Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung von Epithelzellen während der Wundheilung bei lebenden Tieren. So können wir sehen, wie sich Zellen in ihrer natürlichen, komplexen Umgebung verhalten. Bei dieser Technik werden Reagenzien in die extrazelluläre Matrix und das Zellzytoplasma eingeführt, um die Wirkung dieser Reagenzien auf die Zellausbreitung und -migration während der Wundheilung bei lebenden Tieren zu untersuchen.
Epitheliale Wundheilung und Clytia ähneln bemerkenswert der Heilung bei komplexeren Tieren. Daher können wir von diesem System viel über die Mechanismen der Wundheilung und ihre Entstehung lernen. Diese Verfahren werden von Elizabeth Lee und der Forschungstechnikerin Emily Watto demonstriert.
Um mit dem Aufwickeln zu beginnen, bereiten Sie eine modifizierte Transferpipette vor, indem Sie die Pipettenspitze mit einer Schere abschneiden, wodurch eine vergrößerte Öffnung mit einem Durchmesser von etwa 0,5 bis 0,7 Zentimetern entsteht. Mit der modifizierten Transferpipette die aus den etablierten Polypenkolonien entnommene Medusa mit dem medusa X-Schirm nach oben auf einen Vertiefungsobjektträger legen. Stellen Sie sicher, dass das Tier gerade genug künstliches Meerwasser (ASW) bedeckt.
Um Mikrowunden innerhalb und zwischen den Zellen zu erzeugen, legen Sie ein Deckglas über das Tier. Das Deckglas komprimiert die Mesoglea und der Rückprall des komprimierten Gewebes drückt die Zellen leicht auseinander. Stellen Sie das Tier sofort dar, um die entstandenen Mikrowunden zu beobachten.
Um kleine Epithelwunden zu erzeugen, legen Sie die Medusa mit dem medusa X-Regenschirm nach oben auf einen Vertiefungsobjektträger und verwenden Sie eine modifizierte Transferpipette, wie zuvor gezeigt. Kratzen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze vorsichtig an der Oberfläche der Medusa. Durch leichtes Kratzen können Risse in der Basalmembran entstehen.
Decken Sie das Tier zur Bildgebung mit einem Deckglas ab. Das Auflegen des Deckglases reicht manchmal aus, um auch ohne Kratzer kleine Epithelwunden zu erzeugen. Bereiten Sie eine Mikroinjektionsnadel mit einer Mikropipettensäule und einem Kapillarröhrchen aus Glas vor und befolgen Sie die im Text beschriebenen Schritte.
Setzen Sie die leere Mikroinjektionsnadel in einen Mikroinjektionshalter ein, der an einem Mikromanipulator befestigt ist, und schneiden Sie die Nadelspitze so ab, dass die Öffnung etwa 20 bis 40 Mikrometer beträgt. Stellen Sie den Haltedruck am Mikroinjektor auf Null und den Auswurfdruck auf etwa 20 Pfund pro Quadratzoll ein. Stellen Sie den Mikroinjektor so ein, dass er einen Luftimpuls von zwei Sekunden abgibt.
Um große Epithelwunden zu erzeugen, legen Sie die Medusa wie zuvor gezeigt auf einen Vertiefungsträger. Stellen Sie mit dem Mikromanipulator die Spitze der Mikroinjektionsnadel so ein, dass sie knapp über dem Wasser bleibt, indem Sie die Spitze vorsichtig in das Wasser tauchen und sie dann so zurückziehen, dass sie sich nahe an der Epitheloberfläche der Medusa befindet. Pulsieren Sie Luft, indem Sie Start am Injektor drücken.
Wiederholen Sie den Impuls an derselben Stelle zwei- bis viermal, je nach Breite der Spitze. Größere Spitzen erfordern weniger Impulse. Decken Sie das verwundete Tier mit einem Deckglas ab, um große Wunden abzubilden.
Stellen Sie den Fokus auf den x-Regenschirm ein. Hexagonale Zellen sollten klar sein. Identifizieren Sie eine Wunde manuell, um sie abzubilden.
Starten Sie ein Programm, das Bilder als Film in Echtzeit sammelt, oder eines, das in regelmäßigen Abständen eine Reihe von Bildern sammelt. Überwachen Sie den Fortschritt, um sicherzustellen, dass der Wundbereich nicht aus dem Sichtfeld driftet und dass die interessierenden Zellen im Fokus bleiben. Um Farbstoffe und Medikamente zu injizieren, stellen Sie eine Mikroinjektionsnadel her, indem Sie die im Text beschriebenen Schritte befolgen.
