وأيد هذا العمل من قبل معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (RB3-02266) والمعاهد الوطنية للصحة (DK54441).

تلاحظ قبل بدء: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم الحصول على بنكرياسات الجنين البشري من العيوب الخلقية مختبر أبحاث، جامعة واشنطن (سياتل، واشنطن، الولايات المتحدة الأمريكية) الذين حصدوا الأنسجة. تم الحصول على الموافقة المستنيرة للتبرع الأنسجة، والتخزين، واستخدام عينات من الجهات المانحة من قبل المركز. وقدم البيان موافقة البروتوكول في الكتابة وجامعة كاليفورنيا، سان دييغو وافق برنامج حماية البحوث الإنسانية دراسة كاملة (بروتوكول 081237XT #). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فمن الضروري للحفاظ على كل من البنكرياس الجنين البشري والحاوية عقد البنكرياس على الجليد خلال الإجراء بأكمله. يجب أن يتم تنفيذ التفكك والهضم في أسرع وقت ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرسال العيادة حيث تم الحصول على البنكرياس الجنين البشري من المخزن المؤقت لتخزين ونقل البنكرياس. (RPMI-1640 + 10٪ مصل الإنسان العادي (NHS)، 300 ملي طرهالوز سان جرمان، البنسلين / الستربتوميسين، وfungizone). </li></ol>1. تشريح الجنين بنكرياس الإنسان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 ملغ من حل RT كولاجيناز الحادي عشر في HBSS لإعطاء تركيز النهائي من 2.5 ملغ / مل. تصفية تعقيم الحل مع فلتر حقنة 0.22 ميكرون إلى العقيمة (تعقيمها) قارورة التلألؤ وتخزينها في 4 درجات مئوية. في نسيج الثقافة هود، المبينة 2 أطباق بتري معقمة، بوتقة صغيرة معقمة (إذا بوتقة غير متوفر، قد تكون بديلا كوب صغير)، مقص تعقيمها، وملقط. إضافة 2 مل HBSS إلى واحدة طبق بتري لغسل البنكرياس. السائل نضح من الأنبوب الذي يحتوي على البنكرياس الجنين، وترك حوالي 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة البنكرياس مع ملقط في طبق بتري 60 ملم دون HBSS. لهذه التجارب، يتم إنشاء ICCS الجنين من بنكرياسات جديدة مع الأعمار الحمل تتراوح 9-23 أسابيع. بمعزل عن بنكرياسات في سن gestionational في وقت سابق من الصعب نظرا لحجم البنكرياس. البروتوكول ينطبق المرجح أن تتجاوز الأعمار الحمل 23 أسبوعا، ولكن اكتساب عancreata بعد هذا الوقت صعب بسبب الفيدرالية (الولايات المتحدة) القيود. في بعض الأحيان، البنكرياس الجنين مع وصول الطحال، والدهون، أو الأنسجة الضامة المرفق من تشريح الأصلي. النسيج اضافية مرئيا بسهولة بالعين المجردة، وينبغي إزالتها من البنكرياس قبل البدء في البروتوكول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف البنكرياس في حجم الحد الأدنى من HBSS الباردة (~ 0.5 مل) في طبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البنكرياس تنظيفها إلى بوتقة صغيرة معقمة باستخدام ملقط معقم ووضعه في دلو الجليد. وضع في بوتقة حامل ل50 مل أنبوب الطرد المركزي و، وذلك باستخدام 2 أزواج من مقص، شريحة بقوة البنكرياس لعدة دقائق. (عادة 2-5 دقيقة، ولكن والوقت يعتمد على حجم ومتانة النسيج). تقنية القطع هو المهم. عقد جانب واحد من مقص في موقف ثابت تتحرك فقط مقابض المعاكس. يجب على نصائح من مقص راحة على الجزء السفلي من بوتقة. تواصل مع الحركة السريعة مقص لكسر في البنكرياس الصغيرةقطعة. أصغر قطعة من النسيج، وأفضل كولاجيناز ستعمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.5 مل من HBSS + البنكرياس المفروم حتى القارورة التي تحتوي على كولاجيناز والمكان في مجموعة شاكر حمام المياه إلى 37 درجة مئوية في 200 دورة في الدقيقة لمدة تصل إلى 10 دقيقة. لا تحقق بشكل متكرر أكثر من مرة واحدة خلال أول 5 دقائق. الوقت الهضم يعتمد على نوعية الأنسجة، قد يكون اقل من 6 دقائق كافية. نقطة النهاية هو عندما جزيئات صغيرة وموحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء قارورة (10-15 مل) مع HBSS الباردة لوقف النشاط كولاجيناز. وضع على الجليد والسماح للكتل لتسوية لمدة 10 دقيقة. في كثير من الأحيان في هذه المرحلة، وقد وقعت بعض موت الخلايا ويتم تحريرها الحمض النووي في وسائل الإعلام. هذا يمكن أن يجعل وسائل الإعلام &quot;مفتول العضلات&quot;؛ في هذه الحالة، إضافة 100 ميكرولتر الدناز (10 ملغ / مل الأسهم) إلى الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن استقر الأنسجة في قارورة التلألؤ لمدة 10 دقيقة، نضح قبالة الطبقة العليا تركها أقل قليلا من نصف كامل (7-8 مل). نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل، إضافة 5 مل HBSS. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح HBSS و resuspend الخلايا في 5 مل تحتوي على وسائل الاعلام RPMI-1640، glutamax، و 10٪ مصل الإنسان العادي (NHS)، 10 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.2، البنسلين / الستربتوميسين، وfungizone. لوحة على 60 مم طبق بتري. للباحثين في محاولة لتوليد خلايا β، إضافة HGF (10 نانوغرام / مل النهائي) إلى وسائل الإعلام. بالإضافة إلى ذلك، تظاهر عدد من المجموعات التي المكمل وسائل الإعلام والثقافة مع هرمون GLP-1 incretin يزيد أيضا خلايا β 28. ينبغي أن تترك الخلايا في التعليق لمدة 72 ساعة لتجميع وتشكيل ICCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 72 ساعة في التعليق، والخلايا يمكن مطلي على مصفوفة من خط الخلية البشرية HTB9 المصفوفة كما هو موضح سابقا 29. بغض النظر عن ظروف النمو، وسائل الإعلام يجب أن يتم تغيير كل 48 ساعة. </li></ol> 2. المناعي للعلامات من الغدد الصماء انتشار الخليوي ونضوج في ICCS يزرع في التعليق، أحادي الطبقة، أو على coverslips الزجاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس تكاثر الخلايا، يتم تنفيذ وضع العلامات BrdU إما الخلايا الملتصقة أو خلايا في تعليق لمدة 12 ساعة قبل PFA التثبيت. يتم تخفيف BrdU كاشف 1:100 وتصفية تعقيمها في RPMI-1640، glutamax، 10٪ NHS، 10 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.0، البنسلين / الستربتوميسين، وfungizone. