تستخدم التقنية المثبتة أداة منخفضة التكلفة لمعالجة أنسجة الحمضيات الغنية باللحاء بسرعة ، مما يلغي الحاجة إلى بروتوكولات كثيفة العمالة ومعدات مخبرية متخصصة. وهذا يسمح بالكشف السريع عن الفيروسات والفيروسات والبكتيريا في المراحل النهائية وإدارة الفيروسات. يمكن أن تؤدي هذه الطريقة إلى زيادة الإنتاجية وتحسين جودة وتوحيد خدمات الاختبار التي تفيد صناعة الحمضيات ويحتمل أن تساعد في تشخيص وعلاج الأمراض في عمليات الحضانة والميدان.
تصاب نباتات الحمضيات بمسببات الأمراض ، وتسبب خسائر اقتصادية كبيرة في جميع أنحاء العالم. تعد تقنيات الكشف عن مسببات الأمراض المتقدمة ، مثل مستخرج أنسجة Budwood ، أو BTE ، ضرورية لإنتاج مواد إكثارية مختبرة لمسببات الأمراض لإنتاج الأشجار على نطاق واسع. على الرغم من اختبارها والتحقق من صحتها مع عينات الحمضيات ، يمكن تطبيق الطريقة في مختبرات التشخيص والعمليات الميدانية للعديد من المحاصيل الأخرى.
يجب على المبتدئين الذين يؤدون هذه التقنية التعرف على البروتوكول واتباع التعليمات بدقة والتحلي بالصبر. للبدء ، استخدم تطبيق الهاتف Test Tracker لتحديد شجرة واضغط مع الاستمرار على علامة طوق الاتصال قريب المدى أو NFC على الهاتف لتحميل معلومات الشجرة إلى العلامة. أدخل ثلاث إلى أربع عينات من خشب براعم الحمضيات في حامل الأكياس البلاستيكية المتوافق مع مستخرج أنسجة Budwood ، أو BTE ، وأغلقه بالمشبك.
بعد التأكد من جودة العينة باتباع الخطوات الموضحة في النص ، استخدم تطبيق الهاتف Test Tracker لمسح علامة طوق NFC للشجرة ، وربطها بعلامة مشبك NFC على حقيبة العينة. داخل غطاء دخان مطهر بشكل صحيح ، اقلب المفتاح الموجود في الجزء الخلفي من قاعدة مستخرج الأنسجة. تأكد من الضغط على المفتاح الموجود على الجانب الأيسر من الصندوق لأسفل في الأعلى ، وانتظر حتى يشير مؤشر LED الأخضر الوامض إلى أن الحجرة جاهزة.
لتحضير حجرة BTE ، قم بتوصيل كيس عينة فارغ بالجزء الخلفي من الحجرة عن طريق تثبيته في الفوهة الخلفية باستخدام حلقة O. افحص الشفرة بحثا عن علامات التآكل أو التلف ، مثل الجروح الموجودة على الشفرة المستمرة في البلاستيك ، أو الجروح الموجودة على الطرف. تأكد من أن السهم الموجود على الشفرة يصطف مع رمز القفل الفردي ، وأن إطلاق الهواء في الجزء السفلي من الحجرة يتم توجيهه نحو الرمز O.
ضع الغطاء الشفاف فوق فتحة الحجرة. باستخدام المسار الموجود على يمين الحجرة ، حرك شريحة BTE الشفافة على الحجرة ، وادفع القفل الموجود أسفل الحجرة إلى أقصى حد يمكن أن يدخل في الشريحة. تأكد من تركيب غطاء المكبس أعلى الشريحة.
لتحميل حجرة BTE على قاعدة BTE ، ضع الحجرة المعدة على القاعدة مع فوهة قاعدة BTE البارزة في الجزء الخلفي من الحجرة. قم بتحميل العينة على قاعدة BTE عن طريق تحريك الملصق الأبيض على علامة مشبك NFC بحركة دائرية بطيئة إلى Z على الجانب الأيمن من الصندوق حتى يبدأ الضوء الأصفر في الوميض. بعد إرفاق العينة بالقاعدة ، تأكد من عدم وجود ثقوب في كيس العينة.
