Este protocolo permite a visualização de células epiteliais durante a cicatrização de feridas em animais vivos. Ele nos permite ver como as células se comportam em seu ambiente complexo natural. Esta técnica introduz reagentes na matriz extracelular e no citoplasma celular para estudar o efeito desses reagentes na disseminação e migração celular durante a cicatrização de feridas em animais vivos.
A cicatrização de feridas epiteliais e Clytia se assemelha notavelmente à cicatrização em animais mais complexos. Portanto, podemos aprender muito com esse sistema sobre os mecanismos de cicatrização de feridas e como eles se originaram. Quem demonstrará esses procedimentos será Elizabeth Lee e a técnica de pesquisa Emily Watto.
Para iniciar o processo de ferimento, prepare uma pipeta de transferência modificada cortando a ponta da pipeta com tesoura, criando uma abertura ampliada medindo cerca de 0,5 a 0,7 centímetros de diâmetro. Usando a pipeta de transferência modificada, coloque a medusa coletada das colônias de pólipos estabelecidas em uma lâmina de depressão, com o guarda-chuva da medusa X voltado para cima. Certifique-se de que apenas o suficiente de água do mar artificial, ou ASW, cubra o animal.
Para criar micro feridas dentro e entre as células, coloque uma tampa sobre o animal. O deslizamento da cobertura comprime a mesoglea e o rebote do tecido comprimido força as células ligeiramente afastadas. Imagine o animal imediatamente para observar as micro feridas criadas.
Para criar pequenas feridas epiteliais, coloque a medusa em uma lâmina de depressão com o guarda-chuva da medusa X voltado para cima, usando uma pipeta de transferência modificada, como demonstrado anteriormente. Usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros, risque suavemente a superfície da medusa. Coçar suavemente pode criar rasgos na membrana basal.
Cubra o animal com uma tampa para obtenção de imagens. A colocação da tampa às vezes é suficiente para criar pequenas feridas epiteliais, mesmo sem coçar. Prepare uma agulha de microinjeção, utilizando um pilar de micropipeta e um tubo capilar de vidro, seguindo os passos descritos no texto.
Coloque a agulha de microinjeção vazia em um suporte de microinjeção afixado a um micromanipulador e corte a ponta da agulha, de modo que a abertura seja de aproximadamente 20 a 40 mícrons. Ajuste a pressão de retenção no microinjetor para zero e a pressão de ejeção para aproximadamente 20 libras por polegada quadrada. Ajuste o microinjetor para fornecer um pulso de ar de dois segundos.
Para criar grandes feridas epiteliais, coloque a medusa em uma lâmina de depressão, como demonstrado anteriormente. Usando o micromanipulador, ajuste a ponta da agulha de microinjeção para permanecer logo acima da água, mergulhando cuidadosamente a ponta na água e, em seguida, retraindo-a de tal forma que fique próxima à superfície epitelial da medusa. Pulse o ar pressionando start no injetor.
Repita o pulso no mesmo local de duas a quatro vezes, dependendo da largura da ponta. Ponteiras maiores exigem menos pulsos. Cubra o animal ferido com uma lamínula para obter imagens de feridas grandes.
Ajuste o foco para o guarda-chuva x. As células hexagonais devem estar claras. Identifique manualmente uma ferida para imaginá-la.
Inicie um programa que colete imagens como um filme em tempo real, ou um que colete uma série de imagens em intervalos regulares. Monitore o progresso para garantir que a área da ferida não saia do campo de visão e que as células de interesse permaneçam em foco. Para injetar corantes e drogas, faça uma agulha de microinjeção seguindo os passos descritos no texto.
Encha novamente a agulha de microinjeção usando uma ponta de pipeta longa com um volume excessivo de corante ou droga para injeção na medusa. Usando uma pipeta de transferência modificada, coloque uma medusa com o sub-guarda-chuva voltado para cima no prato de injeção de polidimetilsiloxano, ou PDMS, com apenas ASW suficiente para cobrir o animal. Coloque o prato em um estágio de um microscópio dissecante.
Concentre-se na ponta da agulha de microinjeção e avance-a para a água perto da medusa. Com o micromanipulador, pressione a agulha no prato até que ela dobre e quebre. Criando uma abertura de ponta de aproximadamente 10 a 20 mícrons.
Usando o micromanipulador, insira a ponta da agulha através do sub-guarda-chuva na mesoglea sem perfurar o guarda-chuva X. No microinjetor, ajuste a pressão de retenção para zero e a pressão de injeção abaixo ou igual a 20 libras por polegada quadrada. Injetar em um ou dois quadrantes, preenchendo cada um com um ponto de corante ou droga aproximadamente um quarto da área desse quadrante.
Dependendo do corante ou droga que está sendo injetada, os animais são colocados em um copo de ASW fresco para permitir a difusão e incubação de corantes ou drogas. Para obtenção de imagens, monte a medusa em uma lâmina de depressão usando uma pipeta de transferência modificada, posicionando o animal com o guarda-chuva X voltado para cima. Os animais podem ser feridos nesta fase para testar o efeito de um reagente injetado.
As microferidas dentro e entre as células formaram pequenos lamelípodes durante o fechamento da ferida. Seguiu-se contração e as feridas cicatrizaram em menos de um minuto. As pequenas feridas epiteliais também cicatrizaram através da formação de lamelipodídeos e extensão de contatos de lamelípodos.
O fechamento rápido e progressivo da ferida precedeu a contração tecidual ao longo da costura da ferida recém-formada. A taxa de cicatrização normalizada de duas pequenas feridas, expressa como a porcentagem da área total da ferida ao longo do tempo, indicou alguma variabilidade na dinâmica de fechamento da ferida. Dados de 14 feridas diferentes foram utilizados para estabelecer uma curva média de cicatrização nos animais não tratados.
Em uma pequena ferida com dano da membrana basal, as células marginais se espalham ao redor da área danificada, e a lacuna se fecha com uma contração de corda em bolsa. Quando o tecido estava desidratado ou muito danificado para reparar, os movimentos celulares podiam parar, ou toda a folha de células poderia estourar. Grandes feridas cicatrizadas em vários estágios.
A suavização da borda após contrações na margem, a formação de lamelipodos e a extensão dos lamelípodes contatam a migração celular coletiva e várias camadas de células para longe da margem fecharam grandes lacunas. As colorações nuclear e de membrana foram obtidas por microinjeção dos reagentes na MEC. A microinjeção de citocalasina B inibiu a formação de lamelipodos pós-ferimento.
Manuseie os animais com delicadeza. Ao injetar reagentes, certifique-se de que a ponta da agulha de microinjeção esteja na mesoglea e não tenha percorrido todo o caminho através do animal. Atualmente, animais transgênicos estão sendo confeccionados com proteínas fluorescentes tag, fluorescência combinada e microscopia diferencial interferente de contraste dará uma imagem ainda mais clara dos eventos celulares na cicatrização de feridas epiteliais.
