이 연구는 Hellenic Foundation for Research and Innovation (00376), National Institutes of Health, National Cancer Institute (NCI) [Grant R15CA231339], Texas Tech University Health Sciences Center (TTUHSC) School of Pharmacy Office of the Sciences Grant (to C.M.M.), 그리고 University of Louisiana Monroe 스타트업 펀드의 약학 대학의 지원을 받았습니다. National Institute of General Medical Science[보조금 P20 GM103424-21]를 통한 NIH(National Institutes of Health) 및 이사회 지원 기금(LEQSF(2021-24)-RD-A-23)을 통한 루이지애나 이사회의 연구 경쟁력 하위 프로그램(RCS)(GM까지). 사용된 일반적인 TTUHSC 장비는 텍사스 암 예방 연구소(CPRIT) 보조금 RP190524 및 RP200572를 통해 입수했습니다. 연구비 제공자는 연구 설계, 집필 결정, 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았다. 그림 1A 의 그래픽 초록은 BioRender.com 로 작성되었습니다.

동물 연구는 TTUHSC 실험에 대해 텍사스 공과 대학 보건 과학 센터(TTUHSC)의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었으며, 파트라스 대학의 실험에 대한 지침 2010/63에 따라 서부 그리스 현의 수의국(Veterinary Administration of the Prefecture of Western Greece)에서 수행했습니다. 동물 배설물을 처리할 때는 폐기물 처리 규정을 성실히 준수하십시오.
1. 마우스 진피의 격리
<ol><li>1일차 참고: 1일차; 마취실, 동물 이발기, 이소플루란, 미세 겸자, 0.2μm 주사기 필터와 같은 재료 및 장비를 준비하십시오.<ol><li>DMEM에 1x Antibiotic-Antimycotic Solution과 함께 2mg/mL Dispase 용액을 준비하고 필터 멸균합니다. 참고: 매체 또는 PBS의 사용은 보고된 다른 프로토콜12에서 성공적으로 사용되었기 때문에 HBSS로 대체될 수 있습니다. 1x 항생제-항진균 용액은 페니실린(100 IU/mL), 스트렙토마이신(100 μg/mL) 및 암포테리신(2.5 μg/mL)을 첨가하여 대체할 수 있습니다.</li>
		<li>이소플루란(0.5-2% 이소플루란, 유량: 1L/min)이 투여된 마취실에 마우스를 넣어 마우스를 마취합니다. 마우스가 움직임을 멈춘 후 케이지 밖으로 옮기고 유사한 이소플루란 흐름으로 노즈 콘을 조정하는 마취를 계속합니다. 동물을 발가락으로 꼬집어 충분한 마취 수준을 확인하고 쥐를 지속적으로 모니터링하여 깊은 마취가 보존되도록 합니다(운동성 없음). 이발기를 사용하여 등쪽과 복부 털(각각 쥐 등과 복부)을 정중선을 따라 세로로 약 9cm2 를 자릅니다. 쥐가 마취에서 회복되어 케이지로 되돌려 놓습니다. 참고: 제모(제모) 크림을 대신 사용할 수 있습니다. 피부의 무결성을 유지하면서 격리할 피부 부위의 털이 완전히 제거되었는지 확인하십시오. 가능한 한 확장된 피부 부위를 클리핑하십시오. 제모로 인한 잠재적인 염증이 해결되도록 하려면 다음 날 세포 분리를 해야 합니다. 고립된 세포의 수를 늘리려면 그룹당 2-4개의 마우스를 풀합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>2일차 참고: 안락사 챔버, 생물 안전 캐비닛, CO2 인큐베이터, 에탄올, 미세 가위, 미세 집게, 무딘 집게, 100mm 조직 배양 플레이트, Dispase, DMEM, 1x 항생제-항진균 용액.<ol><li>CO2 투여로 마우스를 안락사시키고 누운 자세로 놓아 잘린 부위를 노출시킵니다. 70% 에탄올을 소독제로 뿌립니다. 참고: 이 단계부터 모든 단계는 멸균 조건(생물 안전 캐비닛에서)에서 수행해야 합니다.</li>
		<li>멸균된 100mm 조직 배양 플레이트를 얼음 위에 놓습니다.</li>
		<li>복부를 0.5인치 표면 절삭하고 정중선을 따라 목과 하복부까지 세로로 자릅니다. 피부를 플랩으로 열 수 있도록 측면 절단을 하십시오. 참고: 절개 크기와 격리된 피부 면적은 마우스 크기에 따라 다릅니다.</li>
		<li>뭉툭한 집게를 사용하여 주변 조직과 피부를 조심스럽게 분리합니다. 쥐의 몸통 전체를 돌아 다니며 목과 하복부 주변의 피부를 측면으로 자릅니다.</li>
		<li>진피 쪽이 아래를 향하도록 하여 피부를 100mm 조직 배양 플레이트에 조심스럽게 넣어 피부를 최대한 늘려 줍니다. 접시를 덮고 얼음 위에 보관하십시오. 그룹에서 모든 마우스의 격리를 완료합니다.</li>
		<li>모든 마우스에서 피부를 추출한 후 실온에서 10분 동안 플레이트를 배양하여 이식을 평평하게 합니다.</li>