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للخلايا في التعليق: الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 x ج ونضح مستنبت. إضافة 10 مل PBS لغسل ICCS، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 x ج ونضح. إذا كان ICCS ستكون جزءا لا يتجزأ من البارافين، يرجى اتباع البروتوكول الاختياري ل3،1-3،17 الخلايا الملتصقة: إزالة مستنبت وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح أعلاه. إصلاح الخلايا لمدة 20 دقيقة مع PFA 4٪ على RT، ثم يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني. عند هذه النقطة، لوحات يمكن أن تكون ملفوفة مع parafilm وتخزينها في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا مع 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وتطبيق حظر مؤقت (2٪ تفعلn والمصل، 2٪ ألبومين المصل البقري، و 50 ملي جليكاين المخفف في برنامج تلفزيوني) لمدة 1 ساعة. غسل الخلايا مع العازلة العامل (حظر مؤقت المخفف 1:10). تمييع الضد العازلة في العمل. للخلايا المزروعة في coverslips الزجاج، ويخفف من الأجسام المضادة في 60 ميكرولتر اجمالى حجم. للخلايا في طبق 6 جيدا، وتمييع الضد في الحجم الكلي 600 ميكرولتر. وصمة عار الحواتم متعددة، مزيج من الأجسام المضادة يمكن تطبيقها. كعنصر تحكم، استخدم مفتش أو المصل المناعي قبل بدلا من الأجسام المضادة المحددة. يجب حضنت العينات التحكم مع التحكم مفتش من نفس الأنواع من الأجسام المضادة الأولية المستخدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأجسام المضادة الأولية إما 1.5 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجة مئوية. نضح الأجسام المضادة الأولية وغسل 3X مع العازلة العامل في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الضد الثانوية في 1:200 لرودامين وFITC الأجسام المضادة مترافق، 1:500 - 1:1،000 عن الأجسام المضادة مترافق اليكسا. من المهم أن نلاحظ أن جميع الأجسام المضادة الثانوية خفيفة حساسة. تغطية العيناتفي رقائق الألومنيوم لمنع فقدان الإشارة. احتضان لمدة 1 ساعة على RT. اختياري: لتصور نوى، دابي ويمكن أن يضاف في 1:500 خلال الحضانة الثانوية. وهذا مفيد لتحديد الكميات من البروتين التعبير في مجموع السكان الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الضد الثانوية وغسل 3X مع العازلة العامل في RT. للخلايا المزروعة في ساترة، ورفع بلطف ساترة مع ملقط بينما مغمورة في المخزن المؤقت؛ غسله بواسطة تخبط في برنامج تلفزيوني. للخلايا تزرع في لوحة 6 جيدا، إضافة PBS لغسل ونضح. عند هذه النقطة انهم مستعدون لدراسة تحت مجهر مقلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلمس حافة ساترة بلطف على Kimwipe للتخلص من برنامج تلفزيوني الزائدة. إضافة قطرة من تصاعد الجل على شريحة زجاجية وعكس ساترة على الشريحة. إزالة الزائدة هلام التركيب بواسطة الشفط. اضغط على ساترة بلطف مع الجزء الخلفي من غيض 200 ميكرولتر الماصة لإزالة الفقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجاف في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة أو O / N عند 4 ° C ودراسة تحت فلوريداuorescent أو المجهر متحد البؤر. </li></ol> 3. (اختياري) مناعي تلطيخ من البروتينات من البارافين جزءا لا يتجزأ من ICCS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل الاغاروز 3٪ والسماح لتبرد إلى 55-60 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ICCS المحتضنة في التعليق إلى أنبوب مخروطي 15 مل، وأجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وسائل الإعلام من الخلايا وإصلاح مع 500 ميكرولتر PFA 4٪ لمدة 10 دقيقة في RT. لا تخلط بيليه، إلا إذا كان بيليه هو كبير جدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل بيليه مرتين مع 750 ميكرولتر PBS. مثل PFA 4٪، وتعتبر هذه النفايات الخطرة ويجب التخلص من المواصفات وفقا لمؤسستكم النفايات الخطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نفض الغبار بلطف بيليه الخلية لتخفيف وإضافة 150-200 ميكرولتر من الاغاروز أسفل جدار أنبوب 15 مل المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج من قبل عبها بلطف الأنبوب، ولكن لا تشكل الفقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح ليصلب في 4 درجات مئوية لمدة 5-10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام إبرة 21 G لطردبيليه ومكان في أنبوب 15 مل المخروطية الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أن يتم تضمين البارافين وإعداد المقاطع على الشرائح في الموقع باستخدام مشراح أو عن طريق الفحص المجهري مرافق الأساسية الخاصة بك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deparaffinize الأنسجة، وهيدرات، ويغسل بالماء بسرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.2 M جليكاين لمدة 30 دقيقة في RT لإرواء ألدهيد المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشريحة مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاسترجاع مستضد، وجلب 10 ملي السيترات العازلة (درجة الحموضة 6.0) لتغلي على طبق ساخن. تزج الشرائح في المخزن المؤقت، انتظر حتى أعود ليغلي، والانتظار لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كوب من موقد. انتظر حوالي 40 دقيقة للالشرائح لتبرد في المخزن المؤقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح مرتين مع H 2 O لمدة 5 دقائق لكل منهما، غسل الشرائح مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما، منع مع 2٪ مصل حمار عادي في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الأجسام المضادة الأولية المخففة التركيز الصحيح في مخزن العامل تحتوي على 0.2٪ تريتون X-100.عموما، وحضنت الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها إذا تلطيخ لعوامل النسخ وعن 1.5 ساعة إذا تلطيخ للهرمونات، وعلامات الانتشار، و / أو التمايز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الخطوات من 2،3-2،9 المذكورة أعلاه. </li></ol>

