עבודה זו נתמכה על ידי הקרן ההלנית למחקר וחדשנות (00376), המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי לסרטן (NCI) [מענק R15CA231339], המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס טק (TTUHSC) בית הספר לרוקחות משרד המדעים מענק (ל- C.M.M.), ועל ידי המכללה לרוקחות, אוניברסיטת לואיזיאנה מונרו מימון סטארט-אפ, המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) באמצעות המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים [מענק P20 GM103424-21] ותת-תוכנית התחרותיות במחקר (RCS) של מועצת העוצרים של לואיזיאנה באמצעות קרן התמיכה של מועצת העוצרים (LEQSF (2021-24)-RD-A-23) (ל- G.M). ציוד TTUHSC הנפוץ בשימוש הושג באמצעות מכון המחקר למניעת סרטן של טקסס (CPRIT) מענקים RP190524 ו RP200572. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, בהחלטה לכתוב או בהכנת כתב היד. התקציר הגרפי באיור 1A נוצר באמצעות BioRender.com.

בידוד תאי אנדותל מנימי לימפה עורית מורין

<ol>
	<li>Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphatic+vasculature+in+the+21(st)+century:+novel+functional+roles+in+homeostasis+and+disease.">The lymphatic vasculature in the 21(st) century: novel functional roles in homeostasis and disease.</a> Cell. 182 (2), 270-296 (2020).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoangiocrine+signals+promote+cardiac+growth+and+repair.">Lymphoangiocrine signals promote cardiac growth and repair.</a> Nature. 588 (7839), 705-711 (2020).</li><li>Biswas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessels+in+bone+support+regeneration+after+injury.">Lymphatic vessels in bone support regeneration after injury.</a> Cell. 186 (2), 382-397 (2023).</li><li>Tammela, T., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis:+molecular+mechanisms+and+future+promise.">Lymphangiogenesis: molecular mechanisms and future promise.</a> Cell. 140 (4), 460-476 (2010).</li><li>Ji, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+lymphangiogenesis+in+cardiovascular+diseases+and+heart+transplantation.">The role of lymphangiogenesis in cardiovascular diseases and heart transplantation.</a> Heart Failure Reviews. 27 (5), 1837-1856 (2022).</li><li>Patnam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+guidance+mechanisms+and+therapeutic+implications+in+pathological+states+of+the+cornea.">Lymphangiogenesis guidance mechanisms and therapeutic implications in pathological states of the cornea.</a> Cells. 12 (2), 319 (2023).</li><li>Lokmic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+lymphatic+endothelial+cells+by+multi-parameter+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52691 (2015).</li><li>Jackson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+lymphatic+marker+LYVE-1+and+applications+in+research+into+lymphatic+trafficking+and+lymphangiogenesis.">Biology of the lymphatic marker LYVE-1 and applications in research into lymphatic trafficking and lymphangiogenesis.</a> APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 112 (7-8), 526-538 (2004).</li><li>Makinen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDZ+interaction+site+in+ephrinB2+is+required+for+the+remodeling+of+lymphatic+vasculature.">PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature.</a> Genes and Development. 19 (3), 397-410 (2005).</li><li>Wolters, G. H., Vos-Scheperkeuter, G. H., Lin, H. C., van Schilfgaarde, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+roles+of+class+I+and+class+II+Clostridium+histolyticum+collagenase+in+rat+pancreatic+islet+isolation.">Different roles of class I and class II Clostridium histolyticum collagenase in rat pancreatic islet isolation.</a> Diabetes. 44 (2), 227-233 (1995).</li><li>Kubo, A., Aoki, S., Fujita, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+preparation+and+microscopic+analysis+of+epidermis.">Whole-mount preparation and microscopic analysis of epidermis.</a> Current Protocols. 2 (7), e464 (2022).</li><li>Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry-based+isolation+of+dermal+lymphatic+endothelial+cells+from+newborn+rats.">Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats.</a> Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).