La técnica demostrada utiliza un instrumento de bajo costo para procesar rápidamente tejido cítrico rico en floema, eliminando la necesidad de protocolos intensivos en mano de obra y equipos de laboratorio especializados. Esto permite una rápida detección y gestión posterior de viroides, virus y bacterias de los cítricos. Este método podría aumentar el rendimiento y mejorar la calidad y uniformidad de los servicios de análisis, lo que beneficiaría a la industria citrícola y podría ayudar a diagnosticar y tratar enfermedades en las operaciones de vivero y campo.
Las plantas de cítricos son infectadas por patógenos, causando importantes pérdidas económicas en todo el mundo. Las técnicas avanzadas de detección de patógenos, como el extractor de tejido de yemas o BTE, son necesarias para producir materiales propagativos probados contra patógenos para la producción de árboles a gran escala. Aunque se ha probado y validado con muestras de cítricos, el método se puede aplicar en laboratorios de diagnóstico y operaciones de campo para muchos otros cultivos.
Los principiantes que realizan esta técnica deben familiarizarse con el protocolo, seguir las instrucciones con precisión y ser pacientes. Para comenzar, use la aplicación de teléfono Test Tracker para seleccionar un árbol y sostenga una etiqueta de collar de comunicación de campo cercano, o NFC, en el teléfono para cargar la información del árbol en la etiqueta. Inserte de tres a cuatro muestras de yemas de cítricos en el extractor de tejidos de yemas o BTE, compatible con el transportador de bolsas de plástico compatible con el extractor de tejidos de yemas de yemas de yemas de cítricos, y ciérrelo con el clip.
Después de asegurarse de la calidad de la muestra siguiendo los pasos descritos en el texto, use la aplicación de teléfono Test Tracker para escanear la etiqueta de collar NFC del árbol y vincularla con la etiqueta de clip NFC en la bolsa de muestra. Dentro de una campana extractora debidamente desinfectada, accione el interruptor en la parte posterior de la base del extractor de tejidos. Asegúrese de que el interruptor en el lado izquierdo de la caja esté presionado hacia abajo en la parte superior y espere hasta que el LED verde parpadeante indique que la cámara está lista.
Para preparar la cámara BTE, coloque una bolsa de muestra vacía en la parte posterior de la cámara asegurándola a la boquilla posterior con una junta tórica. Inspeccione la hoja en busca de signos de desgaste o daños, como cortes en la hoja que continúan en el plástico o cortes en la punta. Asegúrese de que la flecha de la cuchilla esté alineada con el símbolo de bloqueo único y que la liberación de aire en la parte inferior de la cámara esté girada hacia el símbolo O.
Coloque la tapa transparente sobre la abertura de la cámara. Usando el riel a la derecha de la cámara, deslice el portaobjetos BTE transparente sobre la cámara, empujando la cerradura en la parte inferior de la cámara hasta donde pueda entrar en el portaobjetos. Asegúrese de que la tapa del émbolo esté montada en la parte superior de la guía.
Para cargar la cámara BTE en la base BTE, coloque la cámara preparada en la base con la boquilla de la base BTE sobresaliendo en la parte posterior de la cámara. Cargue la muestra en la base BTE moviendo la pegatina blanca de la etiqueta de clip NFC con un movimiento circular lento a una Z en el lado derecho de la caja hasta que la luz amarilla comience a parpadear. Después de colocar la muestra en la base, asegúrese de que la bolsa de muestra no tenga agujeros.
A continuación, coloque la junta tórica sobre la bolsa de muestra para asegurarla a la parte delantera de la boquilla BTE. Para cargar el juego de jeringas no utilizado, primero, rasgue el juego de jeringas. A continuación, coloque el juego de jeringas no utilizado en la torre de la báscula.
Retire el juego de jeringas cuando una luz roja comience a parpadear o la báscula muestre cero. Retire el émbolo con el filtro de la jeringa mientras se asegura de que el líquido permanezca en la jeringa inferior. Coloque el émbolo sobre una toalla de papel o la torre, donde no toque ninguna superficie.
Finalmente, conecte la jeringa al puerto de salida de la corredera presionando el puerto de salida en la jeringa y girándolo 90 grados. Para comenzar a procesar la muestra de yema, presione el botón negro superior para iniciar la máquina. Toma un palo de yema de la bolsa y colócalo a través de la parte superior de la boquilla BTE.
Agarra el palo de madera del otro lado de la cámara con la otra mano y baja lentamente hacia la hoja. Mueva lentamente la yema hacia adelante y hacia atrás mientras la gira. Cuando se escuche un ligero zumbido, mueva la rama más adentro de la máquina para enfocarse en el floema.
Después de completar lo mismo para todas las ramas, presione el botón negro superior para detener el procesamiento y espere a que la luz comience a parpadear en amarillo nuevamente. Para verificar el peso de la muestra, gire la jeringa 90 grados y tire de ella hacia abajo. Vuelva a colocar el émbolo en la jeringa y coloque la jeringa en la torre.