<ol>
	<li>Tuch, B. E., Ng, A. B. P., Jones, A., Turtle, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+differentiation+of+human+fetal+pancreatic+explants+transplanted+into+nude+mice.">Histologic differentiation of human fetal pancreatic explants transplanted into nude mice.</a> Diabetes. 33, 1180-1187 (1984).</li><li>Tuch, B. E., Grigoriou, S., Turtle, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+hormonal+content+of+human+fetal+pancreas+passaged+in+athymic+mice.">Growth and hormonal content of human fetal pancreas passaged in athymic mice.</a> Diabetes. 35, 464-469 (1986).</li><li>Hullett, D. A., Falany, J. L., Love, R. B., Butler, J. A., Sollinger, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fetal+pancreas:+Potential+for+transplantation.">Human fetal pancreas: Potential for transplantation.</a> Transplantation Proceedings. XIX (1), 909-910 (1987).</li><li>Hullett, D. A., Bethke, K. P., Landry, A. S., Leonard, D. K., Sollinger, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+long-term+cryopreservation+and+transplantation+of+human+fetal+pancreas.">Successful long-term cryopreservation and transplantation of human fetal pancreas.</a> Diabetes. 38, 448-453 (1989).</li><li>Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+by+human+fetal+pancreas.">Reversal of diabetes by human fetal pancreas.</a> Transplantation. 51, 557-562 (1991).</li><li>Beattie, G. M., Lopez, A. D., Otonkoski, T., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+fetal+pancreas:+fresh+vs.+cultured+fetal+islets+or+ICCS.">Transplantation of human fetal pancreas: fresh vs. cultured fetal islets or ICCS.</a> J Mol Med. 77, 70-73 (1999).</li><li>Joglekar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-30+family+microRNAs+confer+epithelial+phenotype+to+human+pancreatic+cells.">The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells.</a> Islets. 1, 137-147 (2009).</li><li>Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Joglekar, S. V., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fetal+pancreatic+insulin-producing+cells+proliferate+in+vitro.">Human fetal pancreatic insulin-producing cells proliferate in vitro.</a> J Endocrinol. 201, 27-36 (2009).</li><li>Kayali, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SDF-1alpha/CXCR4+Axis+is+Required+for+Proliferation+and+Maturation+of+Human+Fetal+Pancreatic+Endocrine+Progenitor+Cells.">The SDF-1alpha/CXCR4 Axis is Required for Proliferation and Maturation of Human Fetal Pancreatic Endocrine Progenitor Cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Otonkoski, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+has+insulinotropic+activity+in+human+fetal+pancreatic+cells.">Hepatocyte growth factor/scatter factor has insulinotropic activity in human fetal pancreatic cells.</a> Diabetes. 43, 947-953 (1994).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 24, 1392-1401 (2006).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoderm+and+pancreatic+islet+lineage+differentiation+from+human+embryonic+stem+cells.">Endoderm and pancreatic islet lineage differentiation from human embryonic stem cells.</a> Cloning Stem Cells. 8, 96-107 (2006).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+insulin-producing+islet-like+clusters+from+human+embryonic+stem+cells.">Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25, 1940-1953 (2007).</li><li>Shim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+towards+a+pancreatic+cell+fate.">Directed differentiation of human embryonic stem cells towards a pancreatic cell fate.</a> Diabetologia. 50, 1228-1238 (2007).</li><li>Kroon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+endoderm+derived+from+human+embryonic+stem+cells+generates+glucose-responsive+insulin-secreting+cells+in+vivo.">Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo.</a> Nat Biotechnol. 26, 443-452 (2008).</li><li>Van Hoof, D., D'Amour, K. A., German, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+insulin-producing+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).</li><li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scalable+system+for+production+of+functional+pancreatic+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells.">A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Lees, J. G., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+pancreatic+beta-cell+surrogates+guided+by+ontogeny.">Conversion of embryonic stem cells into pancreatic beta-cell surrogates guided by ontogeny.</a> Regen Med. 1, 327-336 (2006).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice.">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61, 2016-2029 (2012).</li><li>Bai, L., Meredith, G., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon-like+peptide-1+enhances+production+of+insulin+in+insulin-producing+cells+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Glucagon-like peptide-1 enhances production of insulin in insulin-producing cells derived from mouse embryonic stem cells.</a> J Endocrinol. 186, 343-352 (2005).</li><li>Semb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+endoderm:+a+key+step+in+coaxing+human+embryonic+stem+cells+into+transplantable+beta-cells.">Definitive endoderm: a key step in coaxing human embryonic stem cells into transplantable beta-cells.</a> Biochem Soc Trans. 36, 272-275 (2008).</li><li>Van Hoof, D., Mendelsohn, A. D., Seerke, R., Desai, T. A., German, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+pancreatic+endoderm+in+patterned+size-controlled+clusters.">Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endoderm in patterned size-controlled clusters.</a> Stem Cell Res. 6, 276-285 (2011).</li><li>Beattie, G. M., Otonkoski, T., Lopez, A. D., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+and+function+of+human+fetal+pancreatic+cells+after+cryopreservation.">Maturation and function of human fetal pancreatic cells after cryopreservation.</a> Transplantation. 56, 1340-1343 (1993).</li><li>Sandler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+of+human+fetal+pancreas.+Effects+of+nicotinamide+on+insulin+production+and+formation+of+isletlike+cell+clusters.">Tissue culture of human fetal pancreas. Effects of nicotinamide on insulin production and formation of isletlike cell clusters.</a> Diabetes. 38 Suppl 1, 168-171 (1989).</li><li>Otonkoski, T., Beattie, G. M., Cirulli, V., Mally, M. I., Hayek, A., Sharvetnick, N., Landes, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pancreatic regeneration. , (1997).</li><li>Otonkoski, T., Beattie, G. M., Mally, M. I., Ricordi, C., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+is+a+potent+inducer+of+endocrine+differentiation+in+cultured+human+fetal+pancreatic+cells.">Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells.</a> J Clin Invest. 92, 1459-1466 (1993).</li><li>Xie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+chromatin+remodeling+mediated+by+polycomb+proteins+orchestrates+pancreatic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Dynamic chromatin remodeling mediated by polycomb proteins orchestrates pancreatic differentiation of human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 224-237 (2013).</li><li>Hardikar, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+maturation+of+fetal+porcine+beta-cells+by+glucagon-like+peptide+1+and+cholecystokinin.">Functional maturation of fetal porcine beta-cells by glucagon-like peptide 1 and cholecystokinin.</a> Endocrinology. 143, 3505-3514 (2002).</li><li>Beattie, G. M., Cirulli, V., Lopez, A. D., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+of+human+pancreatic+endocrine+cells.">Ex vivo expansion of human pancreatic endocrine cells.</a> J Clin Endocrinol Metab. 82, 1852-1856 (1997).</li><li>Beattie, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose:+a+cryoprotectant+that+enhances+recovery+and+preserves+function+of+human+pancreatic+islets+after+long-term+storage.">Trehalose: a cryoprotectant that enhances recovery and preserves function of human pancreatic islets after long-term storage.</a> Diabetes. 46, 519-523 (1997).</li><li>Hayek, A., Beattie, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+transplantation+of+human+fetal+and+adult+pancreatic+islets.">Experimental transplantation of human fetal and adult pancreatic islets.</a> J Clin Endocrinol Metab. 82, 2471-2475 (1997).</li><li>Otonkoski, T., Beattie, G. M., Lopez, A. D., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+to+increase+transplantable+human+fetal+islet+cell+mass.+Transplant.">Use of hepatocyte growth factor/scatter factor to increase transplantable human fetal islet cell mass. Transplant.</a> Proc. 26, 33-34 (1994).</li><li>Beattie, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+increase+human+islet+cell+mass+while+preserving+beta-cell+function.">A novel approach to increase human islet cell mass while preserving beta-cell function.</a> Diabetes. 51, 3435-3439 (2002).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