		<li>접시에 Dispase 용액 6mL를 넣고 피부가 완전히 잠기도록 하고 4°C에서 가벼운 교반으로 밤새 배양합니다. 참고: Dispase 대신 트립신 소화를 수행할 수도 있으며,12 콜라겐분해효소 Type II 처리(아래) 대신 Liboroughase를 수행할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 진피에서 세포 분리
<ol><li>3일차 참고: 원심분리기, CO2 인큐베이터, 생물 안전 작업대, 가위, DMEM, 1x 항생제-항진균 용액, 콜라겐 분해 효소 유형 II, PBS, 50mL 코니컬 튜브, 100mm 및 60mm 조직 배양 플레이트, DNAse I 용액, 콜라겐 유형 I, 70μm 및 40μm 세포 여과기, 0.2μm 주사기 필터, LEC 배지.<ol><li>500mL의 1x PBS(1.37M NaCl, 27mM KCl, 100mM Na2HPO4, 18mM KH2PO4, pH 7.4)를 준비하고 15psi에서 20분 동안 오토클레이브하거나 필터 멸균합니다. 또는 시중에서 판매되는 멸균 PBS를 사용하십시오.</li>
		<li>DMEM에 1x 항생제-항진균성 용액과 함께 10mL의 2mg/mL 콜라겐분해효소 II 용액을 준비하고 필터 멸균합니다. 참고: 멸균 후드 아래에서 다음 단계를 수행하여 샘플 오염 가능성을 줄이십시오.</li>
		<li>피펫을 사용하여 접시에서 액체를 제거하십시오.</li>
		<li>겸자를 사용하여 진피(피부 하단)와 표피(상단)를 분리하고 명백한 지방 조직을 제거합니다. 진피를 깨끗한 조직 배양 플레이트로 옮깁니다.</li>
		<li>깨끗한 조직 배양 플레이트에 DMEM 1mL와 1x 항생제-항진균 용액을 넣고 액체가 플레이트의 한쪽 면에 쌓이도록 기울입니다.</li>
		<li>진피를 1-2mm2 조각으로 다져 새로운 50mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 참고: 이 단계는 이상적으로 4-5분 이내에 완료해야 하며, 더 긴 처리는 더 높은 수율이나 세포 생존을 제공할 것으로 예상되지 않으므로 가능합니다.</li>
		<li>콜라겐분해효소 II형 용액 10mL를 추가합니다.</li>
		<li>DNAse I 용액 50μL(용액 25단위/mL)를 추가하고(세포 응집 감소) 연속 교반으로 37°C에서 2시간 동안 진피 용액을 분해합니다(30-50rpm에서 회전/진탕 인큐베이터 사용). 알림: 대부분의 진피가 소화되었는지 주기적으로 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 가능하면 소화 시간(최대 1시간 추가)과 교반 속도를 높입니다.</li>
		<li>60mm 조직 배양 플레이트에 0.02m 아세트산에 10μg/mL 콜라겐 유형 I 2mL를 37°C에서 >20분 동안 코팅합니다. 멸균 PBS로 2회 세척하십시오.</li>
		<li>70μm 셀 스트레이너와 원심분리기를 사용하여 250× g 에서 5분 동안 셀 현탁액을 여과합니다. 상층액을 버립니다.</li>
		<li>1x 항생제-항진균 용액으로 DMEM 10mL에 재현탁합니다.</li>
		<li>40μm 셀 스트레이너와 원심분리기를 사용하여 250× g 에서 5분 동안 셀 현탁액을 여과합니다. 상층액을 버립니다.</li>
		<li>1mL의 완전한 LEC 배지(Endothelial Cell Growth Base Medium with Supplement)에 재현탁합니다.</li>
		<li>콜라겐 코팅된 60mm 조직 배양 플레이트의 세포를 완전한 LEC 배지에 패팅합니다. 이것은 세포 배양의 0일차입니다.</li>
		<li>2일마다 1x PBS로 세포를 두 번 세척하고 새 LEC 배지를 추가하여 배지를 교체합니다.</li>
		<li>셀이 80-90% 합류할 때까지 2.1.15단계를 반복합니다. 참고: 세포가 80-90% 합류하기 전에 정제를 수행하면 더 적은 수의 림프 내피 세포가 분리됩니다. 이 과정은 약 7일에서 10일 정도 걸립니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. LYVE-1 항체를 이용한 마그네틱 비드 코팅
참고: 정제 단계 하루 전에 4 °C 냉장고, 로터, 자기 분리기, PBS, Anti-Rabbit IgG 마그네틱 비드, 마이크로 원심분리기 튜브, 0.2 μm 주사기 필터, 마그네틱 비드 코팅 용액, LYVE-1 항체.
<ol><li>마그네틱 비드 코팅 용액 준비: 0.1% BSA 및 2mM EDTA가 있는 PBS 20mL를 준비하고 필터 멸균합니다. 4 °C에서 보관하십시오. 알림: 며칠 이상의 보관은 권장되지 않습니다. 사용하기 전에 침전물이나 오염이 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>500μL의 Anti-Rabbit IgG 마그네틱 비드를 마이크로 원심분리기 튜브에 피펫팅하고 1mL의 얼음처럼 차가운 마그네틱 비드 코팅 용액을 추가합니다.</li>
	<li>자기 분리기를 사용하여 구슬을 씻으십시오.</li>
	<li>얼음처럼 차가운 Magnetic Bead Coating Solution 1mL로 2회 세척을 반복합니다.</li>
