実証された技術は、低コストの機器を使用して師部に富む柑橘類組織を迅速に処理し、労働集約的なプロトコルや特殊な実験装置の必要性を排除します。これにより、柑橘類のウイロイド、ウイルス、細菌の迅速なダウンストリーム検出と管理が可能になります。この方法は、スループットを向上させ、検査サービスの品質と均一性を向上させ、柑橘類産業に利益をもたらし、保育園や野外業務における病気の診断と治療に役立つ可能性があります。
柑橘類の植物は病原体に感染しており、世界中で重大な経済的損失を引き起こします。バッドウッド組織抽出器(BTE)などの高度な病原体検出技術は、大規模な樹木生産用の病原体テストされた繁殖材料を製造するために必要です。この方法は、柑橘類のサンプルでテストおよび検証されていますが、他の多くの作物の診断ラボや野外作業に適用できます。
このテクニックを実行する初心者は、プロトコルに精通し、指示に正確に従い、辛抱強く待つ必要があります。まず、電話アプリのテストトラッカーを使用してツリーを選択し、近距離無線通信(NFC)カラータグを電話に保持して、ツリー情報をタグにロードします。3〜4個の柑橘類のつぼみサンプルをバッドウッドティッシュエクストラクター(BTE)互換のビニール袋キャリアに挿入し、クリップで閉じます。
本文に記載されている手順に従ってサンプルの品質を確認した後、電話アプリのテストトラッカーを使用してツリーのNFCカラータグをスキャンし、サンプルバッグのNFCクリップタグにリンクします。適切に消毒されたドラフト内で、組織抽出ベースの背面にあるスイッチを切り替えます。ボックスの左側にあるスイッチの上部が押されていることを確認し、緑色のLEDが点滅してチャンバーの準備ができていることを示すまで待ちます。
BTEチャンバーを準備するには、空のサンプルバッグをOリングを使用してバックノズルに固定し、チャンバーの背面に取り付けます。ブレードに摩耗や損傷の兆候がないか(ブレードの切り込みがプラスチックに続いている、または先端に切り傷があるなど)がないか調べます。ブレードの矢印が単一のロック記号と一致し、チャンバーの下部にある空気放出がO記号に向かっていることを確認します。
チャンバーの開口部に透明な蓋を置きます。チャンバーの右側にあるトラックを使用して、透明なBTEスライドをチャンバーにスライドさせ、チャンバーの下部にあるロックをスライドに入ることができるまで押し込みます。プランジャーキャップがスライドの上部に取り付けられていることを確認します。
BTEチャンバーをBTEベースにロードするには、BTEベースノズルをチャンバーの背面に突き出して、準備したチャンバーをベースに置きます。黄色のライトが点滅し始めるまで、NFCクリップタグの白いステッカーをゆっくりと円を描くようにボックスの右側のZに移動して、サンプルをBTEベースにロードします。サンプルをベースに取り付けた後、サンプルバッグに穴がないことを確認します。
次に、Oリングをサンプルバッグの上に置き、BTEノズルの前面に固定します。未使用のシリンジセットをロードするには、まずシリンジセットを引き裂きます。次に、未使用のシリンジセットを体重計タワーに置きます。
赤いライトが点滅し始めたとき、またはスケールがゼロと表示されたら、シリンジセットを取り外します。液体が下部のシリンジに残っていることを確認しながら、フィルター付きのプランジャーをシリンジから取り外します。プランジャーをペーパータオルまたはタワーの上に置いて、表面に触れないようにします。
最後に、出口ポートをシリンジに押し込み、90度回転させて、シリンジをスライド出口ポートに取り付けます。バッドウッドサンプルの処理を開始するには、上部の黒いボタンを押してマシンを起動します。バッグから1本のバッドウッドスティックをつかみ、BTEノズルの上部に通します。
もう一方の手でチャンバーの反対側にあるつぼみの棒をつかみ、ゆっくりとブレードにインチダウンします。つぼみを回転させながらゆっくりと前後に動かします。わずかなブーンという音が聞こえたら、枝を機械の奥深くに移動して師部に焦点を合わせます。
すべてのブランチで同じことを完了したら、上部の黒いボタンを押して処理を停止し、ライトが再び黄色に点滅し始めるのを待ちます。サンプルの重量を確認するには、シリンジを90度回転させて引き下げます。プランジャーをシリンジに戻し、シリンジをタワーに置きます。