الأساليب المعروضة هنا تمكن واحد لتوليد ICCS من البنكرياس الجنين البشري، وبعد ذلك صورة لعلامات من تكاثر الخلايا والأديم الباطن البنكرياس. عملية البنكرياس الجنين البشري تفارق المطلوبة حوالي 90 دقيقة، تليها فترة تشكيل المحكمة الجنائية الدولية 72 ساعة، وهو نهج يختلف كثيرا عن البروتوكولات لعزل الخلايا الاصلية الخلايا β من الماوس. بروتوكول المعروضة هنا يوفر طريقة استنساخه التي تسمح للباحث لاستكشاف التنمية البنكرياس الجنين البشري. نوعين مختلفين من الدراسات الطولية يمكن أن يؤديها. أولا، القدرة على توليد أنواع وظيفية البنكرياس خلية (خلايا الأقنية، الخلايا الإفرازية وخلايا إيجابية هرمون) من مختلف الأعمار الحمل يمكن تقييمها بعد الزرع. الثانية، ICCS من العمر الحملي واحد يمكن زراعتها في الثقافة، وتعامل مع وكلاء الدوائية المختارة والمزروعة في نقاط زمنية مختلفة خلال ثقافة المحكمة الجنائية الدولية لاستكشاف الاختلافاتفي مصير الخلية. مع الجهود الهائلة التي توجه حاليا في HESC التمايز إلى خلايا انتاج الانسولين، ومرة ​​أخرى يجري إحياؤها المشاكل المرتبطة إفراز الأنسولين استجابة للمؤثرات الفسيولوجية. توفير ICCS الإنسان نظام نموذجا فريدا لدراسة هذا الجانب الهام من البنكرياس الجنين تكاثر الخلايا ونمو الخلايا β. كما هو الحال مع أي بروتوكول لعزل الخلايا من الأنسجة، والتفاصيل هي الحاسمة للنجاح. وهناك عدد من المعلمات للأسف خارج سيطرة العاملين في المختبرات أداء التجربة. اثنين من المشاكل التي واجهت هذا المختبر تشمل رداءة نوعية المواد الانطلاق والتسليم من الأنسجة غير البنكرياس. نسيج البنكرياس الجنين صحية ثابتة لخفض مقص. إذا كانت التخفيضات الأنسجة بسهولة جدا، بل هو علامة على أن أنزيمات البنكرياس قد بدأت لهضم البنكرياس نفسها. من هذا هناك للأسف هناك انتعاش وأفضل إلغاء الإعداد. نادرا، وهو فيسوف فني من ذوي الخبرة إزالة البنكرياس الخلط بين أقسام القناة الهضمية للالبنكرياس. وهذه العينات لديها مرونة أكثر من ذلك بكثير من البنكرياس وسوف التجويف ملحوظ تكون موجودة. مرة أخرى، يجب التخلص من هذه العينات. عند اتباع البروتوكول كما هو موضح أعلاه، هناك نادرا أي القضايا التي تنشأ لرمي العزلة عن مسارها. وتشمل بضع نقاط لنتذكر لضمان عزلة على نحو سلس، لاستخدام مقص حاد لقطع البنكرياس دقيقة وللتأكد من عدم ترك أي عينة الأنسجة كبيرة جدا لهضم. إذا التخفيضات ليست صغيرة بما فيه الكفاية، ثم كولاجيناز لا يعمل على نحو فعال، وتتشكل القليلة ICCS. على العكس من ذلك، عند استخدام دفعة جديدة من كولاجيناز، وتبدأ مع مستوى مماثل إذا وحدة دولية (وحدة دولية) لعملية الهضم كما تستخدم في السابق. ومع ذلك، خفض فترة حضانة لضمان أن ما يزيد على الهضم لا يحدث. هذه التقنية استكشاف الأخطاء وإصلاحها يضمن أن تسمية وحدة دولية لا تختلف اختلافا كبيرا من دفعة لدرجة البكالوريوسطشه. التي اتخذت في المنظور، هذه التقنية لعزل ICCS الجنين البشري هو المعيار نسبيا في هذا المجال. وأكد معظم المختبرات النتائج التي توصلنا إليها أن إضافة HGF إلى وسائل الإعلام يساعد الخلايا على البقاء والتكاثر 33. باختصار، قمنا بتطوير طريقة لعزل ICCS الجنين البشري بنكرياسات جديدة مع الأعمار الحمل تتراوح 9-23 أسابيع. يمكن زراعتها الخلايا كما أحادي الطبقة أو في تعليق للتجارب لتصور عوامل النسخ الغدد الصماء في البنكرياس والأنسولين البشري.