	<li>500 μL의 마그네틱 비드 코팅 용액에 비드를 재현탁시키고 마이크로 원심분리기 튜브에서 150 μL의 부분 표본을 만듭니다.</li>
	<li>각 튜브에 LYVE-1 항체 15μg을 추가합니다(1mg/mL 항체 스톡 농도에서 15μL).</li>
	<li>연속 교반으로 4 °C에서 밤새 배양합니다.</li>
</ol>4. 림프 내피 세포 정제
참고: CO2 인큐베이터, 쉐이커, 타이머, 파라필름, DMEM, 1x 항생제-항진균 용액, BSA, PBS, 마그네틱 비드 코팅 용액, 트립신-EDTA, 100mm 또는 60mm 조직 배양 플레이트, 0.2μm 주사기 필터, 콜라겐 유형 I, 아세트산, LEC 배지.
<ol><li>50mL의 DMEM에 1x 항생제-항진균 용액과 0.1% BSA를 넣고 필터 멸균합니다.</li>
	<li>37°C에서 >20분 동안 0.02m 아세트산에 10μg/mL 콜라겐 유형 I을 60mm 조직 배양 플레이트에 코팅합니다. 멸균 PBS로 2회 세척하십시오.</li>
	<li>자기 분리기를 사용하여 1mL의 Magnetic Bead Coating Solution으로 사전 코팅된 비드를 세척합니다.</li>
	<li>0.1% BSA로 150μL의 DMEM에 비드를 재현탁시킵니다. 참고: 비드는 이제 4°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>PBS로 세포를 2번 세척합니다.</li>
	<li>0.1% BSA(60mm 조직 배양 플레이트용)가 포함된 DMEM 3mL와 항체 접합 비드 50μL를 세포에 추가합니다. 참고: 두 개 이상의 마우스의 세포가 합쳐진 경우 100mm 조직 배양 플레이트를 사용하고 0.1% BSA가 포함된 6mL의 DMEM을 추가합니다.</li>
	<li>파라필름으로 접시를 밀봉합니다.</li>
	<li>RT에서 10RPM으로 교반하는 셰이커에 접시를 놓고 정확히 10분 동안 배양합니다. 참고: 배양이 길어지면 비특이적 결합이 발생합니다. 비드가 전체 플레이트 표면과 상호 작용하도록 하려면 계속 흔들리면서 몇 분마다 플레이트를 수동으로 회전시킵니다.</li>
	<li>매체를 버리고 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 세포를 신속하게 검사하여 플레이트에 LEC 콜로니가 있는지 확인합니다.</li>
	<li>트립신화 세포: 트립신-EDTA 1mL를 사용하고 37°C에서 3분 동안 배양합니다. 성공적인 세포 분리를 위해 세포를 검사합니다.</li>
	<li>2mL의 완전한 LEC 배지로 용액을 중화하고 용액을 5mL 멸균 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>자기 분리기를 사용하여 0.1% BSA가 있는 4 x 3mL의 DMEM을 세척하여 결합되지 않은 세포를 제거합니다.</li>
	<li>나머지 비드 결합 세포를 완전한 LEC 배지에 재현탁시키고 이전에 콜라겐 코팅된 60mm 조직 배양 플레이트에 플레이트합니다.</li>
	<li>37°C에서 세포를 배양하고 매번 두 번의 PBS 세척 후 격일로 배지를 교체합니다.</li>
	<li>밀도에 도달할 때까지 세포를 배양합니다(일반적으로 7-10일 소요).</li>
	<li>이 시점에서 현미경으로 세포가 밀도가 있는지 확인하고 유세포 분석을 위한 세포 준비를 진행합니다. 높은 F4/80+ 비율이 확인되면 LYVE-1(4단계: 림프 내피 세포 정제)로 정제 단계를 다시 반복하거나 다른 림프 마커(예: 포도플라닌14)를 사용하는 것이 좋습니다. 참고: 마그네틱 비드 정제 세포 집단에서 항체에 의해 표적으로 하는 단백질의 높은 발현은15,16으로 입증되었습니다. 그러나 LYVE-1의 경우 다른 LYVE-1+ 세포(대부분 대식세포)의 비율을 식별하기 위해 유세포 분석 제어를 수행하는 것이 중요합니다. LYVE-1은 종양 및 상처와 관련된 대식세포의 부분집합에서만 발현되는 반면, 건강한 피부에서 LYVE-1 발현은 림프내피세포에 더 국한된다17. 따라서 F4/80 스크리닝은 필수가 아니라 실험 상황에 따라 달라집니다. 시연에 사용된 마우스는 종양이나 상처를 가지고 있지 않았고 제모로 인한 잠재적인 염증만 가지고 있었지만 LYVE-1+ 대식세포 비율의 기준선으로 F4/80 염색을 포함했습니다.</li>
</ol>5. 유세포 분석
참고: 원심분리기, CO2 인큐베이터, 타이머, 혈구계, EDTA 용액, 1x 항생제-항진균 용액, BSA, PBS, 트립신-EDTA, 폴리프로필렌 튜브, 0.2μm 주사기 필터, 70% 에탄올, F4/80 FITC-복합 항체.
<ol><li>0.1% BSA가 함유된 PBS를 준비하고 필터 살균합니다.</li>
	<li>PBS에서 1mM EDTA 용액을 준비합니다.</li>
	<li>세포 트립신화: 37°C에서 5분 동안 1mL EDTA 용액 1mL로 세포를 배양합니다. 참고: EDTA 용액을 사용한 배양은 세포막 관통 단백질을 더 잘 보존하는 더 가벼운 세포 분리 방법이며 선호되지만 더 긴 배양 기간이 필요합니다. 또는 trypsin-EDTA 용액을 37°C에서 1분 배양에 사용할 수 있지만, 이는 유세포 분석 응용 분야의 항체 친화도에 영향을 미칠 수 있습니다.</li>
