分离、表征和总 DNA 提取以鉴定真菌异养植物中的内生真菌

这里介绍的技术对于研究与不同植物器官相关的内生真菌群落很有用。内生真菌分离可以识别它们，并且在共生萌发等其他技术中很有价值。首先，准备 8 至 10 厘米的 PDA 培养基培养皿，每升补充 3 毫升抗生素。

使用前将培养基培养基培养皿在36摄氏度下孵育24小时，检查污染。第二天，使用标准程序对健康的真菌异养植物片段进行表面消毒，并将它们放入无菌培养皿中。为了评估样品表面除虫的功效，在PDA上接种几滴在样品最后一次洗涤期间使用的蒸馏水。

接下来，使用火焰手术刀和镊子，将样品切成 0.2 厘米厚的碎片。对样品进行切片以放大与介质接触的表面积。将五个地下器官碎片放在补充抗生素的PDA板中，尽可能远离，不要接触培养皿边缘。

用保鲜膜密封培养皿，并将它们存放在 25 至 27 摄氏度的黑暗中五天。传代培养前一天，使用每升 AA 培养基 5 至 7 克制备 5 厘米培养皿，并将平板在 36 摄氏度下孵育 24 小时。为了纯化真菌分离株，通过颜色、生长模式、质地和边缘形式区分 PDA 平板菌落。

然后在培养皿的底部划定菌落边缘。还要用代码识别菌落。使用高压灭菌的木牙签的尖端，从已识别的真菌菌落的边缘回收少量菌丝体，并在AA板上划出条纹，在彼此和培养皿边缘相距一厘米处产生三个条纹。

使用不干纸和铅笔在 AA 板上贴上适当的代码。密封板，然后在 25 至 27 摄氏度的黑暗中孵育三天。孵育后，仔细观察平板以识别形成单个菌落的细小菌丝。

使用永久性标记划定单个菌落的区域。使用高压灭菌的牙签切割含有菌落的培养基的一部分，并将切割的体积转移到不含抗生素的新PDA培养皿的中心。在培养皿上贴上分离物的代码后，用保鲜膜密封它们，并在 25 至 27 摄氏度的黑暗中保持 7 至 14 天。

要开始用Castellani的方法保存真菌分离物，将0.5毫升蒸馏水加入高压灭菌的2毫升微量离心管中。使用高压灭菌的牙签，从已经生长的纯化分离株的菌丝体边缘切下0.5×0.5厘米的长方体培养基。将四到六个长方体放入装有蒸馏水的微量离心管中。

根据需要将试管存放在 25 摄氏度的黑暗中。需要时，回收一个长方体并将其放置在新PDA培养皿的中心，以培养储存的分离物。通过在干净的载玻片上滴一滴甲苯胺蓝-O染色剂来开始挑逗安装方法。

在这种技术中可以使用不同的染色剂。使用高压灭菌的牙签，小心地从生长的分离物中去除一些菌丝，并将它们放入污渍滴中。放置盖玻片并在光学显微镜下进行分析。

对于胶带安装方法，将一滴乳酚棉蓝色污渍放在干净的载玻片上。剪下一条透明胶带，其尺寸适合载玻片和中央污渍滴。将胶条的粘性表面引导到菌丝体表面，并尝试收集一些菌丝，不要按压或收集太多菌丝。

然后将胶带粘在载玻片上，确保污渍与收集的菌丝接触。在胶带上方滴一滴水并放置盖玻片，然后在光学显微镜下分析载玻片。在PDA培养基上接种菌源异养植物器官片段五天后，观察到从碎片内部出现的小组丝状真菌菌丝体的生长。

在接种纯化分离物的7至14天期间，在PDA上观察到纯真菌分离物菌落的离心生长，形成唯一的环状菌丝体。可能的污染很容易识别，损害了菌落在培养基中生长形式、颜色和色素产生的均匀性。从菌性异养兰花（Wullschlaegelia aphylla）的梭形根中分离出的菌落是不透明的，培养基中没有可扩散的色素或渗出物。

菌落上侧为白色至灰色，下侧为褐色。菌丝体气生而丰富，边缘不规则且气生。该殖民地具有天鹅绒般的质地和没有宏观结构的皱纹地形。

用乳酚棉蓝和甲苯胺蓝-O染色真菌菌丝体后，表现出在未染色菌丝体中不易看到的结构，便于鉴定。这里介绍的真菌分离方法也可以应用于绿色植物，以识别真菌内生菌。分离出的真菌可用于共生萌发试验。