ومن القيود الأساسية للأنسولين علاجات استبدال خلية القاعدة في مرض السكري نوع 1 هو ندرة الجزر البشرية المتاحة للزرع. القدرة على تنظيم انتشار وتمايز الخلايا السلائف البنكرياس الإنسان إلى خلايا منتجة للأنسولين التي تلبي متطلبات التمثيل الغذائي للدولة على الأنسولين ناقصة لا يزال لبنة حاسمة لعلاج خلية مقرها لعلاج داء السكري من النوع 1. حتى كان ينظر ظهور الخلايا المنتجة للانسولين HESC مشتقة، خلايا الغدد الصماء في البنكرياس الجنين البشري أو سلائفها كمصادر محتملة من الخلايا للزرع السريرية. على الرغم من أن المشهد العلمية والتنظيمية قد تغيرت في السنوات القليلة الماضية، لا تزال هناك حاجة حيوية لفهم كيفية تطور البنكرياس الجنين البشري. العديد من الآن عرض الاستخدام العلاجي للخلايا الجنينية البشرية من غير المحتمل، ولكن إذا تم إنشاء طرق فعالة وآمنة لتوسيع الخلايا، واستخدام العلاجية لهذه الخلايا يمكن AGعين يكتشفها. وهناك عقبة رئيسية ما تبقى هو أن التحول في المختبر من خلايا البنكرياس الإنسان الجنين المجاميع (ICCS) إلى جلوكوز استجابة، الأنسولين إفراز خلايا الغدد الصماء في الوقت الراهن عملية غير فعالة. على الرغم من أن هناك الكثير من العمل على مدى 30 عاما تقريبا وقد أوضحت وحددت الشخصى التعبير عن عوامل النسخ المطلوبة لتطوير البنكرياس الصماء، لا تزال هناك ثغرات في معرفتنا حول كيفية تنظيم التعبير الزماني للعوامل النسخ وتتعلق وظيفة الخلية. حتى كان ينظر ظهور الخلايا المنتجة للانسولين HESC مشتقة، خلايا الغدد الصماء في البنكرياس الجنين البشري أو سلائفها كمصادر محتملة من الخلايا للزرع السريرية. على الرغم من أن المشهد العلمية والتنظيمية قد تغيرت في السنوات القليلة الماضية، لا تزال هناك حاجة حيوية لفهم كيفية تطور البنكرياس الجنين البشري. العديد من الآن عرض الاستخدام العلاجي للخلايا الجنينية البشرية من غير المحتمل، ولكن إذا فعالةوطرق آمنة لتوسيع أنشئت الخلايا، يمكن مرة أخرى أن تستكشف استخدام العلاجي من هذه الخلايا. وهناك عقبة رئيسية ما تبقى هو أن التحول في المختبر من خلايا البنكرياس الإنسان الجنين المجاميع (ICCS) إلى جلوكوز استجابة، الأنسولين إفراز خلايا الغدد الصماء في الوقت الراهن عملية غير فعالة. على الرغم من أن هناك الكثير من العمل على مدى 30 عاما تقريبا وقد أوضحت وحددت الشخصى التعبير عن عوامل النسخ المطلوبة لتطوير البنكرياس الصماء، لا تزال هناك ثغرات في معرفتنا حول كيفية تنظيم التعبير الزماني للعوامل النسخ وتتعلق وظيفة الخلية. في الآونة الأخيرة، في مجال الخلايا الجذعية استخدمت المعارف المتراكمة حول الزمانية عامل النسخ التعبير خلال تطوير جزيرة لدفع إنتاج الخلايا التي تعبر عن علامات من خلايا الغدد الصماء ناضجة. على الرغم من أن نشأة الخلايا المنتجة للانسولين من HESC والخلايا المحفزة (التوجيهية) جعلت كبيرة وتقدما كبيرا في السنوات القليلة الماضية، والبروتوكولات الأكثر فعالية تتطلب متميزتين مراحل تمايز: 1) والتمايز في وقت مبكر في المختبر لتوليد الخلايا معربا عن العوامل السلائف النسخ البنكرياس، تليها 2) في الجسم الحي النضج بعد زرع - وهو ما يسمى ب &quot;الصندوق الأسود &quot;الفترة. للمضي قدما، والتقدم في فهم بيولوجيا الكامنة نضوج جزيرة في الجسم الحي، بغض النظر عن مصدر الخلية، ويجب أن يفهم على مستوى البيوكيميائية. التشابه بين النتائج التي تم الحصول عليها مع ICCS وHESC تشير إلى أن عددا من العمليات الكيميائية الحيوية الحرجة التي تنظم عملية انتقال الخلايا السلائف البنكرياس الإنسان في، والأنسولين إفراز الخلايا تستجيب الجلوكوز ناضجة في المختبر لا تزال مجهولة. وهناك جزء أساسي من هذا الفهم أن يكون لتطوير منهجيات جديدة لاشتقاق السكان الخلية الغدد الصماء وظيفية من الخلايا الاصلية البنكرياس وسوف HESC تتطلب ليس فقط APPR البيوكيميائيةoaches أن إلقاء الضوء على الأحداث النضج، ولكن أساليب لتحليل التغييرات. لماذا نعتقد أن التصوير خلايا البنكرياس الجنين البشري هو أحد الجوانب الحاسمة لتحديد التغيرات في جزيرة النضج؟ الجواب يكمن جزئيا في السعي التاريخية لتوليد الخلايا المنتجة للأنسولين. وقد سمحت كل من نموذج وأنظمة الأنسجة الثقافة لالسلائف البنكرياس والجزر الباحثين لاستكشاف الاختلافات الكبيرة الموجودة بين النضج من الجزر والجزر الصغيرة الحيوانية البشرية في المختبر. وجود قيود لاستكشاف التنمية البنكرياس الجنين البشري هو أن الأعمار الحمل التي يمكن استخدامها قانونيا تعطي فقط لارتفاع المجاميع الخلية غير المتجانسة. على الرغم من أن الخلايا البشرية الجنين معزولة تشبه الجزر، وتلطيخ بعد الثقافة في المختبر من سن 9-23 أسابيع الحمل يكشف أقل من 15٪ تحتوي على علامات لخلايا الغدد الصماء، مع معظم الخلايا لا تلطيخ للهرمونات جزيرة. ومع ذلك، بعد زرع وفيفو النضج، فإن أغلبية كبيرة من الخلايا التعبير عن علامات الغدد الصماء 6،25. ويجري ردد النتائج من هذه الدراسات اليوم مع بروتوكولات HESC التمايز التي هي قادرة على توليد السكان متواضعة من هرمون واحد خلايا الغدد الصماء إيجابية إلا بعد التمايز في المختبر. في المختبر طرق لتعزيز السكان من هرمون إيجابية الخلايا ومن المرجح أن توفر نظرة ثاقبة في الجسم الحي جزيرة النضج. علاوة على ذلك، فهم الأحداث الجزيئية التي تدفع التنمية البنكرياس الجنين البشري من المرجح أن تحسين الجهود لاستخلاص خلايا انتاج الانسولين من HESC ومزيد ترسيم الآليات التي تنظم تجديد الخلايا β وtransdifferentiation خلية البنكرياس. أوجه التشابه بين الإنسان خلية البنكرياس الجنين وHESC النضج يمكن أن تمتد إلى وظيفة الخلية. مثل خلايا الفئران، سواء الخلايا الجنينية البشرية وHESC متباينة غير قادر على إفراز الأنسولين استجابة إلى جلوكوزبعد neoformation جزيرة في المختبر 26،27. ومع ذلك، عند زرع في الفئران عارية والنضج، سواء مجموعات مثل جزيرة البشرية والخلايا المنتجة للأنسولين المستمدة من HESC المعرض النمط الظاهري الغدد الصماء. بعد ثلاثة أشهر التطعيم، ما يقرب من 90٪ من الخلايا التي تم زرعها من السكان هم من الأنسولين إما إيجابية، وتعمل بشكل طبيعي على النحو الذي يحدده إطلاق سراح C-الببتيد 17،26. هذه النتائج تشير إلى أن زرع مجهولون توفر السياق والعظة التي تعزز جزيرة النضج. بروتوكولات التصوير الأمثل، مثل واحد هو موضح هنا، لخلايا البنكرياس الجنين الإنسان سوف تساعد في البحث لتحديد العوامل التي تعدل وتسريع النضج. استكشاف البيوكيميائية الأساسية للخلايا البنكرياس الجنين البشري وHESC متباينة نحو النسب الغدد الصماء في هذه المرحلة من التنمية أمر أساسي لقياس كفاءة النضج. بروتوكول التالية، الواردة في الارقام ..ه 1، ويوفر أسلوبنا الحالي لعزل خلايا البنكرياس الجنين البشري، ودعا ICCS من البنكرياس كله الجنين البشري والتصوير من هذه الخلايا. هذا البروتوكول يتطلب الإعداد الأولي من الخلايا من الأنسجة، والتي يمكن زراعتها في وقت لاحق كما أحادي الطبقة أو في التعليق. يوصف إعداد الخلايا لتصوير علامات تستخدم عادة من الغدد الصماء تكاثر الخلايا والنضج. جيل والتصوير من ICCS في غياب أو وجود مجموعة متنوعة من العوامل الكيميائية تعديل يوفر طريقة سريعة، مقارنة مع نماذج زرع، للمساعدة في تحديد الشروط الثقافة والمركبات التي تسريع نضوج خلايا البنكرياس الجنين البشري في إفرازات تعمل بكامل طاقتها، الأقنية، أو هرمون إنتاج خلايا البنكرياس.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1000">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:349px;">Trehalose SG</td>
			<td style="width:219px;">Hayashibara</td>
			<td style="width:115px;">Trehalose SG</td>
			<td style="width:319px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase XI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640 with glutamate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11879020</td>
			<td>no glucose or HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human AB Sera, Male Donors</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>HS-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fungizone</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin Solution 50 mg/ml</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1M Hepes, pH 7.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin - Streptomycin 100X Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepatocyte Growth Factor (HGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GLP-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>130-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dnase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile Petri Dishes, 60 x 15 mm; Stackable, venting ribs</td>
			<td>Spectrum Laboratory Products, Inc.</td>
			<td>D210-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">16% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey Serum&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BrdU</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00-0103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-insulin (mouse monclonal; 1:1000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (mouse monoclonal)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-47910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (goat polyclonal)</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>47383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>47267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 546 (rabbit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 546 (mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 488 (rabbit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 488 (mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ki67</td>
			<td>Lab Vision Neomarkers</td>
			<td>RM 9016-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pan-CK (mouse monoclonal; 1:100)</td>
			<td>Immunotech</td>
			<td>2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CK19</td>
			<td>AbD Serotech</td>
			<td>MCA 2145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HTB9 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>5637</td>
			<td>see Beattie 1997 reference to generate matrix</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-6013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and imaging of human fetal pancreatic cell clusters