	<li>2mL의 완전한 LEC 배지로 용액을 중화하고 용액을 5mL 멸균 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>샘플을 250× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>PBS로 씻으십시오.</li>
	<li>원심분리와 PBS 세척을 반복합니다.</li>
	<li>0.1% BSA를 함유한 PBS의 세포를 재현탁시키고 혈구계 또는 대체 방법을 사용하여 계수합니다. 최종 부피가 100 μl인 폴리프로필렌 튜브에 ~1 × 106 세포를 분취합니다. 이 단계부터 4°C에서 모든 단계를 수행합니다. 참고: 세포는 염색하기 전에 고정하거나 살아있는 동안 염색할 수 있습니다. 일부 항체는 고정 후 항원을 검출하지 못할 수 있으므로 유세포 분석에는 고정이 최적화되지 않을 수 있습니다. 따라서 이전 단계 직후에 유세포 분석을 실행하고 고정 단계를 건너뛰는 것이 좋습니다. 이것이 가능하지 않은 경우, 유세포 분석 실험 전에 고정하면 유세포 분석 단계를 지연시킬 수 있습니다. 고정을 수행해야 하는 경우, 고정된 세포의 맥락에서 항체의 성능을 미리 평가해야 합니다.</li>
	<li>고정 수행(선택적 단계, 세포가 고정되지 않을 경우 면역염색 진행): 세포를 얼음처럼 차가운 70% 에탄올에 재현탁시키고 얼음 위에서 10분 동안 부드럽게 혼합합니다. 참고 : 에탄올 고정은 세포를 투과 화하고 GFP의 방출로 이어질 수 있습니다. 그러나 파라포름알데히드 기반 고정은 유세포 분석에 사용되는 염료를 파괴할 수 있으며 이상적으로는 피할 수 있습니다.</li>
	<li>실온에서 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>250× g 에서 원심분리로 세포를 2x PBS에서 5분 동안 1회 세척합니다.</li>
	<li>다음 단계로 진행하거나 1x PBS 0.5-1mL에 세포를 재현탁시키고 4°C에서 보관합니다.</li>
</ol>6. 면역염색
참고: 세포를 부드럽게 다루고 가능한 경우 광범위한 피펫팅을 피하여 세포막의 무결성을 유지하고 세포 사멸을 최소화하여 세포가 덩어리를 형성하지 않도록 하십시오. 분리된 내피 세포에서 염색되지 않은 세포 및 다른 내피 세포 마커(즉, VEGFR3, 포도플라닌), F4/80 및 둘 다를 사용하여 염색된 세포를 준비합니다. 상업적으로 이용 가능한 마우스 림프 내피 세포와 대식세포(사용 가능한 경우)를 양성 대조군으로 포함합니다. 시연을 위해 내인성 tdTomato 형광(PE+)으로 인해 FITC-conjugated F4/80 염색을 사용했습니다.
<ol><li>권장되거나 최적화된 희석에 따라 PBS의 1차 항체를 0.1% BSA로 희석합니다. 0.5μg(1μL의 항체 용액)의 F4/80 FITC 복합 항체를 세포 현탁액 100μL에 추가합니다.</li>
	<li>희석된 형광 접합 항체를 첨가한 후 세포를 재현탁시킵니다. 폴리프로필렌 튜브를 튕겨 덩어리가 없고 모든 셀이 제대로 코팅되었는지 확인합니다.</li>
	<li>실온(고정 세포)에서 1시간 동안 배양하거나 어두운 곳에서 얼음(살아있는 세포)에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>어두운 곳에서 0.1% BSA의 PBS를 사용하여 250× g 에서 4°C(살아있는 세포의 경우) 또는 실온(고정 세포의 경우)에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 2배 세척합니다.</li>
	<li>non-fluorescently-conjugated antibodies(non-fluorescently-conjugated 항체)용<ol><li>fluorochrome-conjugated secondary antibody를 배양 완충액에 희석합니다. Alexa Flour 항체의 경우 1:500 희석을 사용합니다.</li>
		<li>세포 현탁액 100μL에 2차 항체를 추가합니다.</li>
		<li>실온(고정 세포) 또는 얼음(살아있는 세포)에서 30분 동안 배양합니다.</li>
		<li>배양 완충액에서 250 × g 의 원심분리를 통해 4°C(살아있는 세포의 경우) 또는 실온(고정 세포의 경우)에서 5분 동안 2회 세척합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>1x PBS 0.5mL에 세포를 재현탁하고 유세포분석기를 사용하여 분석합니다.</li>
	<li>다음 gating 전략 단계에 따라 LYVE-1 발현 세포 내 대식세포 집단을 식별하십시오.<ol><li>세포 집단을 구별하기 위해 전방 및 측면 산란을 고려하십시오.</li>
		<li>단일 세포(Singlet)를 구별하기 위해 셀 크기, 면적 및 높이에 대한 전방 산란을 고려하십시오.</li>
		<li>F4/80(FITC) 발현 및 RFP(PE) 발현을 고려하여 tdTomato(PE) 발현 분리된 쥐 세포 내에서 대식세포(F4/80+)를 식별합니다(아래에 설명된 특정 마우스에 형광 tdTomato 리포터가 존재하기 때문에).</li>
	</ol></li>
</ol>