</li><li>Kazenwadel, J., Michael, M. Z., Harvey, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prox1+expression+is+negatively+regulated+by+miR-181+in+endothelial+cells.">Prox1 expression is negatively regulated by miR-181 in endothelial cells.</a> Blood. 116 (13), 2395-2401 (2010).</li><li>Lapinski, P. E., King, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+lymphatic+endothelial+cells+from+lung+tissue.">Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).</li><li>Choi, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Del-1,+an+endogenous+leukocyte-endothelial+adhesion+inhibitor,+limits+inflammatory+cell+recruitment.">Del-1, an endogenous leukocyte-endothelial adhesion inhibitor, limits inflammatory cell recruitment.</a> Science. 322 (5904), 1101-1104 (2008).</li><li>Mikelis, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+and+ROCK+mediate+histamine-induced+vascular+leakage+and+anaphylactic+shock.">RhoA and ROCK mediate histamine-induced vascular leakage and anaphylactic shock.</a> Nature Communications. 6, 6725 (2015).</li><li>Schledzewski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+endothelium-specific+hyaluronan+receptor+LYVE-1+is+expressed+by+stabilin-1+,+F4/80+,+CD11b++macrophages+in+malignant+tumours+and+wound+healing+tissue+in+vivo+and+in+bone+marrow+cultures+in+vitro:+implications+for+the+assessment+of+lymphangiogenesis.">Lymphatic endothelium-specific hyaluronan receptor LYVE-1 is expressed by stabilin-1+, F4/80+, CD11b+ macrophages in malignant tumours and wound healing tissue in vivo and in bone marrow cultures in vitro: implications for the assessment of lymphangiogenesis.</a> Journal of Pathology. 209 (1), 67-77 (2006).</li><li>Akwii, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-2-induced+lymphatic+endothelial+cell+migration+drives+lymphangiogenesis+via+the+beta1+integrin-RhoA-formin+axis.">Angiopoietin-2-induced lymphatic endothelial cell migration drives lymphangiogenesis via the beta1 integrin-RhoA-formin axis.</a> Angiogenesis. 25 (3), 373-396 (2022).</li><li>Petrova, T. V., Koh, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+functions+of+lymphatic+vessels.">Biological functions of lymphatic vessels.</a> Science. 369 (6500), eaax4063 (2020).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+cancer+metastasis:+the+'seed+and+soil'+hypothesis+revisited.">The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited.</a> Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 453-458 (2003).</li><li>Mellor, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+dysfunction,+not+aplasia,+underlies+Milroy+disease.">Lymphatic dysfunction, not aplasia, underlies Milroy disease.</a> Microcirculation. 17 (4), 281-296 (2010).</li><li>Connell, F., Brice, G., Mortimer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+primary+lymphedema.">Phenotypic characterization of primary lymphedema.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 140-146 (2008).</li><li>Croteau, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposiform+lymphangiomatosis:+a+distinct+aggressive+lymphatic+anomaly.">Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly.</a> Journal of Pediatris. 164 (2), 383-388 (2014).</li><li>Ji, Y., Chen, S., Peng, S., Xia, C., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposiform+lymphangiomatosis+and+kaposiform+hemangioendothelioma:+similarities+and+differences.">Kaposiform lymphangiomatosis and kaposiform hemangioendothelioma: similarities and differences.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 165 (2019).</li><li>Kriehuber, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+dermal+lymphatic+and+blood+endothelial+cells+reveal+stable+and+functionally+specialized+cell+lineages.">Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages.</a> Journal of Experimental Medicine. 194 (6), 797-808 (2001).</li><li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells.">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li><li>Garrafa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification,+and+heterogeneity+of+human+lymphatic+endothelial+cells+from+different+tissues.">Isolation, purification, and heterogeneity of human lymphatic endothelial cells from different tissues.