لما يقرب من 30 عاما، وقد أثبتت العلماء أن الجنين ICCS البشرية المزروعة تحت كبسولة الكلى من الفئران عارية نضجت في أداء خلايا الغدد الصماء، كما يتضح من زيادة كبيرة في تعميم الإنسان C-الببتيد التالية التحفيز الجلوكوز 1-9. ولكن في المختبر، نشأة الخلايا المنتجة للانسولين من ICCS الجنين البشري هو انخفاض 10؛ النتائج تذكرنا التجارب الأخيرة أجريت مع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC)، مصدر متجدد للخلايا التي تحمل وعودا كبيرة كعلاج العلاجية المحتملة لمرض السكري نوع 1. مثل ICCS، زرع HESC متباينة جزئيا توليد استجابة الجلوكوز والأنسولين الخلايا المنتجة، ولكن في نشأة المختبر من الخلايا المنتجة للانسولين من HESC هو أقل قوة بكثير 11-17. وهناك فهم كامل للعوامل التي تؤثر على نمو وتمايز الخلايا السلائف الغدد الصماء المرجح تتطلب ولدت البيانات من كلا ICCS وسعادةSC. في حين أن عددا من البروتوكولات الموجودة لتوليد خلايا انتاج الانسولين من HESC في المختبر 11-22، وجود عدد أقل بكثير لICCS 10،23،24. من المرجح أن يأتي جزء من التناقض من صعوبة العمل مع البنكرياس الجنين البشري. وتحقيقا لهذه الغاية، فقد واصلنا الاعتماد على الأساليب القائمة لعزل الجزر الجنين من بنكرياس الإنسان مع الأعمار الحمل تتراوح بين 12 إلى 23 أسبوعا، وتنمو الخلايا كما أحادي الطبقة أو في التعليق، والصورة لتكاثر الخلايا، وعلامات البنكرياس والهرمونات البشرية بما في ذلك الجلوكاجون وC-الببتيد. ICCS التي تم إنشاؤها بواسطة بروتوكول موضح أدناه النتيجة في الافراج C-الببتيد بعد زرع الكلى تحت الكبسولة من الفئران عارية التي تشبه إلى مستويات C-الببتيد التي حصلت عليها من زرع أنسجة جديدة 6. على الرغم من أن الأمثلة المعروضة هنا التركيز على انتشار الأديم الباطن والبنكرياس β نشأة الخلية، بروتوكول يمكن استخدامها لدراسة الجوانب الأخرى للتنمية البنكرياس، بما في ذلك إفرازات، الأقنية، والخلايا المنتجة للهرمون الأخرى.

