A técnica demonstrada utiliza um instrumento de baixo custo para processar rapidamente o tecido cítrico rico em floema, eliminando a necessidade de protocolos de trabalho intensivo e equipamentos laboratoriais especializados. Isso permite a rápida detecção e gerenciamento a jusante de viróides, vírus e bactérias cítricas. Este método poderia aumentar a produtividade e melhorar a qualidade e a uniformidade dos serviços de teste, beneficiando a indústria citrícola e potencialmente auxiliando no diagnóstico e tratamento de doenças em viveiros e operações de campo.
Plantas cítricas são infectadas por patógenos, causando perdas econômicas significativas em todo o mundo. Técnicas avançadas de detecção de patógenos, como o Budwood Tissue Extractor, ou BTE, são necessárias para produzir materiais propagativos testados por patógenos para a produção de árvores em larga escala. Embora testado e validado com amostras de citros, o método pode ser aplicado em laboratórios de diagnóstico e operações de campo para muitas outras culturas.
Os iniciantes que realizam essa técnica devem se familiarizar com o protocolo, seguir as instruções com precisão e ser pacientes. Para começar, use o aplicativo de telefone Test Tracker para selecionar uma árvore e manter uma etiqueta de coleira NFC (Near-Field Communication, ou NFC) no telefone para carregar as informações da árvore na tag. Insira de três a quatro amostras de broto cítrico no porta-sacos plásticos compatível com Budwood Tissue Extractor, ou BTE, e feche-o com o clipe.
Depois de garantir a qualidade da amostra seguindo as etapas descritas no texto, use o Test Tracker do aplicativo de telefone para digitalizar a etiqueta de colar NFC da árvore e vinculá-la à tag de clipe NFC no saco de amostra. Dentro de um exaustor de fumaça devidamente desinfetado, vire o interruptor na parte de trás da base do extrator de tecido. Certifique-se de que o interruptor no lado esquerdo da caixa está pressionado na parte superior e aguarde até que o LED verde piscando indique que a câmara está pronta.
Para preparar a câmara BTE, fixe um saco de amostra vazio na parte de trás da câmara, prendendo-o ao bocal traseiro usando um O-ring. Inspecione a lâmina em busca de sinais de desgaste ou danos, como cortes na lâmina que continuam no plástico ou cortes na ponta. Certifique-se de que a seta na lâmina esteja alinhada com o símbolo de bloqueio único e que a liberação de ar na parte inferior da câmara esteja voltada para o símbolo O.
Coloque a tampa transparente sobre a abertura da câmara. Usando a pista à direita da câmara, deslize o escorregador BTE claro para a câmara, empurrando a trava no fundo da câmara até onde puder ir para o slide. Verifique se a tampa do êmbolo está montada na parte superior da corrediça.
Para carregar a câmara BTE na base BTE, coloque a câmara preparada na base com o bocal de base BTE saliente na parte de trás da câmara. Carregue a amostra na base BTE movendo o adesivo branco na etiqueta do clipe NFC em movimento circular lento para um Z no lado direito da caixa até que a luz amarela comece a piscar. Depois de fixar a amostra à base, certifique-se de que o saco de amostra não tem furos.
Em seguida, coloque o O-ring sobre o saco de amostra para prendê-lo à frente do bico BTE. Para carregar o conjunto de seringas não utilizado, primeiro, rasgue o conjunto de seringas. Em seguida, coloque a seringa não utilizada colocada na torre da balança.
Remova o conjunto de seringas quando uma luz vermelha começar a piscar ou a escala exibir zero. Retire o êmbolo com o filtro da seringa, garantindo que o líquido permaneça na seringa inferior. Coloque o êmbolo sobre um papel toalha, ou a torre, onde não está tocando nenhuma superfície.
Finalmente, conecte a seringa à porta de saída deslizante pressionando a porta de saída na seringa e girando-a 90 graus. Para começar a processar a amostra de madeira de gema, pressione o botão preto superior para iniciar a máquina. Pegue um palito de madeira do saco e coloque-o na parte superior do bico BTE.
Pegue o palito de madeira do outro lado da câmara com a outra mão e lentamente desça na lâmina. Mova lentamente a madeira de botão para frente e para trás enquanto a gira. Quando um leve zumbido for ouvido, mova o galho mais profundamente na máquina para se concentrar no floema.
Depois de concluir o mesmo para todas as ramificações, pressione o botão preto superior para interromper o processamento e aguarde até que a luz comece a piscar amarela novamente. Para verificar o peso da amostra, gire a seringa 90 graus e puxe-a para baixo. Coloque o êmbolo de volta na seringa e coloque a seringa na torre.
