CLON-G 및 In Vitro Spontaneous Death Assay를 통한 호중구 수명 연장

우리의 프로토콜은 호중구 기능을 손상시키지 않으면서 호중구 수명을 5일 이상으로 연장하는 칵테일 배지를 제공합니다. 또한 호중구에 대한 신뢰할 수 있는 체외 투석을 제공합니다. CLON-G 치료는 호중구 보존, 수송 및 유전자 조작의 가능성을 확장하여 호중구 군집에서의 연구를 가속화할 수 있습니다.

시작하려면 RPMI 1640 FBS와 펜 스트렙을 50밀리리터 튜브에 추가하여 기본 배지를 준비합니다. 동시에 CLON-G 구성품의 모든 원액을 얼음 위에서 해동합니다. 그런 다음 기본 배지에서 G-CSF 밀리리터당 HSP 70 및 200 마이크로 그램을 희석하십시오.

976마이크로리터의 기본 매체를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 여기에 CLON-G 구성 요소를 추가하여 원고에 설명된 대로 1밀리리터의 2x CLON-G 배지를 준비합니다. 다음으로, 분리된 마우스 호중구를 염기성 배지에 현탁하여 호중구 배양물을 준비한다.

CLON-G 배지를 첨가하고, 염기성 배지를 24웰 비조직 배양 플레이트에 첨가하였다. 그런 다음 준비된 세포 현탁액 100 마이크로 리터를 넣고 부드럽게 3-4 회 피펫합니다. 배양 접시를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 공급으로 배양합니다.

배양된 호중구를 사이토스핀으로 염색하고 광학 현미경을 사용하여 분석합니다. 유세포 분석을 위해, 하룻밤 동안 성장한 호중구 세포 배양액에 1밀리리터의 세포 배지를 첨가한다. 세포 배양 배지를 5-7회 부드럽게 피펫팅하여 혼합하고 이 혼합물 100마이크로리터를 원하는 시점에 유세포 분석 튜브에 옮깁니다.

동시에, 계수 비드 및 10 마이크로리터의 비드 용액을 함유하는 동일한 세포 배지를 함유하는 동일한 유세포 분석 튜브에 와동시킨다. 미리 준비된 염색 혼합물 10마이크로리터를 이 유세포 분석 튜브에 넣고 어두운 곳에서 냉장고에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 식염수를 튜브에 넣고 계수 비드와 세포의 균일한 분포를 위해 잘 혼합합니다.

마지막으로, 텍스트 원고에 설명된 대로 세포 현탁액의 유세포 분석을 수행합니다. 형광 이미지 분석의 경우 컨포칼 플레이트당 2밀리리터의 세포 현탁액을 추가하고 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 배양합니다. 한편, 45 밀리리터의 식염수에 1 그램의 염화칼슘을 녹이고 0.2 마이크로 미터 여과 장치로 여과한다.

필요한 시점에서 컨포칼 플레이트를 부드럽게 제거합니다. 실온에서 5분 동안 10마이크로리터의 FITC-Annexin-V, PI 및 염화칼슘으로 세포를 염색합니다. 그런 다음 컨포칼 형광 현미경을 사용하여 원하는 채널을 사용하여 이미지를 캡처합니다.

본 연구에서는 5일 후에도 CLON-G 배지에서 호중구의 형태가 영향을 받지 않았다. 또한, 팩스 표현형은 치료 후 손상되지 않은 세포를 나타냈다. 유세포 분석 결과 Annexin-V에서 처리되지 않은 호중구의 양성 집단이 나타났으며 집단 손실은 세포 배지의 에틸렌 디아민 테트라아세트산으로 인한 것일 수 있습니다.

그러나 24시간째 CLON-G 처리된 호중구의 생존율은 약 90% 이상이었고, 형광 이미지 분석법에서도 CLON-G 처리된 호중구의 세포 생존율을 확인할 수 있었습니다. 염기성 배지에서 24시간 동안 배양된 호중구는 부풀어 오른 세포를 보였으며 이러한 세포의 손실은 공초점 플레이트의 흔들림 또는 피펫팅으로 인해 발생했을 수 있습니다. CLON-G 화합물 농도 및 효과는 호중구 검사에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.

가능하면 변조하지 마십시오. 호중구 조사는 힘들고 비용이 많이 들며 수명이 짧기 때문에 임상 적용이 극히 제한적입니다. 이 방법은 이러한 장애물을 부분적으로 극복합니다.