التحضير المتأني للICCS الجنين أمر بالغ الأهمية لنجاح هذا البروتوكول. وتظهر الصور ممثل كيف تبدو الخلايا عادة في فترات محددة بعد الطلاء في الشكل 2. بعد تنقية، تظهر المجاميع الخلية مطلي حديثا، والتكتلات واضحة متفرق الصغيرة والتي تحتوي على عدد قليل من الخلايا (الشكل 2A). بعد ساعة ال 24 الأولى (الشكل 2B)، فإن العديد من مجموعات الخلايا تصبح أكبر، ولكن لا تزال العديد من المجموعات الصغيرة. قبل 48 ساعة، وسعت المجموعات بشكل ملحوظ، ولكن لا تزال غير المتكافئة (الشكل 2C). في 72 ساعة، يجب أن تكون واضحة ICCS، موحدة نسبيا في الحجم والشكل (الشكل 2D). هو في هذه المرحلة أن الخلايا يمكن مطلي إما على المصفوفات، مثل HTB-9، لمدة 24 ساعة قبل المناعي أو السماح لتنمو لمدة 72 ساعة أخرى في غياب أو وجود مواد كيميائية أو الأدوية التي قد يغير التعبير عن الجينات المطلوبة لخلية البنكرياس الصماء زeneration الشكل 3 يسلط الضوء على عدد من الأجسام المضادة تستخدم عادة لتقييم إما الانتشار المحكمة الجنائية الدولية أو تمايز الأديم الباطن نحو البنكرياس. في الشكل 3A، كانت مطلية ICCS على HTB-9، ونمت لمدة 4 أيام، وملون لPDX1، علامة حاسمة للتنمية البنكرياس. على الرغم من أن في المختبر تلطيخ ICCS تتم بشكل روتيني في المختبر لدينا، في كثير من الأحيان، يتم زرع الجنين ICCS الإنسان تحت كبسولة الكلى من الفئران عارية وسمحت لتتكاثر والتفريق في الجسم الحي 6،9،30-32. في أوقات محددة بعد الزرع، يتم التضحية الفئران وتتم إزالة الكلى المزروعة التي تحتوي على ICCS، ثابتة في بارافورمالدهيد 4٪، وجزءا لا يتجزأ من البارافين. يتم إنشاء أقسام متسلسلة 5 ميكرون إما على الموقع باستخدام مشراح أو منشأة المجهري الأساسية. يوصف فضح حاتمة وتلطيخ البروتينات من البارافين جزءا لا يتجزأ من النسيج لمناعي المجهري في البروتوكول الاختياري 3،10-3.17 في الشكل 3B، كانت ملطخة ICCS زرعها مع علامة الخلية الظهارية عموم cytokeratin (PanCK؛ الأخضر) ومع Ki67 (أحمر) لتقييم تكاثر الخلايا. في مثال آخر، تم الكشف عن كل من الأنسولين البشري (الخضراء) والجلوكاجون (الحمراء) بعد زرع والنضج تحت كبسولة الكلى من الماوس عارية (الشكل 3C). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1. تدفق الرسم البياني إعداد ICC الجنين الإنسان وتلطيخ للالمناعي. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. إعداد ICCS الجنين الممثل في 0، 24، 48، أو 72 ساعة بعد الطلاء. (A) ICCSفي تعليق تم تصوير مباشرة بعد الطلاء، (B) 24 ساعة بعد الطلاء، ساعة (C) 48 بعد الطلاء، أو (D) 72 ساعة بعد الطلاء. شريط النطاق لميلان، 10X التكبير = 300 ميكرون، شريط النطاق لD، 20 التكبير = 100 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50796/50796fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 3" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig3highres.jpg" /> . الرقم 3 المناعي من ICCS مطلي بشكل روتيني، يتم تصوير ICCS ل(أ) PDX1 البنكرياس الأديم الباطن علامة (الأخضر)، (B) خلايا الغدد الصماء (عموم CK؛ الأخضر) وانتشار (Ki67، أحمر)، (C) الانسولين (الأخضر) والجلوكاجون (الحمراء). شريط النطاق لميلان، 40X التكبير = 20 ميكرون.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters at JoVE.com