ثم ضع الحلقة O فوق كيس العينة لتثبيتها في مقدمة فوهة BTE. لتحميل مجموعة المحاقن غير المستخدمة ، أولا ، قم بتمزيق مجموعة المحاقن. ثم ضع المحقنة غير المستخدمة الموضوعة على برج ميزان الوزن.
قم بإزالة المحقنة التي تم ضبطها عندما يبدأ الضوء الأحمر في الوميض ، أو يعرض المقياس صفرا. قم بإزالة المكبس باستخدام الفلتر من المحقنة مع التأكد من بقاء السائل في المحقنة السفلية. ضع المكبس على منشفة ورقية ، أو البرج ، حيث لا يلمس أي سطح.
أخيرا ، قم بتوصيل المحقنة بمنفذ خروج الشريحة عن طريق الضغط على منفذ الخروج في المحقنة وتدويرها 90 درجة. لبدء معالجة عينة خشب البراعم ، اضغط على الزر الأسود العلوي لبدء تشغيل الجهاز. أمسك عصا واحدة من خشب البراعم من الكيس ، وضعها في الجزء العلوي من فوهة BTE.
أمسك عصا خشب البراعم على الجانب الآخر من الحجرة باليد الأخرى وادخل ببطء إلى الشفرة. حرك خشب البراعم ببطء ذهابا وإيابا أثناء تدويره. عند سماع طنين طفيف، حرك الغصن إلى عمق الجهاز للتركيز على اللحاء.
بعد الانتهاء من ذلك لجميع الفروع ، اضغط على الزر الأسود العلوي لإيقاف المعالجة ، وانتظر حتى يبدأ الضوء في الوميض باللون الأصفر مرة أخرى. للتحقق من وزن العينة ، قم بتدوير المحقنة 90 درجة واسحبها لأسفل. ضع المكبس مرة أخرى على المحقنة وضع المحقنة على البرج.
بعد أن يكتشف المقياس العينة تلقائيا، يشير وميض مؤشر LED الأخضر إلى أن وزن العينة ضمن النطاق المناسب. إذا يومض الضوء الأحمر ، مما يشير إلى انخفاض وزن العينة ، كرر معالجة العينة. إذا كان الوزن مرتفعا جدا ، فقم بإزالة بعض العينات ، وسيصبح وميض مؤشر LED الأصفر أبطأ.
لتجانس العينة ، قم بإزالة المكبس من المحقنة التي تحتوي على العينة. ادفع السائل إلى المحقنة وأدخل المكبس مرة أخرى. ادفع المكبس لتمرير المخزن المؤقت وزرع النسغ من خلال مرشح الشبكة عبر الأنبوب المطاطي في المحقنة الفارغة.
امزج العينة عن طريق دفع المخزن المؤقت وعصارة النبات ذهابا وإيابا ثلاث إلى أربع مرات من حقنة إلى أخرى حتى تتحول العينة إلى سائل أخضر متجانس. بمجرد التجانس جيدا ، ادفع عينة عصارة النبات إلى المحقنة بدون مرشح الشبكة ، وافصل الأنبوب المطاطي والمحقنة بالفلتر عنها. ثم طرد عينة عصارة النبات من المحقنة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 2 ملليلتر.
بعد تسمية العينة برقم الكيس باستخدام علامة دائمة ، قم بتخزينها في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام مرة أخرى. تعقيم غرفة BTE القابلة للإزالة بعد معالجة العينة 10 ويستمر مؤشر LED الأخضر في الوميض بدلا من التغيير إلى اللون الأزرق. لتفكيك الحجرة وتنظيف جميع الملوثات ، قم بإزالة الغطاء البلاستيكي الشفاف وشريحة الغرفة الشفافة ومنفذ الانسداد على شريحة الغرفة.
