Die demonstrierte Technik verwendet ein kostengünstiges Instrument zur schnellen Verarbeitung von phloemreichem Zitrusgewebe, wodurch arbeitsintensive Protokolle und spezielle Laborgeräte überflüssig werden. Dies ermöglicht eine schnelle nachgelagerte Erkennung und Behandlung von Zitrusviroiden, Viren und Bakterien. Diese Methode könnte den Durchsatz erhöhen und die Qualität und Einheitlichkeit der Testdienstleistungen verbessern, was der Zitrusindustrie zugute kommt und möglicherweise bei der Diagnose und Behandlung von Krankheiten in Baumschulen und Feldbetrieben hilft.
Zitruspflanzen sind mit Krankheitserregern infiziert, die weltweit erhebliche wirtschaftliche Verluste verursachen. Fortschrittliche Techniken zum Nachweis von Krankheitserregern, wie der Budwood Tissue Extractor (HdO), sind notwendig, um pathogengetestetes Vermehrungsmaterial für die großflächige Baumproduktion herzustellen. Obwohl die Methode mit Zitrusproben getestet und validiert wurde, kann sie in diagnostischen Labors und Feldbetrieben für viele andere Kulturen angewendet werden.
Anfänger, die diese Technik anwenden, müssen sich mit dem Protokoll vertraut machen, die Anweisungen genau befolgen und geduldig sein. Verwenden Sie zunächst die Telefon-App Test Tracker, um einen Baum auszuwählen, und halten Sie einen NFC-Halsband-Tag (Near Field Communication) an das Telefon, um die Bauminformationen in den Tag zu laden. Legen Sie drei bis vier Zitrusblütenholzproben in den Budwood Tissue Extractor (HdO), kompatiblen Plastikbeutelträger und verschließen Sie ihn mit dem Clip.
Nachdem Sie die Qualität der Probe durch Befolgen der im Text beschriebenen Schritte sichergestellt haben, scannen Sie mit der Telefon-App Test Tracker das NFC-Halsband-Etikett des Baumes und verknüpfen Sie es mit dem NFC-Clip-Tag auf dem Probenbeutel. Legen Sie in einem ordnungsgemäß desinfizierten Abzug den Schalter auf der Rückseite des Gewebeabzugssockels um. Stellen Sie sicher, dass der Schalter auf der linken Seite der Box auf der Oberseite gedrückt ist, und warten Sie, bis die blinkende grüne LED anzeigt, dass die Kammer bereit ist.
Um die HdO-Kammer vorzubereiten, befestigen Sie einen leeren Probenbeutel an der Rückseite der Kammer, indem Sie ihn mit einem O-Ring an der hinteren Düse befestigen. Untersuchen Sie die Klinge auf Anzeichen von Verschleiß oder Beschädigungen, wie z. B. Schnitte an der Klinge, die in den Kunststoff eindringt, oder Schnitte an der Spitze. Stellen Sie sicher, dass der Pfeil auf der Klinge mit dem Symbol für eine einfache Verriegelung ausgerichtet ist und die Luftentlastung am Boden der Kammer in Richtung des O-Symbols gedreht ist.
Setzen Sie den durchsichtigen Deckel über die Kammeröffnung. Schieben Sie mit der Schiene auf der rechten Seite der Kammer den durchsichtigen HdO-Schlitten auf die Kammer und schieben Sie die Verriegelung am Boden der Kammer so weit wie möglich in die Kammer. Stellen Sie sicher, dass die Kolbenkappe auf der Oberseite des Objektträgers montiert ist.
Um die HdO-Kammer auf die HdO-Basis zu laden, stellen Sie die vorbereitete Kammer auf die Basis, wobei die Düse der HdO-Basis in die Rückseite der Kammer hineinragt. Laden Sie die Probe auf die HdO-Basis, indem Sie den weißen Aufkleber auf dem NFC-Clip-Tag in einer langsamen, kreisförmigen Bewegung zu einem Z auf der rechten Seite der Box bewegen, bis das gelbe Licht zu blinken beginnt. Nachdem Sie die Probe an der Basis befestigt haben, stellen Sie sicher, dass der Probenbeutel keine Löcher hat.