Murine Dermal Lymphatic Capillaries에서 내피 세포 분리

<ol>
	<li>Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphatic+vasculature+in+the+21(st)+century:+novel+functional+roles+in+homeostasis+and+disease.">The lymphatic vasculature in the 21(st) century: novel functional roles in homeostasis and disease.</a> Cell. 182 (2), 270-296 (2020).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoangiocrine+signals+promote+cardiac+growth+and+repair.">Lymphoangiocrine signals promote cardiac growth and repair.</a> Nature. 588 (7839), 705-711 (2020).</li><li>Biswas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessels+in+bone+support+regeneration+after+injury.">Lymphatic vessels in bone support regeneration after injury.</a> Cell. 186 (2), 382-397 (2023).</li><li>Tammela, T., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis:+molecular+mechanisms+and+future+promise.">Lymphangiogenesis: molecular mechanisms and future promise.</a> Cell. 140 (4), 460-476 (2010).</li><li>Ji, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+lymphangiogenesis+in+cardiovascular+diseases+and+heart+transplantation.">The role of lymphangiogenesis in cardiovascular diseases and heart transplantation.</a> Heart Failure Reviews. 27 (5), 1837-1856 (2022).</li><li>Patnam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+guidance+mechanisms+and+therapeutic+implications+in+pathological+states+of+the+cornea.">Lymphangiogenesis guidance mechanisms and therapeutic implications in pathological states of the cornea.</a> Cells. 12 (2), 319 (2023).</li><li>Lokmic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+lymphatic+endothelial+cells+by+multi-parameter+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52691 (2015).</li><li>Jackson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+lymphatic+marker+LYVE-1+and+applications+in+research+into+lymphatic+trafficking+and+lymphangiogenesis.">Biology of the lymphatic marker LYVE-1 and applications in research into lymphatic trafficking and lymphangiogenesis.</a> APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 112 (7-8), 526-538 (2004).</li><li>Makinen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDZ+interaction+site+in+ephrinB2+is+required+for+the+remodeling+of+lymphatic+vasculature.">PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature.</a> Genes and Development. 19 (3), 397-410 (2005).</li><li>Wolters, G. H., Vos-Scheperkeuter, G. H., Lin, H. C., van Schilfgaarde, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+roles+of+class+I+and+class+II+Clostridium+histolyticum+collagenase+in+rat+pancreatic+islet+isolation.">Different roles of class I and class II Clostridium histolyticum collagenase in rat pancreatic islet isolation.</a> Diabetes. 44 (2), 227-233 (1995).</li><li>Kubo, A., Aoki, S., Fujita, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+preparation+and+microscopic+analysis+of+epidermis.">Whole-mount preparation and microscopic analysis of epidermis.</a> Current Protocols. 2 (7), e464 (2022).</li><li>Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry-based+isolation+of+dermal+lymphatic+endothelial+cells+from+newborn+rats.">Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats.</a> Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).</li><li>Kazenwadel, J., Michael, M. Z., Harvey, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prox1+expression+is+negatively+regulated+by+miR-181+in+endothelial+cells.">Prox1 expression is negatively regulated by miR-181 in endothelial cells.</a> Blood. 116 (13), 2395-2401 (2010).</li><li>Lapinski, P. E., King, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+lymphatic+endothelial+cells+from+lung+tissue.">Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).</li><li>Choi, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Del-1,+an+endogenous+leukocyte-endothelial+adhesion+inhibitor,+limits+inflammatory+cell+recruitment.">Del-1, an endogenous leukocyte-endothelial adhesion inhibitor, limits inflammatory cell recruitment.</a> Science. 322 (5904), 1101-1104 (2008).</li><li>Mikelis, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+and+ROCK+mediate+histamine-induced+vascular+leakage+and+anaphylactic+shock.">RhoA and ROCK mediate histamine-induced vascular leakage and anaphylactic shock.</a> Nature Communications. 6, 6725 (2015).</li><li>Schledzewski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+endothelium-specific+hyaluronan+receptor+LYVE-1+is+expressed+by+stabilin-1+,+F4/80+,+CD11b++macrophages+in+malignant+tumours+and+wound+healing+tissue+in+vivo+and+in+bone+marrow+cultures+in+vitro:+implications+for+the+assessment+of+lymphangiogenesis.">Lymphatic endothelium-specific hyaluronan receptor LYVE-1 is expressed by stabilin-1+, F4/80+, CD11b+ macrophages in malignant tumours and wound healing tissue in vivo and in bone marrow cultures in vitro: implications for the assessment of lymphangiogenesis.