Этот протокол позволяет визуализировать эпителиальные клетки во время заживления ран у живых животных. Это позволяет нам увидеть, как клетки ведут себя в своей естественной сложной среде. Этот метод вводит реагенты во внеклеточный матрикс и цитоплазму клетки для изучения влияния этих реагентов на распространение и миграцию клеток во время заживления ран у живых животных.
Заживление эпителиальных ран и Clytia удивительно напоминает заживление у более сложных животных. Таким образом, мы можем многое узнать из этой системы о механизмах заживления ран и о том, как они возникли. Продемонстрируют эти процедуры Элизабет Ли и техник-исследователь Эмили Уотто.
Чтобы начать процесс ранения, приготовьте модифицированную пипетку для переноса, отрезав кончик пипетки ножницами, создав увеличенное отверстие диаметром от 0,5 до 0,7 сантиметра. Используя модифицированную пипетку для переноса, поместите медузу, собранную из установленных колоний полипов, на предметное стекло с углублением зонтиком медузы X вверх. Убедитесь, что животное покрыто достаточным количеством искусственной морской воды или ASW.
Чтобы создать микрораны внутри и между клетками, поместите покров на животное. Покровное скольжение сжимает мезоглею, и отскок сжатой ткани заставляет клетки слегка раздвигаться. Снимите животное сразу, чтобы наблюдать за созданными микроранками.
Чтобы создать небольшие эпителиальные раны, поместите медузу на углубление зонтиком медузы X вверх, используя модифицированную пипетку для переноса, как показано ранее. Используя наконечник пипетки объемом 200 микролитров, аккуратно поцарапайте поверхность медузы. Легкое царапание может привести к разрывам в базальной мембране.
Накройте животное покровным листом для визуализации. Иногда достаточно разместить покровное стекло, чтобы создать небольшие эпителиальные раны даже без царапин. Подготовьте иглу для микроинъекций, используя микропипетку и стеклянную капиллярную трубку, следуя шагам, описанным в тексте.
Поместите пустую иглу для микроинъекций в держатель для микроинъекций, прикрепленный к микроманипулятору, и отрежьте кончик иглы так, чтобы отверстие составляло приблизительно от 20 до 40 микрон. Установите давление удержания на микроинжекторе на ноль, а давление выброса примерно на 20 фунтов на квадратный дюйм. Настройте микроинжектор на подачу двухсекундного импульса воздуха.
Чтобы создать большие эпителиальные раны, поместите медузу на горку с углублением, как показано ранее. Используя микроманипулятор, отрегулируйте кончик иглы для микроинъекций так, чтобы он оставался чуть выше воды, осторожно опустив наконечник в воду, а затем втянув его так, чтобы он находился близко к эпителиальной поверхности медузы. Нагнетайте воздух, нажимая кнопку «Пуск» на инжекторе.
Повторите пульс в одном и том же месте от двух до четырех раз, в зависимости от ширины наконечника. Большие наконечники требуют меньшего количества импульсов. Накройте раненое животное покровным листом для визуализации больших ран.
Отрегулируйте фокус на зонтик x. Шестиугольные клетки должны быть четкими. Вручную определите рану, чтобы визуализировать ее.
Запустите программу, которая собирает изображения в виде фильма в режиме реального времени, или программу, которая собирает серию изображений через равные промежутки времени. Следите за прогрессом, чтобы убедиться, что область раны не выходит из поля зрения и что интересующие клетки остаются в фокусе. Для инъекций красителей и лекарств сделайте иглу для микроинъекций, следуя шагам, описанным в тексте.
Засыпьте иглу для микроинъекций с помощью длинного наконечника пипетки с избыточным объемом красителя или препарата для инъекции в медузу. Используя модифицированную пипетку для переноса, поместите медузу субзонтиком вверх в форму для инъекций полидиметилсилоксана или PDMS, чтобы ее хватило для покрытия животного. Поместите чашку на столик препарирующего микроскопа.
Сосредоточьтесь на кончике иглы для микроинъекций и опустите ее в воду рядом с медузой. С помощью микроманипулятора вдавливайте иглу в посуду до тех пор, пока она не согнется и не сломается. Создание отверстия для наконечника размером примерно от 10 до 20 микрон.
Используя микроманипулятор, введите кончик иглы через подзонтик в мезоглею, не прокалывая зонтик X. На микроинжекторе установите давление удержания на ноль, а давление впрыска ниже или равно 20 фунтам на квадратный дюйм. Вводят в один или два квадранта, заполняя каждый пятном красителя или лекарства примерно на одну четвертую площади этого квадранта.
В зависимости от того, какой краситель или лекарство вводится, животных помещают в стакан со свежей противолодочной жидкостью, чтобы обеспечить диффузию и инкубацию красителя или лекарства. Для визуализации установите медузу на слайд с углублением с помощью модифицированной пипетки, расположив животное зонтиком X лицом вверх. Животные могут быть ранены на этом этапе, чтобы проверить действие введенного реагента.
Микрораны внутри и между клетками образовали небольшие ламеллиподии во время закрытия раны. За этим последовали схватки, и раны зажили менее чем за минуту. Небольшие эпителиальные раны также заживали за счет образования ламеллиподий и расширения контактов с ламеллиподиями.
Быстрому и прогрессирующему закрытию раны предшествовало сокращение тканей по вновь образованному раневому шву. Нормализованная скорость заживления двух небольших ран, выраженная в процентах от общей площади раны с течением времени, указывает на некоторую вариабельность динамики закрытия раны. Данные из 14 различных ран были использованы для установления средней кривой заживления ран у нелеченных животных.
В небольшой ране, имеющей повреждение базальной мембраны, краевые клетки распространяются вокруг поврежденного участка, и щель закрывается сокращением кисетной нити. Когда ткань была обезвожена или слишком повреждена для восстановления, движение клеток могло прекратиться, или весь лист клеток мог лопнуть. Большие раны заживали в несколько этапов.
Сглаживание края после сокращений на краю, образование ламеллиподий и расширение ламеллиподий контактирует с коллективной миграцией клеток на краю и на расстоянии нескольких клеточных ярусов от края, закрывая большие промежутки. Ядерное и мембранное окрашивание достигалось путем микроинъекции реагентов в ЭВМ. Микроинъекция цитохалазина В ингибировала образование ламеллиподий после ранения.
Обращайтесь с животными аккуратно. При введении реагентов убедитесь, что кончик иглы для микроинъекций находится в мезоглее и не прошел весь путь через животное. В настоящее время трансгенные животные изготавливаются с флуоресцентными белками-метками, комбинированная флуоресценция и дифференциально-интерферирующая контрастная микроскопия дадут еще более четкое представление о клеточных событиях в заживлении эпителиальных ран.
