В демонстрируемой методике используется недорогой инструмент для быстрой обработки богатой флоэмой цитрусовой ткани, что устраняет необходимость в трудоемких протоколах и специализированном лабораторном оборудовании. Это позволяет быстро обнаруживать и контролировать вироиды, вирусы и бактерии цитрусовых. Этот метод может увеличить пропускную способность и улучшить качество и единообразие услуг по тестированию, что принесет пользу цитрусовой промышленности и потенциально поможет в диагностике и лечении заболеваний в питомниках и полевых условиях.
Цитрусовые растения заражены возбудителем, что наносит значительный экономический ущерб во всем мире. Передовые методы обнаружения патогенов, такие как экстрактор тканей Budwood или BTE, необходимы для производства протестированных на патогены материалов для размножения для крупномасштабного производства деревьев. Несмотря на то, что метод протестирован и валидирован на образцах цитрусовых, он может применяться в диагностических лабораториях и на полевых работах для многих других культур.
Новички, выполняющие эту технику, должны ознакомиться с протоколом, точно следовать инструкциям и запастись терпением. Для начала используйте приложение для телефона Test Tracker, чтобы выбрать дерево и прикрепить к телефону бирку NFC, чтобы загрузить информацию о дереве на метку. Вставьте три-четыре образца цитрусовых почек в совместимый с Budwood Tissue Extractor или BTE-держатель пластикового пакета и закройте его зажимом.
Убедившись в качестве образца, выполнив шаги, описанные в тексте, используйте приложение для телефона Test Tracker, чтобы отсканировать NFC-бирку на ошейнике дерева и связать ее с NFC-биркой на пакете с образцом. Внутри должным образом продезинфицированного вытяжного шкафа щелкните переключателем на задней стороне основания экстрактора тканей. Убедитесь, что переключатель на левой стороне коробки нажат сверху, и подождите, пока мигающий зеленый светодиод не укажет на готовность камеры.
Чтобы подготовить заушную камеру, прикрепите пустой пакет для образцов к задней части камеры, закрепив его на заднем сопле с помощью уплотнительного кольца. Осмотрите лезвие на наличие признаков износа или повреждений, таких как порезы на лезвии, переходящие в пластик, или порезы на кончике. Убедитесь, что стрелка на лезвии совпадает с символом одиночного замка, а выпуск воздуха в нижней части камеры повернут в сторону символа O.
Накройте отверстие камеры прозрачной крышкой. Используя направляющую справа от патронника, наденьте прозрачный заушной затвор на патронник, надавливая на замок в нижней части патронника до упора, насколько он может войти в затвор. Убедитесь, что крышка плунжера установлена в верхней части затвора.
Чтобы загрузить заушную камеру на заушное основание, поместите подготовленную камеру на основание так, чтобы сопло заушного основания выступало в заднюю часть камеры. Загрузите образец на заушное основание, медленно перемещая белую наклейку на метке зажима NFC к букве Z на правой стороне коробки, пока не начнет мигать желтый индикатор. После прикрепления образца к основанию убедитесь, что в пакете для образцов нет отверстий.
Затем поместите уплотнительное кольцо на пакет для образцов, чтобы закрепить его на передней части заушного сопла. Чтобы загрузить неиспользованный набор шприцев, сначала разорвите набор шприцев. Затем поместите неиспользованный набор шприцев на башню весов.
Извлеките набор шприцев, когда начнет мигать красный индикатор или шкала покажет ноль. Снимите поршень с фильтром из шприца, следя за тем, чтобы жидкость оставалась в нижнем шприце. Поместите вантуз на бумажное полотенце или башню так, чтобы он не касался какой-либо поверхности.
Наконец, прикрепите шприц к выходному отверстию, вдавливая выходное отверстие в шприц и поворачивая его на 90 градусов. Чтобы начать обработку образца почковой древесины, нажмите верхнюю черную кнопку, чтобы запустить машину. Возьмите одну палочку из пакета и проденьте ее через верхнюю часть заушной насадки.
Возьмитесь другой рукой за палку из почек с другой стороны камеры и медленно опуститесь на лезвие. Медленно перемещайте почки вперед и назад, вращая их. Когда услышите легкое жужжание, переместите ветку глубже в машину, чтобы сосредоточиться на флоэме.
Выполнив то же самое для всех ветвей, нажмите верхнюю черную кнопку, чтобы остановить обработку, и подождите, пока индикатор снова начнет мигать желтым. Чтобы проверить вес образца, поверните шприц на 90 градусов и потяните его вниз. Установите поршень обратно на шприц и поместите шприц на башню.