スケールがサンプルを自動検出した後、緑色のLEDが点滅し、サンプルの重量が適切な範囲内にあることを示します。サンプル重量が低すぎることを示す赤いライトが点滅する場合は、サンプル処理を繰り返します。重量が高すぎる場合は、いくつかのサンプルを取り除くと、黄色のLEDの点滅が遅くなります。
サンプルを均質化するには、サンプルが入っているシリンジからプランジャーを取り外します。液体をシリンジに押し込み、プランジャーを戻します。プランジャーを押してバッファーと植物の樹液をメッシュフィルターに通し、ゴムチューブを介して空のシリンジに入れます。
バッファーと植物樹液を、サンプルが均質な緑色の液体になるまで、あるシリンジから別のシリンジに3〜4回前後に押して、サンプルを混合します。十分に均質化されたら、メッシュフィルターなしで植物樹液サンプルをシリンジに押し込み、ゴムチューブとフィルター付きのシリンジをそこから取り外します。次に、植物樹液サンプルをシリンジから2ミリリットルの滅菌マイクロ遠心チューブに排出します。
永久マーカーを使用してサンプルにバッグ番号をラベル付けした後、さらに使用するまで摂氏マイナス20度で保管してください。10番目のサンプルが処理された後、BTE取り外し可能なチャンバーを消毒し、緑色のLEDが青色に変わるのではなく点滅し続けます。チャンバーを分解してすべての汚染物質を清掃するには、透明なプラスチックカバー、透明なチャンバースライド、およびチャンバースライドの詰まりポートを取り外します。
次に、チャンバーの下部にあるエアリリースバルブを開いている南京錠のマークに回します。チャンバーコンポーネントをセットアップ超音波洗浄機に入れた後、蓋が浮かないように蓋を下にしてチャンバーをバスに入れます。超音波洗浄機を15分間実行します。
チャンバーコンポーネントを水浴で少なくとも30秒間すすぎ、チャンバーコンポーネントを乾燥ステーションに移動します。乾燥を開始するには、エアガンをチャンバーの上部開口部の溝に沿って配置し、ガンのトリガーを押して約30秒間空気を分配します。エアガンをチャンバーの上部ノズルに向け、トリガーを押した後、各ノズル入口の3つの完全な円をゆっくりとトレースします。
エアガンをBTEの中央に配置し、最も内側のポイントからトリガーを押したまま、エアガンがスライドの方を向くまで移動します。チャンバーの前面と背面全体にすばやく空気を流して、表面の水を外部から取り除きます。柑橘類組織処理のためのBTEと従来の実験室プロトコルとの比較は、両方の場合において260ナノメートルの吸光度を測定することによって決定された抽出核酸濃度が同等であることを示した。
260ナノメートルと280ナノメートルの吸光度の比として決定されたBTEによって抽出された核酸の純度は、タンパク質汚染が低く、高かった。柑橘類NADHデヒドロゲナーゼ遺伝子のmRNAを標的とするRT-qPCRによって分析された核酸完全性は、BTEと標準的な手動プロトコルの両方で非常に類似していました。従来のラボ手順では、サンプルごとに手でチョッピングするのに約7〜10分かかり、凍結乾燥、粉砕、遠心分離などの組織処理により多くの時間が必要でした。
ただし、BTEは、核酸抽出のために各サンプルを、準備、計量、および洗浄のステップを含めて3分で処理しました。最初のBTEサンプル処理からの72の健康なサンプルのいずれも、テストされた柑橘類病原体の増幅曲線を生成しなかったため、柑橘類組織のBTE処理が検証されました。2回目のBTEサンプル処理では、2つのミックス感染サンプルを導入し、抽出された核酸は、バッチ1および5で異なる柑橘類ウイルスおよびウイロイドの存在を示した。
ただし、ヘッド間の相互汚染、偽陽性、または陰性の結果は検出されませんでした。処理中、枝を1か所に長時間置いたままにしておくと、枝に深く切り込みすぎて、目詰まりの可能性が高くなり、無細胞繊維材料が収集される可能性があります。処理が完了すると、材料はほとんどのDNAおよびRNA抽出および精製プロトコルの準備が整い、植物病原体の分子検出アッセイでテストできます。
バッドウッド組織抽出器の開発により、ハイスループットエリアとグローブ全体のスクリーニングへの扉が開かれました。葉組織抽出器とともに、根や花柄など、以前は処理が困難とされていた植物組織を大規模に処理することができます。
