Unser Protokoll bietet ein Cocktailmedium, um die Lebensdauer der Neutrophilen auf mehr als fünf Tage zu verlängern, ohne die Funktionen der Neutrophilen zu beeinträchtigen. Es bietet auch eine zuverlässige In-vitro-Dialyse für Neutrophile. Die CLON-G-Behandlung erweitert die Möglichkeiten der Konservierung, des Transports und der Genmanipulation von Neutrophilen, was die Forschung in der Gemeinschaft der Neutrophilen beschleunigen kann.
Bereiten Sie zunächst das Basismedium vor, indem Sie RPMI 1640 FBS und Pen-Streptokokken in ein 50-Milliliter-Röhrchen geben. Tauen Sie gleichzeitig alle Stammlösungen der CLON-G-Komponenten auf Eis auf. Anschließend HSP 70 und 200 Mikrogramm pro Milliliter G-CSF im Basismedium verdünnen.
976 Mikroliter Basismedium in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen. Fügen Sie dazu die CLON-G-Komponenten hinzu, um einen Milliliter 2x CLON-G-Medium wie im Manuskript beschrieben herzustellen. Als nächstes wird die Neutrophilenkultur vorbereitet, indem die isolierten Mausneutrophilen im Basismedium suspendiert werden.
Fügen Sie CLON-G-Medium, gefolgt von dem Basismedium, zu 24 Well-Platten ohne Gewebekulturen hinzu. Geben Sie dann 100 Mikroliter der vorbereiteten Zellsuspension hinzu und pipettieren Sie vorsichtig drei- bis viermal. Inkubieren Sie die Kulturplatte bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxidzufuhr.
Die kultivierten Neutrophilen werden mit Cytospin angefärbt und mit einem Lichtmikroskop analysiert. Für die durchflusszytometrische Analyse wird ein Milliliter Zellmedium in die über Nacht gewachsene neutrophile Zellkultur gegeben. Mischen Sie das Zellkulturmedium, indem Sie es fünf- bis siebenmal vorsichtig pipettieren, und geben Sie 100 Mikroliter dieser Mischung zu den gewünschten Zeitpunkten in ein Durchflusszytometrieröhrchen.
Gleichzeitig werden die Zählkügelchen umgewirbelt und 10 Mikroliter Perlenlösung in dasselbe Durchflusszytometrieröhrchen pipetiert, das das Zellmedium enthält. Geben Sie 10 Mikroliter einer vorbereiteten Färbemischung in dieses Durchflusszytometrie-Röhrchen und inkubieren Sie es fünf Minuten lang im Kühlschrank unter Dunkelheit. Geben Sie dann 100 Mikroliter Kochsalzlösung in das Röhrchen und mischen Sie es gut, um eine gleichmäßige Verteilung der Zählperlen und -zellen zu gewährleisten.
Führen Sie abschließend die durchflusszytometrische Analyse der Zellsuspension durch, wie im Textmanuskript beschrieben. Für Fluoreszenzbilder werden zwei Milliliter Zellsuspension pro konfokaler Platte hinzugefügt und bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert. Lösen Sie währenddessen ein Gramm Calciumchlorid in 45 Millilitern Kochsalzlösung auf und filtrieren Sie es mit einer 0,2-Mikrometer-Filtereinheit.
Entfernen Sie die konfokale Platte vorsichtig zum gewünschten Zeitpunkt. Färben Sie die Zellen mit 10 Mikrolitern FITC-Annexin-V, PI und Calciumchlorid für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nehmen Sie dann mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop die Bilder mit den gewünschten Kanälen auf.
In der vorliegenden Studie war die Morphologie der Neutrophilen im CLON-G-Medium auch nach fünf Tagen nicht beeinträchtigt. Darüber hinaus zeigten die Fax-Phänotypen nach der Behandlung intakte Zellen. Die durchflusszytometrische Analyse ergab eine positive Population von unbehandelten Neutrophilen in Annexin-V und der Populationsverlust könnte auf Ethylendiamintetraessigsäure im Zellmedium zurückzuführen sein.
Die Viabilität der mit CLON-G behandelten Neutrophilen nach 24 Stunden betrug jedoch etwa mehr als 90%Die Fluoreszenzbild-Assays bestätigten auch die Zellviabilität der mit CLON-G behandelten Neutrophilen. Die Neutrophilen, die 24 Stunden lang im Basismedium kultiviert wurden, zeigten gepuffte Zellen, und der Verlust dieser Zellen könnte auf das Schütteln oder Pipettieren der konfokalen Platte zurückzuführen sein. Die Konzentrationen und Wirkungen von CLON-G-Verbindungen können die Tests auf neutrophile Granulozyten erheblich beeinflussen.
Vermeiden Sie nach Möglichkeit eine Modulation. Untersuchungen zu Neutrophilen sind mühsam, teuer und aufgrund ihrer kurzen Lebensdauer in der klinischen Anwendung äußerst begrenzt. Mit dieser Methode werden diese Hindernisse teilweise überwunden.
