Protokolümüz, nötrofil fonksiyonlarından ödün vermeden nötrofil ömrünü beş günden fazla uzatmak için bir kokteyl ortamı sağlar. Ayrıca nötrofiller için güvenilir in vitro diyaliz sunar. CLON-G tedavisi, nötrofil topluluğundaki araştırmaları hızlandırabilecek nötrofil koruma, taşıma ve gen manipülasyonu olanaklarını genişletir.
Başlamak için, 50 mililitrelik bir tüpe RPMI 1640 FBS ve kalem strep ekleyerek temel ortamı hazırlayın. Aynı zamanda, CLON-G bileşenlerinin tüm stok çözümlerini buz üzerinde çözün. Daha sonra HSP 70 ve 200 mikrogramlarını temel ortamda mililitre G-CSF başına seyreltin.
976 mikrolitre bazik ortamı 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Buna, makalede açıklandığı gibi bir mililitre 2x CLON-G ortamı hazırlamak için CLON-G bileşenlerini ekleyin. Daha sonra, izole edilmiş fare nötrofillerini temel ortamda askıya alarak nötrofil kültürünü hazırlayın.
CLON-G ortamını ekleyin, ardından temel ortamı 24 iyi doku kültürlü olmayan plakaya ekleyin. Daha sonra hazırlanan hücre süspansiyonundan 100 mikrolitre ekleyin ve üç ila dört kez hafifçe pipetin. Kültür plakasını% 5 karbondioksit kaynağı ile 37 santigrat derecede inkübe edin.
Kültürlenmiş nötrofilleri sitospin ile lekeleyin ve ışık mikroskobu kullanarak analiz edin. Akış sitometri analizi için, gece boyunca yetiştirilen nötrofil hücre kültürüne bir mililitre hücre ortamı ekleyin. Hücre kültürü ortamını beş ila yedi kez hafifçe pipetleyerek karıştırın ve bu karışımın 100 mikrolitresini istenen zaman noktalarında bir akış sitometri tüpüne aktarın.
Aynı anda, sayma boncuklarını vorteks edin ve 10 mikrolitre boncuk çözeltisini hücre ortamını içeren aynı akış sitometri tüpüne pipetin. Bu akış sitometri tüpüne önceden hazırlanmış bir boyama karışımından 10 mikrolitre ekleyin ve karanlık altında buzdolabında beş dakika inkübe edin. Daha sonra tüpe 100 mikrolitre salin ekleyin ve sayma boncuklarının ve hücrelerinin eşit dağılımı için iyice karıştırın.
Son olarak, metin makalesinde açıklandığı gibi hücre süspansiyonunun akış sitometri analizini gerçekleştirin. Floresan görüntü testi için, konfokal plaka başına iki mililitre hücre süspansiyonu ekleyin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Bu arada, bir gram kalsiyum klorürü 45 mililitre salin içinde çözün ve 0.2 mikrometrelik bir filtreleme ünitesi ile filtreleyin.
Konfokal plakayı gerekli zaman noktasında yavaşça çıkarın. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 10 mikrolitre FITC-Annexin-V, PI ve kalsiyum klorür ile lekeleyin. Daha sonra bir konfokal floresan mikroskobu kullanarak, istenen kanalları kullanarak görüntüleri yakalayın.
Bu çalışmada, nötrofillerin morfolojisi beş gün sonra bile CLON-G ortamında etkilenmemiştir. Ayrıca, faks fenotipleri tedaviden sonra sağlam hücreler gösterdi. Akış sitometri analizi, Eksin-V'de işlenmemiş nötrofillerin pozitif bir popülasyonunu gösterdi ve popülasyon kaybı, hücre ortamındaki etilen diamin tetraasetik asitten kaynaklanıyor olabilir.
Bununla birlikte, CLON-G ile tedavi edilen nötrofillerin 24 saatte yaşayabilirliği yaklaşık% 90'dan fazlaydıFloresan görüntü testleri ayrıca CLON-G ile tedavi edilen nötrofillerin hücre canlılığını da doğruladı. 24 saat boyunca bazik ortamda kültürlenen nötrofiller şişirilmiş hücreler gösterdi ve bu hücrelerin kaybı konfokal plakanın sallanmasından veya pipetlenmesinden kaynaklanmış olabilir. CLON-G bileşik konsantrasyonları ve etkileri nötrofil testlerini önemli ölçüde etkileyebilir.
Mümkünse, bunları modüle etmekten kaçının. Nötrofil araştırmaları zahmetli, pahalıdır ve kısa ömürleri nedeniyle klinik uygulamada son derece sınırlıdır. Bu yöntem kısmen bu engelleri aşar.