Füllen Sie die Mikroinjektionsnadel mit einer langen Pipettenspitze mit einer überschüssigen Menge an Farbstoff oder Medikament zur Injektion in die Medusa. Legen Sie mit einer modifizierten Transferpipette eine Medusa mit dem Unterschirm nach oben in die Polydimethylsiloxan- oder PDMS-Injektionsschale mit gerade so viel ASW, dass das Tier bedeckt ist. Stellen Sie die Schale auf einen Tisch eines Seziermikroskops.
Konzentriere dich auf die Spitze der Mikroinjektionsnadel und schiebe sie in das Wasser in der Nähe der Medusa. Drücken Sie mit dem Mikromanipulator die Nadel in die Schale, bis sie sich biegt und bricht. Erzeugen einer Spitzenöffnung von ca. 10 bis 20 Mikrometern.
Führen Sie mit dem Mikromanipulator die Nadelspitze durch den Schirm in die Mesoglea ein, ohne den X-Schirm zu durchstechen. Stellen Sie am Mikroinjektor den Haltedruck auf Null und den Einspritzdruck unter oder gleich 20 Pfund pro Quadratzoll ein. Injizieren Sie in einen oder zwei Quadranten und füllen Sie jeden mit einem Fleck Farbstoff oder Droge, der etwa ein Viertel der Fläche dieses Quadranten ausmacht.
Je nachdem, welcher Farbstoff oder welches Medikament injiziert wird, werden die Tiere in ein Becherglas mit frischem ASW gegeben, um die Diffusion und Inkubation von Farbstoffen oder Medikamenten zu ermöglichen. Montieren Sie die Medusa für die Bildgebung mit einer modifizierten Transferpipette auf einem Vertiefungsobjektträger und positionieren Sie das Tier mit dem X-Schirm nach oben. Tiere können in diesem Stadium verwundet werden, um die Wirkung eines injizierten Reagenzes zu testen.
Die Mikrowunden innerhalb und zwischen den Zellen bildeten während des Wundverschlusses kleine Lamellipodien. Es folgte eine Kontraktion, und die Wunden heilten in weniger als einer Minute. Die kleinen Epithelwunden heilten auch durch die Bildung von Lamellipodien und die Verlängerung von Lamellipodia-Kontakten.
Einem schnellen und progressiven Wundverschluss ging eine Gewebekontraktion entlang der neu gebildeten Wundnaht voraus. Die normalisierte Heilungsrate von zwei kleinen Wunden, ausgedrückt als Prozentsatz der gesamten Wundfläche über die Zeit, deutete auf eine gewisse Variabilität in der Wundverschlussdynamik hin. Anhand von Daten von 14 verschiedenen Wunden wurde eine durchschnittliche Wundheilungskurve bei unbehandelten Tieren ermittelt.
In einer kleinen Wunde, die durch die Basalmembran geschädigt war, breiteten sich die marginalen Zellen um den geschädigten Bereich herum aus, und der Spalt schloss sich mit einer Kontraktion des Geldbeutelstrangs. Wenn das Gewebe dehydriert oder zu geschädigt war, um es zu reparieren, konnten die Zellbewegungen zum Stillstand kommen oder die gesamte Zellschicht platzen. Große Wunden heilten in mehreren Stadien.
Die Glättung des Randes nach Kontraktionen am Rand, der Bildung von Lamellipodien und der Dehnung von Lamellipodien berührt die kollektive Zellmigration am Rand und mehrere Zellebenen davon entfernt, wodurch große Lücken geschlossen wurden. Die Kern- und Membranfärbung erfolgte durch Mikroinjektion der Reagenzien in die EZM. Die Mikroinjektion von Cytochalasin B hemmte die Bildung von Lamellipodien nach der Verwundung.
Behandeln Sie die Tiere behutsam. Achten Sie bei der Injektion von Reagenzien darauf, dass sich die Spitze der Mikroinjektionsnadel in der Mesoglea befindet und nicht den ganzen Weg durch das Tier gegangen ist. Derzeit werden transgene Tiere mit fluoreszierenden Markierungsproteinen hergestellt, die kombinierte Fluoreszenz- und Differentialkontrastmikroskopie wird ein noch klareres Bild der zellulären Vorgänge in der epithelialen Wundheilung liefern.