ثم أدر صمام تحرير الهواء الموجود أسفل الحجرة إلى علامة القفل المفتوحة. بعد وضع مكونات الحجرة في منظف الإعداد بالموجات فوق الصوتية ، ضع الحجرة في الحمام مع وضع الغطاء تحتها لمنع الغطاء من الطفو. قم بتشغيل المنظف بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة.
اشطف مكونات الحجرة في حمام مائي لمدة 30 ثانية على الأقل قبل نقل مكونات الحجرة إلى محطة التجفيف. لبدء التجفيف ، ضع مسدس الهواء بما يتماشى مع أخدود الفتحة العلوية للغرفة ، واضغط على زناد البندقية لتوزيع الهواء لمدة 30 ثانية تقريبا. أدر مسدس الهواء نحو الفوهات العلوية للغرفة ، وبعد الضغط على الزناد ، تتبع ببطء ثلاث دوائر كاملة لكل مدخل فوهة.
ضع مسدس الهواء في وسط BTE ، وبدءا من النقطة الأعمق ، اضغط على الزناد لأسفل وتحرك حتى يشير مسدس الهواء نحو الشريحة. قم بتشغيل الهواء بسرعة على الحجرة بأكملها من الأمام والخلف لإزالة المياه السطحية من الخارج. أشارت المقارنة بين BTE وبروتوكول المختبر التقليدي لمعالجة أنسجة الحمضيات إلى أن تركيزات الحمض النووي المستخرجة المحددة بقياس الامتصاص عند 260 نانومتر في كلتا الحالتين كانت قابلة للمقارنة.
تم تحديد نقاء الأحماض النووية المستخرجة بواسطة BTE حيث كانت نسبة الامتصاص عند 260 و 280 نانومتر عالية مع تلوث منخفض بالبروتين. كانت سلامة الحمض النووي التي تم تحليلها بواسطة RT-qPCR التي تستهدف mRNA لجين نازعة هيدروجين الحمضيات NADH متشابهة جدا لكل من BTE والبروتوكول اليدوي القياسي. تطلب الإجراء المعملي التقليدي ما يقرب من سبع إلى 10 دقائق للتقطيع اليدوي لكل عينة ، والمزيد من الوقت لمعالجة الأنسجة ، بما في ذلك التجفيف بالتجميد والطحن والطرد المركزي.
ومع ذلك، قام بنك تونس و باكستان بمعالجة كل عينة لاستخراج الحمض النووي في ثلاث دقائق، بما في ذلك خطوات التحضير والوزن والتنظيف. لم تنتج أي من العينات الصحية ال 72 من معالجة عينات BTE الأولى منحنيات تضخيم لمسببات الأمراض الحمضية التي تم اختبارها ، وبالتالي التحقق من صحة معالجة BTE لأنسجة الحمضيات. في المعالجة الثانية لعينة BTE ، مع عينتين مصابتين بالمزيج ، أظهرت الأحماض النووية المستخرجة وجود فيروسات حمضيات وفيروسات مختلفة في الدفعتين الأولى والخامسة.
ومع ذلك ، لم يتم الكشف عن أي تلوث متبادل بين الرؤوس ، أو نتائج إيجابية كاذبة ، أو سلبية. أثناء المعالجة ، قد يؤدي ترك الفرع في مكان واحد لفترة طويلة جدا إلى قطع عمق الفرع ، مما يزيد من فرص الانسداد ، وجمع المواد الليفية اللاخلوية. بمجرد معالجتها ، تكون المادة جاهزة لمعظم بروتوكول استخراج وتنقية الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، ويمكن اختبارها باستخدام أي مقايسة للكشف الجزيئي عن مسببات الأمراض النباتية.
فتح تطوير مستخرج الأنسجة Budwood الباب أمام منطقة عالية الإنتاجية وفحص واسع للبستان. جنبا إلى جنب مع مستخرج أنسجة الأوراق ، فإنه يسمح بمعالجة الأنسجة النباتية على نطاق واسع والتي كانت تعتبر في السابق صعبة المعالجة ، مثل الجذور والسويقات.