</a> Journal of Pathology. 209 (1), 67-77 (2006).</li><li>Akwii, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-2-induced+lymphatic+endothelial+cell+migration+drives+lymphangiogenesis+via+the+beta1+integrin-RhoA-formin+axis.">Angiopoietin-2-induced lymphatic endothelial cell migration drives lymphangiogenesis via the beta1 integrin-RhoA-formin axis.</a> Angiogenesis. 25 (3), 373-396 (2022).</li><li>Petrova, T. V., Koh, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+functions+of+lymphatic+vessels.">Biological functions of lymphatic vessels.</a> Science. 369 (6500), eaax4063 (2020).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+cancer+metastasis:+the+'seed+and+soil'+hypothesis+revisited.">The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited.</a> Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 453-458 (2003).</li><li>Mellor, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+dysfunction,+not+aplasia,+underlies+Milroy+disease.">Lymphatic dysfunction, not aplasia, underlies Milroy disease.</a> Microcirculation. 17 (4), 281-296 (2010).</li><li>Connell, F., Brice, G., Mortimer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+primary+lymphedema.">Phenotypic characterization of primary lymphedema.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 140-146 (2008).</li><li>Croteau, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposiform+lymphangiomatosis:+a+distinct+aggressive+lymphatic+anomaly.">Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly.</a> Journal of Pediatris. 164 (2), 383-388 (2014).</li><li>Ji, Y., Chen, S., Peng, S., Xia, C., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposiform+lymphangiomatosis+and+kaposiform+hemangioendothelioma:+similarities+and+differences.">Kaposiform lymphangiomatosis and kaposiform hemangioendothelioma: similarities and differences.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 165 (2019).</li><li>Kriehuber, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+dermal+lymphatic+and+blood+endothelial+cells+reveal+stable+and+functionally+specialized+cell+lineages.">Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages.</a> Journal of Experimental Medicine. 194 (6), 797-808 (2001).</li><li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells.">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li><li>Garrafa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification,+and+heterogeneity+of+human+lymphatic+endothelial+cells+from+different+tissues.">Isolation, purification, and heterogeneity of human lymphatic endothelial cells from different tissues.</a> Lymphology. 38 (4), 159-166 (2005).</li><li>Kazenwadel, J., Secker, G. A., Betterman, K. L., Harvey, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+using+primary+embryonic+mouse+lymphatic+endothelial+cells+uncover+key+roles+for+FGFR1+signalling+in+lymphangiogenesis.">In vitro assays using primary embryonic mouse lymphatic endothelial cells uncover key roles for FGFR1 signalling in lymphangiogenesis.</a> PLoS One. 7 (7), e40497 (2012).</li><li>Steele, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+egress+via+lymphatic+vessels+is+tuned+by+antigen+encounter+and+limits+tumor+control.">T cell egress via lymphatic vessels is tuned by antigen encounter and limits tumor control.</a> Nature Immunology. 24 (4), 664-675 (2023).</li><li>Mammoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+age-dependent+changes+in+cell+size+on+endothelial+cell+proliferation+and+senescence+through+YAP1.">Effects of age-dependent changes in cell size on endothelial cell proliferation and senescence through YAP1.</a> Aging. 11 (17), 7051-7069 (2019).</li><li>Regina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+ageing+and+endothelial+cell+senescence:+Molecular+mechanisms+of+physiology+and+diseases.">Vascular ageing and endothelial cell senescence: Molecular mechanisms of physiology and diseases.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 159, 14-21 (2016).</li><li>Muhleder, S., Fernandez-Chacon, M., Garcia-Gonzalez, I., Benedito, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+sprouting,+proliferation,+or+senescence:+tipping+the+balance+from+physiology+to+pathology.">Endothelial sprouting, proliferation, or senescence: tipping the balance from physiology to pathology.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (4), 1329-1354 (2021).</li></ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없음을 선언합니다.