</a> Lymphology. 38 (4), 159-166 (2005).</li><li>Kazenwadel, J., Secker, G. A., Betterman, K. L., Harvey, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+using+primary+embryonic+mouse+lymphatic+endothelial+cells+uncover+key+roles+for+FGFR1+signalling+in+lymphangiogenesis.">In vitro assays using primary embryonic mouse lymphatic endothelial cells uncover key roles for FGFR1 signalling in lymphangiogenesis.</a> PLoS One. 7 (7), e40497 (2012).</li><li>Steele, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+egress+via+lymphatic+vessels+is+tuned+by+antigen+encounter+and+limits+tumor+control.">T cell egress via lymphatic vessels is tuned by antigen encounter and limits tumor control.</a> Nature Immunology. 24 (4), 664-675 (2023).</li><li>Mammoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+age-dependent+changes+in+cell+size+on+endothelial+cell+proliferation+and+senescence+through+YAP1.">Effects of age-dependent changes in cell size on endothelial cell proliferation and senescence through YAP1.</a> Aging. 11 (17), 7051-7069 (2019).</li><li>Regina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+ageing+and+endothelial+cell+senescence:+Molecular+mechanisms+of+physiology+and+diseases.">Vascular ageing and endothelial cell senescence: Molecular mechanisms of physiology and diseases.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 159, 14-21 (2016).</li><li>Muhleder, S., Fernandez-Chacon, M., Garcia-Gonzalez, I., Benedito, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+sprouting,+proliferation,+or+senescence:+tipping+the+balance+from+physiology+to+pathology.">Endothelial sprouting, proliferation, or senescence: tipping the balance from physiology to pathology.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (4), 1329-1354 (2021).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

מערכת הלימפה היא מווסת חשוב של התפקוד ההומיאוסטטי של הגוף, כאשר הפונקציות החשובות ביותר הן שמירה על פלזמה נוזלית, הסרת תוצרי לוואי של מטבוליזם תאי ומולקולות רעילות, ספיגת שומנים וסחר בתאי מערכת החיסון 1,19. זיהוי הסמנים המתאימים עורר פרץ של נתונים חדשים בתחום הלימפה, וחשף פונקציות חדשות של כלי הדם הלימפטיים, כגון תפקידם בתיקון ויכולת התחדשות של איברים מסוימים 2,3. הידע הגובר על מערכת הלימפה מגדיר את תפקידה במצבים פתולוגיים שונים, ומשנה את ההשקפה המקובלת שהוקמהבעבר 1. מערכת הלימפה ממלאת תפקיד חשוב בתוצאות של מחלות רבות, כגון צמיחת סרטן וגרורות20, מחלת מילרוי, צורה של לימפאדמה ראשונית 21,22, ו Kaposiform Lymphangiomatosis, מצב נדיר המאופיין בהרחבה וחיבור של כלי הלימפה23,24. העובדות הנ"ל מדגישות את תפקידה של מערכת הלימפה בפתולוגיה של מחלות ומחזקות את הצורך להבין עוד יותר את הרגולציה המולקולרית של מערכת זו.
כחלק מתהליך זה, הערכה חוץ גופית של הפיזיולוגיה של תאי אנדותל הלימפה יכולה לחשוף ליקויים תפקודיים, האופייניים למצבים פתולוגיים מסוימים, ויכולה להבהיר את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תנאים אלה. פורסמו מספר פרוטוקולים לבידוד תאי אנדותל לימפטיים, רובם משתמשים במיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות 7,25. השיטה המוצגת היא שיטה יעילה לבידוד תאי אנדותל לימפטיים ללא מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות, אך היא נחותה מבחינת טוהר אוכלוסיית תאי אנדותל הלימפה מטכניקות מיון תאים המופעלות על ידי פלואורסצנטיות, שהיא המגבלה העיקרית של טכניקות מבוססות חרוזים מגנטיים. לשם כך, השיטה יכולה להיות שימושית לזיהוי גס של תפקודי אנדותל לימפטיים או הערכה של מחסור בחלבון בעכברים עם חסר מותנה18 אך אינה מומלצת ליישומי ריצוף RNA. פרוטוקולים מבוססי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות מציעים את היתרון של טוהר גבוה יותר של התאים שנבחרו, שכן הם נבחרים על ידי צביעה משותפת של יותר מסמן לימפתי ספציפי אחד, והם מהירים יותר כאשר השלב בן מספר ימים של צמיחת תאים לפני טיהור חרוזים מגנטי מושמט. יתרון משמעותי נוסף של פרוטוקולים מבוססי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות הוא שאין צורך בחרוזים מגנטיים, מה שהופך אותם לחסכוניים יותר. החיסרון של שיטות הבידוד מבוססות החרוזים המגנטיים הוא הירידה בתפוקה המתקבלת, אך כאשר קיים ציוד מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות, זוהי שיטת טיהור מועדפת.
