Nosso protocolo fornece um meio de coquetel para prolongar a vida útil dos neutrófilos para mais de cinco dias sem comprometer as funções dos neutrófilos. Também oferece diálise in vitro confiável para neutrófilos. O tratamento com CLON-G amplia as possibilidades de preservação, transporte e manipulação gênica de neutrófilos, o que pode acelerar a pesquisa na comunidade de neutrófilos.
Para começar, prepare o meio básico adicionando RPMI 1640 FBS e pen-strep a um tubo de 50 mililitros. Simultaneamente, descongelar todas as soluções estoque dos componentes CLON-G no gelo. Em seguida, diluir HSP 70 e 200 microgramas por mililitro de G-CSF no meio básico.
Transfira 976 microlitros de meio básico para um tubo centrífugo de 15 mililitros. Para isso, adicione os componentes CLON-G para preparar um mililitro de meio CLON-G 2x conforme descrito no manuscrito. Em seguida, preparar a cultura de neutrófilos suspendendo os neutrófilos isolados de camundongos no meio básico.
Adicionar o meio CLON-G, seguido do meio básico, a 24 placas bem não cultivadas em tecido. Em seguida, adicione 100 microlitros da suspensão de células preparada e pipete suavemente de três a quatro vezes. Incubar a placa de cultura a 37 graus Celsius com fornecimento de 5% de dióxido de carbono.
Colorir os neutrófilos cultivados com cytospin e analisá-los usando um microscópio de luz. Para análise por citometria de fluxo, adicione um mililitro de meio celular à cultura de células de neutrófilos cultivada durante a noite. Misturar o meio de cultura celular pipetando-o suavemente cinco a sete vezes e transferir 100 microlitros dessa mistura para um tubo de citometria de fluxo nos momentos desejados.
Simultaneamente, vórtice as esferas de contagem e pipeta de 10 microlitros de solução de esferas para o mesmo tubo de citometria de fluxo contendo meio celular. Adicione 10 microlitros de uma mistura de coloração pré-preparada a este tubo de citometria de fluxo e incube por cinco minutos na geladeira sob escuro. Em seguida, adicione 100 microlitros de soro fisiológico ao tubo e misture bem para uma distribuição uniforme das esferas e células de contagem.
Por fim, realizar a análise por citometria de fluxo da suspensão celular conforme descrito no texto manuscrito. Para o ensaio de imagens fluorescentes, adicionar dois mililitros de suspensão celular por placa confocal e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Enquanto isso, dissolva um grama de cloreto de cálcio em 45 mililitros de soro fisiológico e filtre-o com uma unidade de filtragem de 0,2 micrômetro.
Remova suavemente a placa confocal no ponto de tempo necessário. Corar as células com 10 microlitros de CTFI-Anexina-V, PI e cloreto de cálcio por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, usando um microscópio de fluorescência confocal, capture as imagens usando os canais desejados.
No presente estudo, a morfologia dos neutrófilos não foi afetada no meio CLON-G mesmo após cinco dias. Além disso, os fenótipos de fax demonstraram células intactas após o tratamento. A análise por citometria de fluxo mostrou uma população positiva de neutrófilos não tratados em Anexina-V e a perda populacional pode ser devida ao ácido etilenodiaminotetracético no meio celular.
No entanto, a viabilidade dos neutrófilos tratados com CLON-G em 24 horas foi de aproximadamente mais de 90%Os ensaios de imagem fluorescente também confirmaram a viabilidade celular dos neutrófilos tratados com CLON-G. Os neutrófilos cultivados no meio básico por 24 horas apresentaram células inchadas e a perda dessas células pode ter sido decorrente da agitação ou pipetagem da placa confocal. As concentrações e os efeitos do composto CLON-G podem afetar significativamente os testes de neutrófilos.
Se possível, evite modulá-los. As investigações com neutrófilos são trabalhosas, caras e extremamente limitadas em aplicação clínica devido ao seu curto tempo de vida. Esse método supera parcialmente esses obstáculos.
