التقنيات المعروضة هنا مفيدة لدراسة مجتمع الفطريات الداخلية المرتبط بأعضاء النبات المختلفة. يسمح عزل الفطريات الداخلية بتحديدها ، وهي ذات قيمة في تقنيات أخرى مثل الإنبات التكافلي. للبدء ، قم بإعداد ثمانية إلى 10 سنتيمترات من أطباق بتري متوسطة لثقافة المساعد الشخصي الرقمي تستكمل بثلاثة ملليلتر لكل لتر من المضادات الحيوية.
تحقق من التلوث عن طريق احتضان أطباق بتري المتوسطة المستزرعة عند 36 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل الاستخدام. في اليوم التالي ، قم بتطهير شظايا النباتات الفطرية الصحية بشكل سطحي باستخدام إجراء قياسي ووضعها في طبق بتري معقم. لتقييم فعالية التطهير السطحي للعينات ، قم بتلقيح بضع قطرات من الماء المقطر المستخدم أثناء الغسيل الأخير للعينات على القناة الشريانية السالكة (PDA).
بعد ذلك ، باستخدام مشرط ملتهب وملقط ، قسم العينات إلى قطع بسمك 0.2 سم. قسم العينات لتضخيم مساحة السطح لتكون على اتصال مع الوسط. ضع خمس شظايا من الأعضاء الجوفية في لوحة PDA المكملة بالمضاد الحيوي بعيدا قدر الإمكان دون لمس حواف الطبق.
ختم أطباق بتري مع فيلم تتشبث ، وتخزينها في الظلام في 25 إلى 27 درجة مئوية لمدة خمسة أيام. قبل يوم من الزراعة الفرعية ، قم بإعداد أطباق بتري خمسة سنتيمترات باستخدام خمسة إلى سبعة جرامات لكل لتر AA ، واحتضان الأطباق عند 36 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. لتنقية العزلات الفطرية ، قم بتمييز مستعمرات لوحة PDA حسب اللون ونمط النمو والملمس وتنسيق الهامش.
ثم حدد هوامش المستعمرة على الجانب السفلي من الطبق. حدد أيضا المستعمرات برمز. باستخدام طرف عود أسنان خشبي معقم ، استرجع كمية صغيرة من الفطريات من هوامش المستعمرة الفطرية المحددة وقم بتخطيط لوحة AA ، مما ينتج عنه ثلاثة خطوط على بعد سنتيمتر واحد من بعضها البعض وحواف الطبق.
قم بتسمية لوحة AA بالكود المناسب باستخدام ورق لاصق وقلم رصاص. أغلق الألواح قبل حضنها في الظلام عند 25 إلى 27 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. بعد الحضانة ، راقب بدقة اللوحات لتحديد الخيوط الدقيقة التي تشكل مستعمرات فردية.
حدد مساحة المستعمرات الفردية باستخدام علامة دائمة. قم بقطع جزء من الوسط الذي يحتوي على المستعمرة باستخدام عود أسنان معقم ، وانقل حجم القطع إلى مركز صفيحة PDA Petri جديدة بدون مضادات حيوية. بعد تسمية أطباق بتري برموز العزلات ، قم بإغلاقها بغشاء ملتصق ، واحتفظ بها في الظلام عند 25 إلى 27 درجة مئوية لمدة سبعة إلى 14 يوما.
لبدء الحفاظ على العزلات الفطرية باستخدام طريقة Castellani ، أضف 0.5 ملليلتر من الماء المقطر إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق المعقم بملليلتر. باستخدام عود أسنان معقم ، قم بقطع وسط مكعب 0.5 × 0.5 سم من هوامش الفطريات للعزلات النقية المزروعة بالفعل. ضع أربعة إلى ستة متوازي المستطيلات في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة بالماء المقطر.
قم بتخزين الأنابيب في الظلام عند 25 درجة مئوية طالما دعت الحاجة. عند الحاجة ، استرد متوازي المستطيلات وضعه في وسط طبق PDA جديد لزراعة عزلة مخزنة. ابدأ طريقة تثبيت ندف عن طريق وضع قطرة من بقعة Toluidine blue-O على شريحة زجاجية نظيفة.
يمكن استخدام بقع مختلفة في مثل هذه التقنية. باستخدام عود أسنان معقم ، قم بإزالة بعض الخيوط بعناية من العزلة المزروعة ، وضعها في قطرة البقعة. ضع زلة غطاء وقم بتحليلها تحت المجهر الضوئي.
بالنسبة لطريقة تركيب الشريط اللاصق ، ضع قطرة من بقعة قطن اللاكتوفينول الزرقاء على شريحة زجاجية نظيفة. قطع شريط من شريط لاصق شفاف في حجم يناسب الشريحة الزجاجية وبقعة بقعة مركزية جيدا. قم بتوجيه السطح اللاصق للشريط اللاصق إلى سطح الفطريات ، وحاول جمع بعض الخيوط دون الضغط أو جمع الكثير منها.
ثم قم بلصق الشريط على الشريحة الزجاجية ، مع التأكد من ملامسة البقعة للخيوط التي تم جمعها. ضع قطرة ماء فوق الشريط وضع قسيمة غطاء قبل تحليل الشريحة تحت المجهر الضوئي. لوحظ نمو مجموعات صغيرة من الفطريات الفطرية الخيطية الخارجة من داخل الشظايا بعد خمسة أيام من تلقيح جزء العضو النباتي الفطري على وسط PDA.
خلال سبعة إلى 14 يوما من تلقيح العزلة المنقاة ، لوحظ نمو الطرد المركزي لمستعمرة عزل الفطريات النقية على PDA ، مما شكل فطريات دائرية وحيدة. تم تحديد الملوثات المحتملة بسهولة ، مما يعرض تجانس المستعمرة للخطر فيما يتعلق بجانب شكل نموها ولونها وإنتاج الصباغ في الوسط. كانت المستعمرة المعزولة من الجذور المغزلية للأوركيد الفطري ، Wullschlaegelia aphylla ، معتمة مع عدم وجود أصباغ أو إفرازات قابلة للانتشار في الوسط.
كانت المستعمرة بيضاء إلى رمادية على الجانب العلوي ، وبنية على الجانب السفلي. كانت الفطريات جوية وفيرة ، وكانت الهوامش غير منتظمة وجوية. كان للمستعمرة نسيج مخملي ، وتضاريس مجعدة بدون هياكل عيانية.
تم عرض الهياكل التي لم تكن مرئية بسهولة في الفطريات غير الملوثة بعد تلطيخ الفطريات الفطرية بقطن اللاكتوفينول الأزرق والأزرق التولويدين ، مما يسهل التعرف عليها. يمكن أيضا تطبيق طرق العزل الفطري المعروضة هنا على النباتات الخضراء لتحديد النباتات الداخلية الفطرية. يمكن استخدام الفطريات المعزولة في تجارب الإنبات التكافلي.