После того, как весы автоматически определят образец, зеленый светодиод начнет мигать, указывая на то, что вес образца находится в правильном диапазоне. Если красный индикатор мигает, указывая на слишком низкий вес образца, повторите обработку образца. Если вес слишком высок, удалите некоторые образцы, и мигание желтого светодиода станет медленнее.
Для гомогенизации образца снимите поршень со шприца, содержащего образец. Протолкните жидкость в шприц и вставьте поршень обратно. Нажмите на поршень, чтобы пропустить буфер и сок растений через сетчатый фильтр через резиновую трубку в пустой шприц.
Перемешайте образец, проталкивая буфер и растительный сок взад и вперед три-четыре раза из одного шприца в другой, пока образец не превратится в однородную зеленую жидкость. После хорошей гомогенизации поместите образец растительного сока в шприц без сетчатого фильтра и отсоедините от него резиновую трубку и шприц с фильтром. Затем извлеките образец сока растения из шприца в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом два миллилитра.
После маркировки образцов номером пакета с помощью перманентного маркера храните их при температуре минус 20 градусов Цельсия до дальнейшего использования. Продезинфицируйте съемную камеру заушки после обработки 10-го образца, и зеленый светодиод продолжит мигать, а не изменится на синий. Чтобы разобрать камеру и очистить ее от всех загрязнений, снимите прозрачную пластиковую крышку, прозрачную заслонку камеры и отверстие для засорения на затворе камеры.
Затем поверните клапан выпуска воздуха в нижней части камеры до метки открытого навесного замка. После помещения компонентов камеры в установочную ультразвуковую ванну поместите камеру в ванну крышкой под ней, чтобы крышка не всплыла. Запустите ультразвуковой очиститель на 15 минут.
Промойте компоненты камеры на водяной бане не менее 30 секунд, прежде чем перемещать компоненты камеры на станцию сушки. Чтобы начать сушку, расположите пневматический пистолет на одной линии с канавкой верхнего отверстия патронника и нажмите на спусковой крючок пистолета, чтобы выпустить воздух примерно на 30 секунд. Поверните пневматический пистолет в сторону верхних сопел патронника, и после нажатия на спусковой крючок медленно проведите три полных круга входа в каждое сопло.
Расположите пневматический пистолет в центре заушного пистолета и, начиная с самой внутренней точки, удерживайте спусковой крючок и двигайтесь до тех пор, пока пневматический пистолет не направится к затвору. Быстро пропустите воздух по всей камере спереди и сзади, чтобы удалить поверхностную воду снаружи. Сравнение заушного и общепринятого лабораторного протокола обработки тканей цитрусовых показало, что концентрации экстрагированных нуклеиновых кислот, определенные путем измерения абсорбции на длине волны 260 нм, в обоих случаях были сопоставимы.
Чистота нуклеиновых кислот, экстрагированных с помощью заушного аппарата, определяемая как соотношение абсорбции на 260 и 280 нм, была высокой при низкой белковой контаминации. Целостность нуклеиновых кислот, проанализированная методом ОТ-кПЦР, нацеленной на мРНК гена цитрусовой НАДН-дегидрогеназы, была очень похожа как для заушной фразы, так и для стандартного ручного протокола. Традиционная лабораторная процедура требовала от 7 до 10 минут для ручного измельчения образца и больше времени для обработки тканей, включая сублимационную сушку, измельчение и центрифугирование.
Тем не менее, BTE обрабатывал каждый образец для экстракции нуклеиновой кислоты в течение трех минут, включая этапы подготовки, взвешивания и очистки. Ни один из 72 здоровых образцов, полученных при первой обработке заушных пробы, не дал кривых амплификации для протестированных цитрусовых патогенов, тем самым подтверждая заушную обработку ткани цитрусовых. При обработке второго заушного образца с двумя введенными смешанными зараженными образцами экстрагированные нуклеиновые кислоты показали наличие различных цитрусовых вирусов и вироидов в первой и пятой партиях.
Тем не менее, не было обнаружено перекрестного загрязнения между головами, а также ложноположительных или отрицательных результатов. Во время обработки, если оставить ветку на одном месте на слишком долгое время, это может привести к слишком глубокому врезанию ветки, что увеличит вероятность засорения и скопления бесклеточного волокнистого материала. После обработки материал готов к большинству протоколов экстракции и очистки ДНК и РНК и может быть протестирован с помощью любого молекулярного анализа на наличие патогенов растений.
Разработка экстрактора тканей Budwood открыла дверь к высокопроизводительному просеиванию в области и по всей роще. Наряду с экстрактором тканей листьев, он позволяет обрабатывать в больших масштабах растительные ткани, которые ранее считались сложными для обработки, такие как корни и цветоносы.
