يوفر بروتوكولنا وسيط كوكتيل لإطالة عمر العدلات إلى أكثر من خمسة أيام دون المساس بوظائف العدلات. كما أنه يوفر غسيل الكلى الموثوق به في المختبر للعدلات. يوسع علاج CLON-G إمكانيات الحفاظ على العدلات ونقلها والتلاعب بالجينات ، والتي يمكن أن تسرع البحث في مجتمع العدلات.
للبدء ، قم بإعداد الوسيط الأساسي عن طريق إضافة RPMI 1640 FBS و pen-strep إلى أنبوب سعة 50 ملليلتر. في الوقت نفسه ، قم بإذابة جميع حلول المخزون لمكونات CLON-G على الجليد. ثم تمييع HSP 70 و 200 ميكروغرام لكل ملليلتر من G-CSF في الوسط الأساسي.
نقل 976 ميكرولتر من الوسط الأساسي إلى أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر. لهذا ، أضف مكونات CLON-G لتحضير ملليلتر واحد من 2x وسط CLON-G كما هو موضح في المخطوطة. بعد ذلك ، قم بإعداد ثقافة العدلات عن طريق تعليق العدلات الفأر المعزولة في الوسط الأساسي.
أضف وسط CLON-G ، متبوعا بالوسط الأساسي إلى 24 صفيحة مستزرعة جيدا غير الأنسجة. ثم أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية المحضر واسحب بلطف ثلاث إلى أربع مرات. احتضان طبق الاستزراع عند 37 درجة مئوية مع إمداد 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
تلطيخ العدلات المستزرعة مع cytospin وتحليلها باستخدام المجهر الضوئي. لتحليل قياس التدفق الخلوي ، أضف ملليلتر واحد من وسط الخلية إلى مزرعة خلايا العدلات المزروعة بين عشية وضحاها. امزج وسط زراعة الخلايا عن طريق سحبه برفق من خمس إلى سبع مرات ونقل 100 ميكرولتر من هذا الخليط إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي في النقاط الزمنية المطلوبة.
في نفس الوقت ، دوامة حبات العد وماصة 10 ميكرولتر من محلول حبة لنفس أنبوب قياس التدفق الخلوي الذي يحتوي على وسط الخلية. أضف 10 ميكرولتر من مزيج التلوين المعد مسبقا إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي هذا واحتضانه لمدة خمس دقائق في الثلاجة تحت الظلام. ثم أضف 100 ميكرولتر من المياه المالحة إلى الأنبوب واخلطها جيدا للتوزيع المتساوي لخرز العد والخلايا.
أخيرا ، قم بإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي لتعليق الخلية كما هو موضح في مخطوطة النص. لمقايسة الصور الفلورية ، أضف ملليلتر من تعليق الخلية لكل لوحة متحدة البؤر واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. وفي الوقت نفسه ، قم بإذابة غرام واحد من كلوريد الكالسيوم في 45 ملليلتر من المياه المالحة وقم بترشيحه بوحدة ترشيح 0.2 ميكرومتر.
قم بإزالة اللوحة البؤرية برفق في النقطة الزمنية المطلوبة. تلطيخ الخلايا مع 10 ميكرولتر من FITC-Annexin-V ، PI وكلوريد الكالسيوم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم باستخدام مجهر مضان متحد البؤر ، التقط الصور باستخدام القنوات المطلوبة.
في الدراسة الحالية ، لم يتأثر مورفولوجيا العدلات في وسط CLON-G حتى بعد خمسة أيام. علاوة على ذلك ، أظهرت الأنماط الظاهرية للفاكس خلايا سليمة بعد العلاج. أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي وجود عدد إيجابي من العدلات غير المعالجة في Annexin-V ويمكن أن يكون فقدان السكان بسبب حمض رباعي الخليك ثنائي الأمين في وسط الخلية.
ومع ذلك ، فإن صلاحية العدلات المعالجة CLON-G في 24 ساعة كانت أكثر من 90٪ تقريبا أكدت مقايسات الصور الفلورية أيضا صلاحية الخلية للعدلات المعالجة CLON-G. أظهرت العدلات المستزرعة في الوسط الأساسي لمدة 24 ساعة خلايا منتفخة وقد يكون فقدان هذه الخلايا ناتجا عن اهتزاز أو سحب الصفيحة متحدة البؤر. يمكن أن تؤثر تركيزات وتأثيرات مركب CLON-G بشكل كبير على اختبارات العدلات.
إذا كان ذلك ممكنا ، تجنب تعديلها. فحوصات العدلات شاقة ومكلفة ومحدودة للغاية في التطبيق السريري بسبب عمرها القصير. هذه الطريقة تتغلب جزئيا على هذه العقبات.