Legen Sie dann den O-Ring über den Probenbeutel, um ihn an der Vorderseite der HdO-Düse zu befestigen. Um das unbenutzte Spritzenset zu laden, zerreißen Sie zunächst das Spritzenset. Legen Sie dann das unbenutzte Spritzenset auf den Waagenturm.
Entfernen Sie das Spritzenset, wenn ein rotes Licht zu blinken beginnt oder die Waage Null anzeigt. Entfernen Sie den Kolben mit dem Filter aus der Spritze und stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit in der Bodenspritze verbleibt. Legen Sie den Kolben auf ein Papiertuch oder den Turm, wo er keine Oberfläche berührt.
Zum Schluss befestigen Sie die Spritze an der Austrittsöffnung des Objektträgers, indem Sie die Austrittsöffnung in die Spritze drücken und um 90 Grad drehen. Um mit der Verarbeitung der Knospenholzprobe zu beginnen, drücken Sie die obere schwarze Taste, um die Maschine zu starten. Nimm einen Knospenholzstab aus dem Beutel und stecke ihn durch die Oberseite der HdO-Düse.
Greife mit der anderen Hand den Knospenholzstab auf der anderen Seite der Kammer und schiebe ihn langsam in die Klinge. Bewegen Sie das Knospenholz langsam hin und her, während Sie es drehen. Wenn ein leichtes Summen zu hören ist, bewegen Sie den Zweig tiefer in die Maschine, um sich auf das Phloem zu konzentrieren.
Nachdem Sie das Gleiche für alle Zweige getan haben, drücken Sie die obere schwarze Taste, um die Verarbeitung zu stoppen, und warten Sie, bis das Licht wieder gelb zu blinken beginnt. Um das Probengewicht zu überprüfen, drehen Sie die Spritze um 90 Grad und ziehen Sie sie nach unten. Setzen Sie den Kolben wieder auf die Spritze und setzen Sie die Spritze auf den Turm.
Nachdem die Waage die Probe automatisch erkannt hat, zeigt eine blinkende grüne LED an, dass sich das Probengewicht im richtigen Bereich befindet. Wenn das rote Licht blinkt, was auf ein zu niedriges Probengewicht hinweist, wiederholen Sie die Probenverarbeitung. Wenn das Gewicht zu hoch ist, entfernen Sie einige Proben, und das Blinken der gelben LED wird langsamer.
Um die Probe zu homogenisieren, entfernen Sie den Kolben von der Spritze, die die Probe enthält. Drücken Sie die Flüssigkeit in die Spritze und setzen Sie den Kolben wieder ein. Drücken Sie den Kolben, um den Puffer und Pflanzensaft durch den Mesh-Filter über den Gummischlauch in die leere Spritze zu leiten.
Mischen Sie die Probe, indem Sie den Puffer und den Pflanzensaft drei- bis viermal von einer Spritze zur anderen hin und her schieben, bis sich die Probe in eine homogene grüne Flüssigkeit verwandelt. Sobald die Probe gut homogenisiert ist, drücken Sie die Pflanzensaftprobe ohne den Siebfilter in die Spritze und lösen Sie den Gummischlauch und die Spritze mit dem Filter davon. Anschließend wird die Pflanzensaftprobe aus der Spritze in ein zwei Milliliter großes steriles Mikrozentrifugenröhrchen ausgestoßen.
Nachdem Sie die Probe mit einem Permanentmarker mit der Beutelnummer beschriftet haben, lagern Sie sie bis zur weiteren Verwendung bei minus 20 Grad Celsius. Desinfizieren Sie die herausnehmbare HdO-Kammer, nachdem die 10. Probe verarbeitet wurde und die grüne LED weiter blinkt, anstatt blau zu werden. Um die Kammer zu demontieren und alle Verunreinigungen zu reinigen, entfernen Sie die durchsichtige Kunststoffabdeckung, den durchsichtigen Kammerschieber und die Verstopfungsöffnung am Kammerschieber.
