Questo protocollo consente la visualizzazione delle cellule epiteliali durante la guarigione delle ferite negli animali vivi. Ci permette di vedere come si comportano le cellule nel loro ambiente naturale complesso. Questa tecnica introduce reagenti nella matrice extracellulare e nel citoplasma cellulare per studiare l'effetto di questi reagenti sulla diffusione e la migrazione cellulare durante la guarigione delle ferite negli animali vivi.
La guarigione delle ferite epiteliali e la clizia assomigliano notevolmente alla guarigione in animali più complessi. Pertanto, possiamo imparare molto da questo sistema sui meccanismi di guarigione delle ferite e su come hanno avuto origine. A dimostrare queste procedure saranno Elizabeth Lee e il tecnico di ricerca Emily Watto.
Per iniziare il processo di ferimento, preparare una pipetta di trasferimento modificata tagliando la punta della pipetta con le forbici, creando un'apertura allargata di circa 0,5-0,7 centimetri di diametro. Utilizzando la pipetta di trasferimento modificata, posizionare la medusa raccolta dalle colonie di polipi stabilite su un vetrino di depressione, con l'ombrello medusa X rivolto verso l'alto. Assicurati che abbastanza acqua di mare artificiale, o ASW, copra l'animale.
Per creare micro ferite all'interno e tra le cellule, posizionare una scivolata di copertura sopra l'animale. Lo slip di copertura comprime la mesoglea e il rimbalzo del tessuto compresso costringe le cellule a separarsi leggermente. Immagina immediatamente l'animale per osservare le micro ferite create.
Per creare piccole ferite epiteliali, posizionare la medusa su un vetrino di depressione con l'ombrello medusa X rivolto verso l'alto, utilizzando una pipetta di trasferimento modificata, come dimostrato in precedenza. Utilizzando una punta per pipetta da 200 microlitri, grattare delicatamente la superficie della medusa. Graffi delicati possono creare strappi nella membrana basale.
Coprire l'animale con una copertina per l'imaging. Posizionare il vetrino di copertura a volte è sufficiente per creare piccole ferite epiteliali anche senza graffiare. Preparare un ago per microiniezione, utilizzando un pilastro per micro pipetta e un tubo capillare di vetro, seguendo i passaggi descritti nel testo.
Inserire l'ago vuoto per microiniezione in un supporto per microiniezione fissato a un micromanipolatore e tagliare la punta dell'ago, in modo che l'apertura sia di circa 20-40 micron. Impostare la pressione di mantenimento sul microiniettore a zero e la pressione di espulsione a circa 20 libbre per pollice quadrato. Impostare il microiniettore per erogare un impulso d'aria di due secondi.
Per creare grandi ferite epiteliali, posizionare la medusa su un vetrino di depressione, come dimostrato prima. Utilizzando il micro manipolatore, regolare la punta dell'ago di microiniezione in modo che rimanga appena sopra l'acqua, immergendo accuratamente la punta nell'acqua e quindi ritraendola in modo che sia vicina alla superficie epiteliale della medusa. Pulsare l'aria premendo start sull'iniettore.
Ripeti l'impulso nello stesso punto da due a quattro volte, a seconda della larghezza della punta. Le punte più grandi richiedono meno impulsi. Coprire l'animale ferito con un vetrino di copertura per l'imaging di ferite di grandi dimensioni.
Regolare la messa a fuoco sull'ombrello x. Le celle esagonali dovrebbero essere chiare. Identifica manualmente una ferita per visualizzarla.
Avviare un programma che raccoglie immagini come un filmato in tempo reale o uno che raccoglie una serie di immagini a intervalli regolari. Monitorare i progressi per garantire che l'area della ferita non si allontani dal campo visivo e che le cellule di interesse rimangano a fuoco. Per iniettare coloranti e farmaci, fare un ago per microiniezione seguendo i passaggi descritti nel testo.
Riempire l'ago per microiniezione utilizzando una lunga punta di pipetta con un volume eccessivo di colorante o farmaco iniettabile nella medusa. Utilizzando una pipetta di trasferimento modificata, posizionare una medusa con il sottoombrello rivolto verso l'alto nel polidimetilsilossano, o piatto di iniezione PDMS, con ASW appena sufficiente a coprire l'animale. Posizionare il piatto su un palcoscenico di un microscopio da dissezione.
Concentrarsi sulla punta dell'ago di microiniezione e farla avanzare nell'acqua vicino alla medusa. Con il micro manipolatore, premere l'ago nel piatto fino a quando non si piega e si rompe. Creazione di un'apertura della punta di circa 10-20 micron.
Utilizzando il micro manipolatore, inserire la punta dell'ago attraverso il sub ombrello nella mesoglea senza perforare l'ombrello X. Sul microiniettore, impostare la pressione di mantenimento su zero e la pressione di iniezione inferiore o uguale a 20 libbre per pollice quadrato. Iniettare in uno o due quadranti, riempiendo ciascuno con un punto di colorante o droga circa un quarto dell'area di quel quadrante.
A seconda del colorante o del farmaco che viene iniettato, gli animali vengono posti in un becher di ASW fresco per consentire la diffusione e l'incubazione del colorante o del farmaco. Per l'imaging, montare la medusa su un vetrino di depressione usando una pipetta di trasferimento modificata, posizionando l'animale con l'ombrello X rivolto verso l'alto. Gli animali possono essere feriti in questa fase per testare l'effetto di un reagente iniettato.
Le micro ferite all'interno e tra le cellule formavano piccoli lamellipodi durante la chiusura della ferita. Questo è stato seguito da una contrazione e le ferite sono guarite in meno di un minuto. Le piccole ferite epiteliali guarivano anche attraverso la formazione di lamellipodi e l'estensione dei contatti dei lamellipodi.
La chiusura rapida e progressiva della ferita ha preceduto la contrazione dei tessuti lungo la cucitura della ferita appena formata. Il tasso di guarigione normalizzato di due piccole ferite espresso come percentuale dell'area totale della ferita nel tempo indicava una certa variabilità nella dinamica di chiusura della ferita. I dati di 14 diverse ferite sono stati utilizzati per stabilire una curva media di guarigione delle ferite negli animali non trattati.
In una piccola ferita con danni alla membrana basale, le cellule marginali si diffondono intorno all'area danneggiata e lo spazio si chiude con una contrazione del cordone della borsa. Quando il tessuto era disidratato o troppo danneggiato per essere riparato, i movimenti delle cellule potevano fermarsi o l'intero foglio di cellule poteva scoppiare. Grandi ferite guarite in più fasi.
La levigatura del bordo in seguito alle contrazioni al margine, la formazione di lamellipodi e l'estensione dei contatti lamellipodia La migrazione collettiva delle cellule a distanza e diversi livelli di cellule dal margine ha chiuso grandi lacune. La colorazione nucleare e della membrana è stata ottenuta microiniettando i reagenti nell'ECM. La microiniezione di citocalasina B ha inibito la formazione di lamellipodi dopo la ferita.
Maneggiare gli animali delicatamente. Quando si iniettano i reagenti, assicurarsi che la punta dell'ago di microiniezione sia nella mesoglea e non sia passata attraverso l'animale. Attualmente, gli animali transgenici vengono realizzati con proteine tag fluorescenti, la fluorescenza combinata e la microscopia a contrasto differenziale che interferiscono daranno un'immagine ancora più chiara degli eventi cellulari nella guarigione delle ferite epiteliali.