בעבר זיהינו שהזיהום של תאי אנדותל לימפטיים שבודדו מעורם של עכברים בוגרים עם תאי חיסון מסוג LYVE-1+ היה פחות מ-10%18, כאשר הדוגמה הנוכחית באיור 3 מראה זיהום של ~5% של מקרופאגים מסוג LYVE-1+. LYVE-1 הוא סמן לימפתי קלאסי ושולב בהצלחה עם CD31 ו- CD34 לטיהור מבוסס חרוזים מגנטיים של דם ותאי אנדותל לימפה26. השילוב LYVE-1 ו- CD31 מספק אוכלוסיית תאי אנדותל לימפטיים עם טוהר גבוה. ברירה חלופית מבוססת חרוזים מגנטיים דווחה בשילוב של UEA-1 ונוגדן D2-4027. טכניקה מבוססת חרוזים מגנטיים לבידוד תאי אנדותל לימפטיים של העור, באמצעות הרחקה (ברירה שלילית) של תאי המטרה ומעורבות של שלבי טיהור נוספים, בוצעה בהצלחה בעוברי עכברים28, ואם היא ישימה בעכברים בוגרים, היא בהחלט יכולה לשמש לבידוד אוכלוסיות אנדותל לימפטיות טהורות ליישומים רלוונטיים במורד הזרם. עם זאת, לברירה השלילית יש מגבלה שלא ניתן לבחור את כל התאים הנקשרים לחרוזים, שכן אנו עדים גם לתאים חיוביים LYVE-1+ שלא נבחרו, הקשורים בפחות חרוזים ולכן אינם קשורים מספיק למגנט לבחירה.
טכניקת בידוד דומה מבוססת חרוזים מגנטיים, לבידוד תאי אנדותל לימפטיים מהריאה של עכברים בוגרים, מבוססת על ברירה מבוססת פודופלנין של תאי אנדותל הלימפה14. מבנה הפרוטוקולים דומה מאוד, כאשר ההבדל העיקרי הוא המטרה; עם זאת, לא ביצענו ניתוח השוואתי כדי לזהות הבדלים ביבול ובטוהר. ידוע כי תת-אוכלוסיות לימפה שונות עשויות להשתנות 9,27,29. תחת ספקטרום זה, חשוב להדגיש כי לא כל תאי האנדותל הלימפה העורי הם LYVE-1+. ישנם הבדלים בביטוי LYVE-1 באותה רקמה, ברקמות דלקתיות, כגון גידולים, כאשר LYVE-1 ממלא תפקיד בהסננת תאי T CD8+ 29 או בנימי הלימפה לעומת כלי איסוף הלימפה9. זה מוביל את ההבדל בשיטה זו, להיות ספציפי עבור בידוד תאי אנדותל הלימפה של תת סוג של תאי אנדותל הלימפה, בעיקר מן נימי הלימפה ולא כלי איסוף9. לפיכך, השיטה המוצגת ישימה לתופעות המוסדרות בעיקר בנימים, אך גם מגבילה את מאגר תאי האנדותל הלימפטיים שניתן לבודד.