림프계는 신체의 항상성 기능을 조절하는 중요한 조절자이며, 가장 중요한 기능은 유체 혈장 유지, 세포 대사 부산물 및 독성 분자 제거, 지질 흡수 및 면역 세포 이동입니다 1,19. 적절한 마커의 식별은 림프관 분야에서 새로운 데이터의 폭발을 불러 일으켰으며, 특정 장기의 복구 및 재생 능력에 대한 역할과 같은 림프 혈관의 새로운 기능을 밝혀 냈습?...

림프계는 인체 생리학에서 중추적인 역할을 합니다. 이는 중요한 항상성 인자로 간주되며, 조직-형질액 균형 유지, 면역 감시, 지질 흡수1와 같은 중요한 기능뿐만 아니라 심장의 복구 능력2, 뼈 및 조혈 능력3의 재생 능력과 같은 최근에 확인된 기능을 촉진합니다. 림프계의 중요한 역할에도 불구하고 림프관의 역할의 여러 측면과 특정 생리학적 매개변수 및 반응을 지배하는 분자 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵습니다. 또한, 림프 혈관 결손은 특정 병태생리학적 상태에서 유발 요인 또는 악화 요인입니다. 잘 알려진 예로는 질병의 유전적 또는 비유전적 원인에 따라 각각 원발성 림프부종과 이차성 림프부종이 있으며, 림프계는 전이를 위한 통로 역할을 하고 면역 기능을 조절하는 역할을 할 수 있기 때문에 원발성 종양 성장 및 전이성 전파에 대한 림프계의 역할은 매우 중요합니다1.
혈액 혈관에 비해 림프계에 대한 연구 및 지식의 지연은 주로 혈액 혈관 시스템에 비해 림프계가 나중에 발견되고 림프관 특이적 분자 마커의 식별이 지연되기 때문입니다. 이는 최근 수십 년 동안 크게 개선되어 정상 상태와 질병 상태에서의 림프관에 대한 기존의 그림을 변경하게 되었다1. 혈관신생과 유사하게, 림프관신생술은 기존의 림프관에서 새로운 림프관이 형성되는 것으로, 다양한 질병의 발병에 중추적인 역할을 한다 4,5,6. 그러나 혈관신생과 달리 림프관신생에 대한 연구는 주로 in vivo model에 국한되어 있으며, 병리학적 모델의 발달 혈관 형성 및 구조적 결함에 초점을 맞추고 있습니다. 림프 내피 세포의 분리는 시험관 내 연구에 중요하며, 이는 제시된 프로토콜에 의해 제공될 수 있습니다.
마우스에서 림프 내피 분리를 위한 여러 프로토콜이 개발되었으며, 이는 형광 활성화 세포 분류를 필요로 합니다7. 세포 분류기의 장점은 사용 가능한 경우 비드 기반 분리와 달리 순도가 더 높으며 비드 기반 분리가 더 높은 수율을 제공한다는 것입니다. 이 프로토콜은 림프관 내 세포 이동에 중요한 림프 내피 마커인 림프 내피 히알루론안 수용체 1(LYVE-1)의 발현을 활용합니다 4,8. LYVE-1 발현은 림프관이 수집되는 림프관이 아닌 림프 모세혈관에 국한되기 때문에, 이 기법은 모든 림프내피세포에서 균일하게 발현되는 포도플라닌(podoplanin)과 같은 다른 림프항모세포(marker)와 달리 림프내피세포를 림프혈관에서 특이적으로 분리하는 데 적합하다9. 프로토콜의 경우, Prox1과 같이 막관통이 아닌 다른 중요한 림프 마커는 제외되었습니다.
생리학적 결과는 일반적으로 림프 모세혈관에서 시작되는 림프관 형성이었기 때문에 LYVE-1은 이러한 세포에서 선택성이 있고 선택된 항체가 높은 수율을 제공하기 때문에 표적으로 선택되었습니다. 사용된 효소는 일반적으로 I형10보다 콜라겐 해리에 더 효과적인 것으로 알려진 콜라겐 분해효소 II형과 진피-표피 분리에 정기적으로 사용되는 더 넓은 프로테아제인 디스파제(dispase)였다11; 그러나, 조직 분리를 위한 다른 효소는12,13 보고되었으며 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표는 특히 형광 활성화 세포 분류가 쉽게 가능하지 않은 장소에서 마그네틱 비드 정제를 사용하여 높은 수율로 성인 마우스의 림프 모세혈관에서 피부 림프 내피 세포를 분리하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 림프 내피 세포의 순도가 다운스트림 응용 분야를 위해 손상될 수 있는 응용 분야에 적합합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m Syringe Filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-719C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Hair Clipper</td>
			<td>Wahl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11992-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>542040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>542070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, High Concentration Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td>dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Solution (2,500 U/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynal MPC-L Magnetic Particle Concentrator</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>120-21D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Base Medium &#38; Supplement (LEC medium)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>CCM027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia chamber</td>
			<td>Euthanex Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1432S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LARC-A E-Z Anesthesia Induction Chamber</td>
			<td>Euthanex Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Solution 4% in PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30256FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Mouse LYVE-1</td>
			<td>ReliaTech GmbH</td>
			<td>103-PA50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating/Shaking Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polypropylene Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters w 0.2 &#956;m Pores</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-719C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine dermal lymphatic endothelial cell isolation

림프계는 면역 감시, 지질 흡수 및 조직액 균형의 조절에 참여합니다. 쥐 림프 내피 세포의 분리는 분리된 세포에 대한 시험관 내 및 생화학 실험을 수행할 수 있게 해주기 때문에 림프 연구에 중요한 과정입니다. 또한, Cre-lox 기술의 개발은 전 세계적으로 표적화할 수 없는 유전자의 조직 특이적 결핍을 가능하게 하여 연구된 조직에서 유전자의 역할을 정확하게 결정할 수 있게 되었습니다. 림프 생리학 및 병태 생리학에서 특정 유전자의 역할을 해부하려면 림프 특이적 프로모터의 사용이 필요하며, 따라서 표적 유전자의 발현 수준에 대한 실험적 검증이 필요합니다.
야생형 또는 형질전환 마우스에서 림프 내피 세포를 효율적으로 분리하는 방법을 통해 체외 및 시험관 내 분석을 사용하여 림프 기능을 조절하는 메커니즘을 연구하고 연구된 단백질의 발현 수준을 식별할 수 있습니다. 당사는 LYVE-1 발현을 기반으로 하는 마그네틱 비드 정제를 통해 쥐 피부 림프 내피 세포(DLEC)의 효율적인 분리를 위한 프로토콜을 개발, 표준화 및 제시합니다. 요약된 프로토콜은 특히 형광 활성화 세포 분류 장비를 사용할 수 없는 시설에서 림프 내피 세포 기능의 중요한 역할을 더 잘 이해하고 설명할 수 있는 도구를 연구자에게 제공하는 것을 목표로 합니다.

이 방법은 작은 GTPase, RhoA의 단백질 발현을 확인하기 위해 개발되었으며, 이 코딩 유전자는 두 대립유전자에서 모두 플록화되어 타목시펜 유도 림프 내피 특이적 프로모터 Prox1-CreERT2 18의 영향으로 삭제되었습니다. 분리된 LEC는 최대 4세대 동안 배양할 수 있으며, 그 후에는 노화가 됩니다. 그들은 얼고, 해동되고, 안지오포이에틴-2로 성공적으로 자극되었습니다. ?...