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

بروتوكول لعزل، وصفت مجموعات والثقافة، وصورة الخلية جزيرة (ICCS) مشتقة من خلايا البنكرياس الجنين البشري. تفاصيل أسلوب الخطوات اللازمة لتوليد ICCS من الأنسجة والثقافة والطبقات الوحيدة أو في التعليق كما المجاميع، وصورة لعلامات الانتشار والبنكرياس القرارات مصير الخلية.

العزلة والثقافة، والتصوير من الجنين البنكرياس الإنسان الكتل الخليوي

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

isolation-culture-and-imaging-of-human-fetal-pancreatic-cell-clusters

Research

JoVE Journal

Medicine

13.9K Views.  University of California, San Diego.  بروتوكول لعزل، وصفت مجموعات والثقافة، وصورة الخلية جزيرة (ICCS) مشتقة من خلايا البنكرياس الجنين البشري. تفاصيل أسلوب الخطوات اللازمة لتوليد ICCS من الأنسجة والثقافة والطبقات الوحيدة أو في التعليق كما المجاميع، وصورة لعلامات الانتشار والبنكر...

Video: Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

تلطيخ بروتوكولات لجزر البنكرياس الإنسان

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Non-invasive Optical Measurement of Cerebral Metabolism and Hemodynamics in Infants

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can accurately screen for brain injury, monitor injury evolution, or assess response to therapy. The energy used by neurons is derived largely from tissue oxidative metabolism, and neural hyperactivity and cell death are reflected by corresponding changes in cerebral oxygen metabolism (CMRO2). Thus, measures of CMRO2 are reflective of neuronal viability and provide critical diagnostic information, making CMRO2 an ideal target for bedside measurement of brain health.
Brain-imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) yield measures of cerebral glucose and oxygen metabolism, but these techniques require the administration of radionucleotides, so they are used in only the most acute cases.
Continuous-wave near-infrared spectroscopy (CWNIRS) provides non-invasive and non-ionizing radiation measures of hemoglobin oxygen saturation (SO2) as a surrogate for cerebral oxygen consumption. However, SO2 is less than ideal as a surrogate for cerebral oxygen metabolism as it is influenced by both oxygen delivery and consumption. Furthermore, measurements of SO2 are not sensitive enough to detect brain injury hours after the insult 1,2, because oxygen consumption and delivery reach equilibrium after acute transients 3. We investigated the possibility of using more sophisticated NIRS optical methods to quantify cerebral oxygen metabolism at the bedside in healthy and brain-injured newborns. More specifically, we combined the frequency-domain NIRS (FDNIRS) measure of SO2 with the diffuse correlation spectroscopy (DCS) measure of blood flow index (CBFi) to yield an index of CMRO2 (CMRO2i) 4,5.
With the combined FDNIRS/DCS system we are able to quantify cerebral metabolism and hemodynamics. This represents an improvement over CWNIRS for detecting brain health, brain development, and response to therapy in neonates. Moreover, this method adheres to all neonatal intensive care unit (NICU) policies on infection control and institutional policies on laser safety. Future work will seek to integrate the two instruments to reduce acquisition time at the bedside and to implement real-time feedback on data quality to reduce the rate of data rejection.

We combined frequency-domain near-infrared spectroscopy measures of cerebral hemoglobin oxygenation with diffuse correlation spectroscopy measures of cerebral blood flow index to estimate an index of oxygen metabolism. We tested the utility of this measure as a bedside screening tool to evaluate the health and development of the newborn brain.

غير الغازية قياس بصري من الأيض الدماغي وديناميكا الدم في الأطفال الرضع

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality  and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can  accurately ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

تجهيز رأب الثدي لحد من استئصال الثدي والأنسجة البشرية للثقافة الخليوي

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

زراعة الخلايا المشتقة المريض وعزل CD133<sup&gt; +</sup&gt; خلايا الجذعية السرطانية المزعومين من الميلانوما

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

تحسين بروتوكول للتسليخ مجهري ليزر من الجزر البنكرياسية الإنسان من عينات جراحية

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

العزلة، والحفظ بالتبريد والثقافة من الخلايا الظهارية البشرية السلى للتطبيقات السريرية

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

نموذج الجلد ماوس الجنين من إصلاح الجرح Scarless

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; ديسيبل</sup&gt; نموذج الفأر من النوع 2 من مرض السكري: البنكرياس عزل جزيرة وتعيش خلية 2 فوتون التصوير من الجزر سليمة

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

العزلة وثقافة توسيع ورم محددة الخلايا البطانية

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

عزل خلايا Decidual البشرية الأولية من الأغشية الجنينية لمصطلح مترافق

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...