מגבלה של שיטות מבוססות חרוזים מגנטיים היא הערכה אופציונלית של טוהר על ידי ניסוי ציטומטריית זרימה. בעבר זיהינו שהזיהום של תאי אנדותל לימפטיים שבודדו מעורם של עכברים בוגרים עם תאי חיסון מסוג LYVE-1+ היה פחות מ-10%18, כאשר הדוגמה הנוכחית באיור 3 מאשרת את הממצא הזה, והדגימה זיהום של ~5% במקרופאגים מסוג LYVE-1+. ניסוי ציטומטריית זרימה עם צביעת F4/80 של אוכלוסיית התאים המבודדת הראשונית (לא מוצג) גילה נוכחות של ~3% מקרופאגים, הכוללים גם את המקרופאגים LYVE-1. לפיכך, האחוז המוגבר באוכלוסיית התאים שנבחרו בחרוזים מצביע על שיטת טיהור יעילה. בהתחשב בכך שאחוז המקרופאגים בעור של עכברים בריאים נמוך יותר מאשר כאשר הגידול או הדלקת קיימים17, זה מגביר את אמינות השיטה בעכברים בריאים. שימו לב שישנם תאים שלא נבחרו שאליהם מחובר חרוז מגנטי אחד או יותר (לא מוצג), מה שמוודא שכדי שהתאים ייבחרו בחרוזים חייבים להיות מחוברים אליהם חרוזים רבים (איור 2) ושתאים מסוימים עם רמות נמוכות יותר של ביטוי LYVE-1 (שאליהם מחוברים חרוזים) לא נבחרו.
ליישום מוצלח של הפרוטוקול, חיוני לעקוב אחר תזמון הדגירה של תאי האנדותל הלימפטיים עם החרוזים המגנטיים המצומדים לנוגדנים LYVE-1, שכן דגירה מוגברת עלולה להוביל לקשירה לא ספציפית. גורם קריטי נוסף הוא עיתוי הטחינה של העור, כדי להבטיח את הישרדותם של תאים רבים ככל האפשר. תאי אנדותל לימפטיים אינם אוכלוסיית התאים השולטת; לכן, לאחר הטיהור, צפוי להתקבל מספר מוגבל של תאים. מבחינת מספר העכברים שניתן לעבד בבת אחת, עיבדנו עד ארבעה עכברים ללא הבדלים ניכרים ביבול בין העכבר הראשון לאחרון. ניתן ליישם את הפרוטוקול בשני המינים ובגילאים שונים, אם כי גיל העכברים הבוגרים הוא גורם מכריע בפוטנציאל השכפול של תאי האנדותל. בדומה לתאי אנדותל אנושיים30, גיל עכבר מוגבר מוביל להזדקנות מוגברת31,32 ומכאן, פוטנציאל השכפול המוגבל של התאים המבודדים. יבול גבוה יותר צפוי להיות מסופק עבור עכברים צעירים (<3 חודשים) עבור רקע C57BL6, שבו השתמשנו והוא הרקע העכבר במחקר זה. בסך הכל, הפרוטוקול מציג שיטה יעילה לבידוד תאי אנדותל לימפטיים עוריים, שניתן להשתמש בה ליישומים שבהם הטוהר המוחלט של אוכלוסיית תאי האנדותל הלימפטיים המבודדים אינו מקבל עדיפות: התאים המטוהרים יכולים לשמש לניסויים במבחנה או לאימות חסר בגן המעניין בעכברים מוטנטיים ספציפיים לאנדותל הלימפה. זה יכול להיות שימושי במיוחד עבור עכברים טרנסגניים או מודלים ניסיוניים של בעלי חיים, שבהם הטיהור המהיר והגס של תאי אנדותל הלימפה הוא בראש סדר העדיפויות, ובמכונים ובמתקנים שבהם ממיין תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות אינו זמין.