Depois que a balança detecta automaticamente a amostra, um LED verde piscando indica que o peso da amostra está dentro da faixa adequada. Se a luz vermelha piscar, indicando um peso de amostra muito baixo, repita o processamento da amostra. Se o peso for muito alto, remova algumas amostras e o piscar do LED amarelo ficará mais lento.
Para homogeneizar a amostra, retire o êmbolo da seringa que contém a amostra. Empurre o líquido para dentro da seringa e insira o êmbolo de volta. Empurre o êmbolo para passar o tampão e plantar seiva através do filtro de malha através do tubo de borracha para a seringa vazia.
Misture a amostra empurrando o tampão e a seiva da planta para frente e para trás três a quatro vezes de uma seringa para outra até que a amostra se transforme em um líquido verde homogêneo. Uma vez bem homogeneizada, empurre a amostra de seiva vegetal para dentro da seringa sem o filtro de malha e retire o tubo de borracha e a seringa com o filtro. Em seguida, expulse a amostra de seiva da planta da seringa para um tubo de microcentrífuga estéril de dois mililitros.
Depois de rotular a amostra com o número do saco utilizando um marcador permanente, guarde-os a menos 20 graus Celsius até nova utilização. Higienize a câmara removível do BTE depois que a 10ª amostra for processada e o LED verde continuar piscando em vez de mudar para azul. Para desmontar a câmara e limpar todos os contaminantes, remova a tampa de plástico transparente, a lâmina da câmara transparente e a porta de entupimento na corrediça da câmara.
Em seguida, gire a válvula de liberação de ar na parte inferior da câmara para a marca de cadeado aberto. Depois de colocar os componentes da câmara no limpador ultrassônico de configuração, coloque a câmara no banho com a tampa embaixo para evitar que a tampa flutue. Execute o limpador ultra-sônico por 15 minutos.
Enxaguar os componentes da câmara em banho-maria por pelo menos 30 segundos antes de mover os componentes da câmara para a estação de secagem. Para iniciar a secagem, posicione a pistola de ar em linha com o sulco da abertura superior da câmara e pressione o gatilho da pistola para distribuir ar por cerca de 30 segundos. Gire a pistola de ar em direção aos bicos superiores da câmara e, depois de pressionar o gatilho, trace lentamente três círculos completos de cada entrada do bico.
Posicione a pistola de ar no centro do BTE e, a partir do ponto mais interno, segure o gatilho para baixo e mova-se até que a pistola de ar aponte em direção ao deslizamento. Passe rapidamente o ar por toda a frente e verso da câmara para tirar a água da superfície do exterior. A comparação entre o BTE e o protocolo laboratorial convencional para processamento de tecidos cítricos indicou que as concentrações de ácidos nucleicos extraídos, determinadas pela medida de absorbância a 260 nanômetros, em ambos os casos, foram comparáveis.
A pureza dos ácidos nucléicos extraídos pelo BTE, determinada como a razão das absorbâncias a 260 e 280 nanômetros, foi alta com baixa contaminação proteica. A integridade do ácido nucleico analisada por RT-qPCR visando o RNAm do gene da NADH desidrogenase dos citros foi muito semelhante tanto para o BTE quanto para o protocolo manual padrão. O procedimento de laboratório convencional exigiu quase sete a 10 minutos para o corte manual por amostra, e mais tempo para o processamento de tecidos, incluindo liofilização, moagem e centrifugação.
No entanto, o BTE processou cada amostra para uma extração de ácido nucleico em três minutos, incluindo as etapas de preparação, pesagem e limpeza. Nenhuma das 72 amostras saudáveis do primeiro processamento de amostras de BTE produziu curvas de amplificação para os patógenos dos citros testados, validando assim o processamento BTE do tecido cítrico. No segundo processamento da amostra BTE, com duas amostras infectadas com mistura introduzida, os ácidos nucleicos extraídos mostraram a presença de diferentes vírus e viróides dos citros nos lotes um e cinco.
No entanto, não foram detectadas contaminação cruzada entre as cabeças, falso-positivo ou negativo. Durante o processamento, deixar o galho em um lugar por muito tempo pode cortar muito fundo no ramo, aumentando as chances de entupimento e coletando material fibroso acelular. Uma vez processado, o material está pronto para a maioria dos protocolos de extração e purificação de DNA e RNA, e pode ser testado com qualquer ensaio de detecção molecular para fitopatógenos.
O desenvolvimento do Extrator de Tecido Budwood abriu as portas para a área de alto rendimento e a triagem em todo o bosque. Juntamente com o Extrator de Tecido Foliar, permite o processamento em larga escala de tecidos vegetais que antes eram considerados difíceis de processar, como raízes e pedúnculos.
