ASW, couvre l’animal.
Pour créer des micro-plaies à l’intérieur et entre les cellules, placez un couvercle sur l’animal. La glissière de couverture comprime la mésoglée et le rebond du tissu comprimé force les cellules à s’écarter légèrement. Imaginez immédiatement l’animal pour observer les micro-plaies créées.
Pour créer de petites plaies épithéliales, placez la méduse sur une lame de dépression avec le parapluie méduse X vers le haut, à l’aide d’une pipette de transfert modifiée, comme démontré précédemment. À l’aide d’un embout de pipette de 200 microlitres, grattez doucement la surface de la méduse. Un léger grattage peut créer des déchirures dans la membrane basale.
Couvrez l’animal avec un bordereau de couverture pour l’imagerie. Placer le couvercle est parfois suffisant pour créer de petites plaies épithéliales même sans rayures. Préparez une aiguille de micro-injection, à l’aide d’un pilier de micropipette et d’un tube capillaire en verre, en suivant les étapes décrites dans le texte.
Placez l’aiguille de microinjection vide dans un support de micro-injection fixé à un micromanipulateur et coupez la pointe de l’aiguille, de telle sorte que l’ouverture soit d’environ 20 à 40 microns. Réglez la pression de maintien sur le micro-injecteur à zéro et la pression d’éjection à environ 20 livres par pouce carré. Réglez le micro-injecteur pour qu’il délivre une impulsion d’air de deux secondes.
Pour créer de grandes plaies épithéliales, placez la méduse sur une lame de dépression, comme démontré précédemment. À l’aide du micromanipulateur, ajustez l’extrémité de l’aiguille de micro-injection pour qu’elle reste juste au-dessus de l’eau, en plongeant soigneusement la pointe dans l’eau, puis en la rétractant de manière à ce qu’elle soit proche de la surface épithéliale de la méduse. Pulsez de l’air en appuyant sur start sur l’injecteur.
Répétez l’impulsion au même endroit deux à quatre fois, selon la largeur de la pointe. Les pointes plus grandes nécessitent moins d’impulsions. Couvrez l’animal blessé avec un bordereau de couverture pour imager les grandes plaies.
Ajustez la mise au point sur le parapluie x. Les cellules hexagonales doivent être claires. Identifiez manuellement une plaie pour l’imager.
Démarrez un programme qui collecte des images sous forme de film en temps réel, ou un programme qui collecte une série d’images à intervalles réguliers. Surveillez les progrès pour vous assurer que la zone de la plaie ne dérive pas hors du champ de vision et que les cellules d’intérêt restent nettes. Pour l’injection de colorants et de drogues, fabriquez une aiguille de micro-injection en suivant les étapes décrites dans le texte.
Remplissez l’aiguille de micro-injection à l’aide d’une longue pointe de pipette avec un volume excessif de colorant ou de médicament pour injection dans la méduse. À l’aide d’une pipette de transfert modifiée, placer une méduse avec le sous-parasol vers le haut dans le polydiméthylsiloxane, ou boîte d’injection PDMS, avec juste assez d’ASW pour couvrir l’animal. Placez le plat sur une scène d’un microscope à dissection.
Concentrez-vous sur la pointe de l’aiguille de micro-injection et avancez-la dans l’eau près de la méduse. Avec le micro-manipulateur, enfoncez l’aiguille dans le plat jusqu’à ce qu’il se plie et se casse. Création d’une ouverture de pointe d’environ 10 à 20 microns.
À l’aide du micro-manipulateur, insérez la pointe de l’aiguille à travers le sous-parasol dans la mésogle sans perforer le parapluie X. Sur le micro-injecteur, réglez la pression de maintien à zéro et la pression d’injection inférieure ou égale à 20 livres par pouce carré. Injecter dans un ou deux quadrants, en remplissant chacun avec une tache de colorant ou de médicament environ un quart de la surface de ce quadrant.
Selon le colorant ou le médicament injecté, les animaux sont placés dans un bécher d’ASW frais pour permettre la diffusion et l’incubation du colorant ou du médicament. Pour l’imagerie, montez la méduse sur une lame de dépression à l’aide d’une pipette de transfert modifiée, en positionnant l’animal avec le parapluie X tourné vers le haut. Les animaux peuvent être blessés à ce stade pour tester l’effet d’un réactif injecté.
Les micro-plaies à l’intérieur et entre les cellules ont formé de petits lamellipodes lors de la fermeture de la plaie. Cela a été suivi d’une contraction, et les blessures ont guéri en moins d’une minute. Les petites plaies épithéliales ont également guéri par la formation de lamellipodes et l’extension des contacts lamellipodiens.
La fermeture rapide et progressive de la plaie a précédé la contraction tissulaire le long de la couture de la plaie nouvellement formée. Le taux de cicatrisation normalisé de deux petites plaies, exprimé en pourcentage de la surface totale de la plaie au fil du temps, indiquait une certaine variabilité dans la dynamique de fermeture de la plaie. Les données de 14 plaies différentes ont été utilisées pour établir une courbe moyenne de cicatrisation chez les animaux non traités.
Dans une petite plaie ayant des dommages à la membrane basale, les cellules marginales se sont répandues autour de la zone endommagée et l’espace s’est fermé avec une contraction de la corde de la bourse. Lorsque le tissu était déshydraté ou trop endommagé pour être réparé, les mouvements cellulaires pouvaient s’arrêter ou toute la feuille de cellules pouvait éclater. Grandes plaies guéries en plusieurs étapes.
Le lissage du bord à la suite de contractions à la marge, la formation de lamellipodes et l’extension des contacts de lamellipodes La migration cellulaire collective à la marge et à plusieurs niveaux cellulaires de la marge a comblé de grandes lacunes. La coloration nucléaire et membranaire a été obtenue en microinjectant les réactifs dans l’ECM. La micro-injection de cytochalasine B a inhibé la formation de lamellipodes après la blessure.
Manipulez les animaux avec douceur. Lorsque vous injectez des réactifs, assurez-vous que l’extrémité de l’aiguille de micro-injection se trouve dans la mésogle et n’a pas traversé complètement l’animal. Actuellement, les animaux transgéniques sont fabriqués avec des protéines de marquage fluorescentes, la fluorescence combinée et la microscopie de contraste interférent différentiel donneront une image encore plus claire des événements cellulaires dans la cicatrisation des plaies épithéliales.