Después de que la báscula detecta automáticamente la muestra, un LED verde parpadea indica que el peso de la muestra está dentro del rango adecuado. Si la luz roja parpadea, lo que indica un peso de muestra demasiado bajo, repita el procesamiento de la muestra. Si el peso es demasiado alto, retire algunas muestras y el parpadeo del LED amarillo se volverá más lento.
Para homogeneizar la muestra, retire el émbolo de la jeringa que contiene la muestra. Empuje el líquido dentro de la jeringa e inserte el émbolo nuevamente. Empuje el émbolo para pasar el tampón y la savia de la planta a través del filtro de malla a través del tubo de goma hacia la jeringa vacía.
Mezcle la muestra empujando el tampón y la savia de la planta hacia adelante y hacia atrás tres o cuatro veces de una jeringa a otra hasta que la muestra se convierta en un líquido verde homogéneo. Una vez bien homogeneizada, empuje la muestra de savia vegetal en la jeringa sin el filtro de malla y separe el tubo de goma y la jeringa con el filtro. A continuación, expulse la muestra de savia de la planta de la jeringa a un tubo de microcentrífuga estéril de dos mililitros.
Después de etiquetar la muestra con el número de bolsa con un marcador permanente, guárdela a menos 20 grados centígrados hasta su uso posterior. Desinfecte la cámara extraíble BTE después de procesar la 10ª muestra y el LED verde continúe parpadeando en lugar de cambiar a azul. Para desmontar la cámara y limpiar todos los contaminantes, retire la cubierta de plástico transparente, la corredera transparente de la cámara y el puerto de obstrucción en la corredera de la cámara.
Luego gire la válvula de liberación de aire en la parte inferior de la cámara hasta la marca de candado abierto. Después de colocar los componentes de la cámara en el limpiador ultrasónico de configuración, coloque la cámara en el baño con la tapa debajo para evitar que la tapa flote. Haga funcionar el limpiador ultrasónico durante 15 minutos.
Enjuague los componentes de la cámara en el baño de agua durante al menos 30 segundos antes de mover los componentes de la cámara a la estación de secado. Para comenzar a secar, coloque la pistola de aire comprimido en línea con la ranura de la abertura superior de la recámara y presione el gatillo de la pistola para dispensar aire durante unos 30 segundos. Gire la pistola de aire hacia las boquillas superiores de la cámara y, después de presionar el gatillo, trace lentamente tres círculos completos de cada entrada de la boquilla.
Coloque la pistola de aire comprimido en el centro de la BTE y, comenzando desde el punto más interno, mantenga presionado el gatillo y muévase hasta que la pistola de aire apunte hacia la corredera. Deje correr aire rápidamente por toda la cámara por delante y por detrás para sacar el agua de la superficie del exterior. La comparación del BTE y el protocolo de laboratorio convencional para el procesamiento de tejidos cítricos indicó que las concentraciones de ácidos nucleicos extraídos determinadas mediante la medición de la absorbancia a 260 nanómetros en ambos casos fueron comparables.
La pureza de los ácidos nucleicos extraídos por el BTE, determinada como la relación de las absorbancias a 260 y 280 nanómetros, fue alta con baja contaminación proteica. La integridad de los ácidos nucleicos analizada por RT-qPCR dirigida al ARNm del gen de la NADH deshidrogenasa cítrica fue muy similar tanto para el BTE como para el protocolo manual estándar. El procedimiento de laboratorio convencional requería de casi siete a 10 minutos para el picado manual por muestra, y más tiempo para el procesamiento de tejidos, incluida la liofilización, la molienda y la centrifugación.
Sin embargo, el BTE procesó cada muestra para una extracción de ácido nucleico en tres minutos, incluidos los pasos de preparación, pesaje y limpieza. Ninguna de las 72 muestras sanas del primer procesamiento de muestras de BTE produjo curvas de amplificación para los patógenos de los cítricos analizados, lo que validó el procesamiento de BTE del tejido de los cítricos. En el segundo procesamiento de muestras de BTE, con dos muestras infectadas de mezcla introducidas, los ácidos nucleicos extraídos mostraron la presencia de diferentes virus y viroides de cítricos en los lotes uno y cinco.
Sin embargo, no se detectó contaminación cruzada entre cabezas, ni resultados falsos positivos o negativos. Durante el procesamiento, dejar la rama en un lugar durante demasiado tiempo podría cortar demasiado profundo en la rama, lo que aumenta las posibilidades de obstrucción y acumulación de material fibroso acelular. Una vez procesado, el material está listo para la mayoría de los protocolos de extracción y purificación de ADN y ARN, y se puede probar con cualquier ensayo de detección molecular de patógenos vegetales.
El desarrollo del extractor de tejido de yemas abrió la puerta a la detección de áreas de alto rendimiento y en toda la arboleda. Junto con el extractor de tejido foliar, permite procesar a gran escala tejidos vegetales que antes se consideraban difíciles de procesar, como raíces y pedúnculos.