Drehen Sie dann das Entlüftungsventil am Boden der Kammer auf die Markierung des geöffneten Vorhängeschlosses. Nachdem Sie die Kammerkomponenten in den Setup-Ultraschallreiniger eingesetzt haben, stellen Sie die Kammer mit dem Deckel darunter in das Bad, um ein Aufschwimmen des Deckels zu verhindern. Lassen Sie den Ultraschallreiniger 15 Minuten lang laufen.
Spülen Sie die Kammerkomponenten mindestens 30 Sekunden lang im Wasserbad, bevor Sie die Kammerkomponenten in die Trocknungsstation bringen. Um mit dem Trocknen zu beginnen, positionieren Sie die Luftpistole in einer Linie mit der Rille der oberen Öffnung der Kammer und drücken Sie den Abzug der Pistole, um etwa 30 Sekunden lang Luft abzugeben. Drehen Sie die Luftpistole in Richtung der oberen Düsen der Kammer und ziehen Sie nach dem Drücken des Abzugs langsam drei volle Kreise von jedem Düseneingang.
Positionieren Sie das Luftgewehr in der Mitte des HdO-Gewehrs, halten Sie den Abzug vom innersten Punkt aus gedrückt und bewegen Sie sich, bis das Luftgewehr in Richtung des Schlittens zeigt. Lassen Sie schnell Luft über die gesamte Kammer vorne und hinten laufen, um das Oberflächenwasser von außen zu entfernen. Der Vergleich des HdO-Protokolls mit dem konventionellen Laborprotokoll für die Verarbeitung von Zitrusgewebe zeigte, dass die extrahierten Nukleinsäurekonzentrationen, die durch Messung der Absorption bei 260 Nanometern bestimmt wurden, in beiden Fällen vergleichbar waren.
Die Reinheit der durch das HdO extrahierten Nukleinsäuren, bestimmt als Verhältnis der Absorptionen bei 260 und 280 Nanometern, war hoch bei geringer Proteinkontamination. Die Nukleinsäureintegrität, die mittels RT-qPCR analysiert wurde, die auf die mRNA des Zitrus-NADH-Dehydrogenase-Gens abzielte, war sowohl für HdO als auch für das manuelle Standardprotokoll sehr ähnlich. Das herkömmliche Laborverfahren erforderte fast sieben bis 10 Minuten für das manuelle Zerkleinern pro Probe und mehr Zeit für die Gewebeverarbeitung, einschließlich Gefriertrocknung, Mahlen und Zentrifugieren.
Das HdO verarbeitete jedoch jede Probe für eine Nukleinsäureextraktion in drei Minuten, einschließlich Vorbereitung, Wiegen und Reinigungsschritten. Keine der 72 gesunden Proben aus der ersten HdO-Probenverarbeitung erzeugte Amplifikationskurven für die getesteten Zitruspathogene, wodurch die HdO-Verarbeitung von Zitrusgewebe validiert wurde. In der zweiten HdO-Probenverarbeitung mit zwei eingeführten gemischten infizierten Proben zeigten die extrahierten Nukleinsäuren das Vorhandensein verschiedener Zitrusviren und Viroide in den Chargen eins und fünf.
Es wurden jedoch keine Kreuzkontaminationen zwischen den Köpfen oder falsch-positive oder negative Ergebnisse festgestellt. Wenn Sie den Ast während der Verarbeitung zu lange an einer Stelle lassen, kann dies zu tief in den Ast einschneiden, was die Wahrscheinlichkeit einer Verstopfung erhöht und azelluläres faseriges Material ansammelt. Nach der Verarbeitung ist das Material für die meisten DNA- und RNA-Extraktions- und Reinigungsprotokolle bereit und kann mit jedem molekularen Nachweisassay auf Pflanzenpathogene getestet werden.
Die Entwicklung des Knospenholz-Gewebeextraktors öffnete die Tür zu einem flächendeckenden und hainweiten Screening mit hohem Durchsatz. Zusammen mit dem Leaf Tissue Extractor ermöglicht er die Verarbeitung von Pflanzengeweben, die bisher als schwierig zu verarbeiten galten, wie z. B. Wurzeln und Stiele, in großem Maßstab.