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저자 스포트라이트: Magnetic Bead-Based Isolation of murine Dermal Lymphatic Endothelial Cells

이 논문은 진피 림프 모세혈관에서 쥐 내피 세포의 자기 비드 기반 분리 방법을 설명합니다. 분리된 림프 내피 세포는 다운스트림 in vitro 실험 및 단백질 발현 분석에 사용할 수 있습니다.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...

우리 그룹의 연구는 내피 세포 생리학을 조절하는 메커니즘을 설명하는 데 중점을 둡니다. 이 프로토콜은 특히 형광 활성화 세포 분류를 사용할 수 없는 시설의 열 림프 모세관에서 신장 내피 세포의 자기 비드 기반 분리 방법을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 형질전환 마우스에서 림프 내피 세포를 분리하여 시험관 내에서 생리학을 연구할 수 있습니다.림프 내피 세포의 순도가 다운스트림 응용 분야에서 손상될 수 있는 경우에 특히 적합합니다. 이 과정은 림프 모세혈관에서 얻은 림프 내피 세포의 높은 수율을 제공하며 다른 수집 혈관은 제공하지 않습니다. 또한 세포 분류 시설이 없는 경우에도 좋은 대안입니다.

murine-dermal-lymphatic-endothelial-cell-isolation

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

1.0K 조회수.  Texas Tech University Health Sciences Center. 우리 그룹의 연구는 내피 세포 생리학을 조절하는 메커니즘을 설명하는 데 중점을 둡니다. 이 프로토콜은 특히 형광 활성화 세포 분류를 사용할 수 없는 시설의 열 림프 모세관에서 신장 내피 세포의 자기 비드 기반 분리 방법을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 형질전환 마우스에서 림프 내피 세포를 분리하여 시험관 내에서 생리학을 연구할 수 있습니다.림프 내?...

비디오: 저자 스포트라이트: Magnetic Bead-Based Isolation of murine Dermal Lymphatic Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

인간 제대 베인 내피 세포의 절연 (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

연구

생물학

Murine Pancreatic Islet Isolation

Murine 췌장 아일릿 격리

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

분리 및 성인 인간 내피 콜로니 형성 전구 세포의 대규모 확장

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

인간 탯줄의 분리 및 동물 혈청 무료 확장 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCS)와 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)을 유래

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

판막병 내피 세포의 분리

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

배아 심실 내피 세포의 분리

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

마우스 관상 내피 세포의 분리

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the resolution of peripheral tissue responses. While a variety of methods are used to quantify leukocyte egress from non-lymphoid, peripheral tissues, the cellular and molecular mechanisms that govern context-dependent egress remain poorly understood. Here, we describe the use of in situ photoconversion for quantitative analysis of leukocyte egress from murine skin and tumors. Photoconversion allows for the direct labeling of leukocytes resident within cutaneous tissue. Though skin exposure to violet light induces local inflammatory responses characterized by leukocyte infiltrates and vascular leakiness, in a head-to-head comparison with transdermal application of fluorescent tracers, photoconversion specifically labeled migratory dendritic cell populations and simultaneously enabled the quantification of myeloid and lymphoid egress from cutaneous microenvironments and tumors. The mechanisms of leukocyte egress remain a missing component in our understanding of intratumoral leukocyte complexity, and thus the application of the tools described herein will provide unique insight into the dynamics of tumor immune microenvironments both at steady state and in response to therapy.

Here, we demonstrate the methods for in vivo quantification of leukocyte egress from na&#239;ve, inflamed, and malignant murine skin. We perform a head-to-head comparison of two models: transdermal FITC application and in situ photoconversion. Furthermore, we demonstrate the utility of photoconversion for tracking leukocyte egress from cutaneous tumors.

백혈구 탈출구 Murine 피부 및 종양 림프 혈관을 통해 측정

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...

Microvascular and Macrovascular Endothelial Cell Isolation and Purification from Lung-Derived Samples

The availability of cells isolated from healthy and diseased tissues and organs represents a key element for personalized medicine approaches. Although biobanks can provide a wide collection of primary and immortalized cells for biomedical research, these do not cover all experimental needs, particularly those related to specific diseases or genotypes. Vascular endothelial cells (ECs) are key components of the immune inflammatory reaction and, thus, play a central role in the pathogenesis of a variety of disorders. Notably, ECs from different sites display different biochemical and functional properties, making the availability of specific EC types (i.e., macrovascular, microvascular, arterial, and venous) essential for designing reliable experiments. Here, simple procedures to obtain high-yield, virtually pure human macrovascular and microvascular endothelial cells from the pulmonary artery and lung parenchyma are illustrated in detail. This methodology can be easily reproduced at a relatively low cost by any laboratory to achieve independence from commercial sources and obtain EC phenotypes/genotypes that are not yet available.

Although challenging, the isolation of pulmonary endothelial cells is essential for studies on lung inflammation. The present protocol describes a procedure for the high-yield, high-purity isolation of macrovascular and microvascular endothelial cells.

Microvascular and Macrovascular Endothelial Cell Isolation and Purification from Lung-Derived Samples(폐 유래 샘플에서 미세혈관 및 대혈관 내피 세포 분리 및 정제)

The availability of cells isolated from healthy and diseased tissues and organs represents a key element for personalized medicine approaches. Although ...