מערכת הלימפה ממלאת תפקיד מרכזי בפיזיולוגיה האנושית. זה נחשב גורם הומיאוסטטי חיוני, המאפשר פונקציות חשובות, כגון שמירה על איזון נוזל רקמות-פלזמה, מעקב חיסוני, ספיגת שומנים1, כמו גם פונקציות שזוהו לאחרונה, כגון יכולת התיקון של הלב2 ואת יכולת התחדשות של עצם hematopoiesis3. למרות התפקיד המשמעותי של מערכת הלימפה, מספר היבטים של תפקיד הלימפה, כמו גם המנגנונים המולקולריים השולטים בפרמטרים פיזיולוגיים מסוימים ובתגובות נותרו חמקמקים. יתר על כן, פגמים בכלי הלימפה הם גורמים מפעילים או מתדרדרים במצבים פתופיזיולוגיים מסוימים. דוגמאות ידועות הן הלימפאדמה הראשונית והמשנית, בהתאם למקור הגנטי או הלא גנטי של המחלה, בהתאמה, בעוד שתפקידה של מערכת הלימפה על צמיחת הגידול הראשונית והפצה גרורתית הוא מרכזי, שכן הוא יכול לשמש צינור לגרורות ומודולטור של תפקודי החיסון1.
הפיגור במחקר ובידע של הלימפה בהשוואה לכלי הדם נובע בעיקר מגילוי מאוחר יותר של מערכת הלימפה בהשוואה למערכת כלי הדם והעיכוב בזיהוי סמנים מולקולריים ספציפיים ללימפה. זה השתפר מאוד בעשורים האחרונים, מה שהוביל לשינוי התמונה הקונבנציונלית של הלימפה במצב יציב ובתנאים חולים1. בדומה לאנגיוגנזה, לימפנגיוגנזה היא היווצרות כלי לימפה חדשים מאלו הקיימים וממלאת תפקיד מרכזי בהתפתחות קשת רחבה של מחלות 4,5,6. עם זאת, בניגוד לאנגיוגנזה, חקירת הלימפנגיוגנזה הוגבלה בעיקר למודלים in vivo המתמקדים בהיווצרות כלי דם התפתחותיים ופגמים מבניים במודלים פתולוגיים. הבידוד של תאי אנדותל הלימפה חשוב למחקרי מבחנה, וזה יכול להיות מסופק על ידי הפרוטוקול המוצג.
פותחו מספר פרוטוקולים לבידוד אנדותל לימפתי מעכברים, המחייבים שימוש במיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות7. היתרון של ממיין התאים, כאשר זמין, הוא דרגת טוהר גבוהה יותר, בניגוד לבידוד מבוסס חרוזים, כאשר האחרון מספק תפוקה גבוהה יותר. הפרוטוקול משתמש בביטוי של קולטן לימפתי אנדותל היאלורונן 1 (LYVE-1), סמן אנדותל לימפטי, החשוב לסחר בתאים בתוך כלי הלימפה 4,8. מכיוון שביטוי LYVE-1 מוגבל לנימי הלימפה ולא לכלי הלימפה האוספים, הטכניקה מתאימה לבידוד תאי אנדותל לימפטיים דווקא מהנימים הלימפטיים בניגוד לסמנים לימפטיים אחרים, כגון פודופלנין, המתבטאים באופן אחיד בכל תאי האנדותל הלימפטיים9. עבור הפרוטוקול, סמנים לימפטיים חשובים אחרים שלא היו transmembrane, כגון Prox1, נשללו.
מכיוון שהתוצאה הפיזיולוגית הייתה לימפנגיוגנזה, המופעלת בדרך כלל בנימי הלימפה, LYVE-1 נבחר כמטרה בשל הסלקטיביות שלו בתאים אלה ומכיוון שהנוגדן שנבחר סיפק תפוקה גבוהה. האנזימים בהם נעשה שימוש היו collagenase type II, הידוע בדרך כלל כיעיל יותר בדיסוציאציה של קולגן מאשר סוג I10, ו-dispase, פרוטאז רחב יותר, המשמש באופן קבוע להפרדת דרמיס-אפידרמיס11; עם זאת, אנזימים אחרים להפרדת רקמות דווחו12,13 וניתן להשתמש בהם. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר שיטה לבידוד תאי אנדותל לימפטיים עוריים מנימי לימפה של עכברים בוגרים בעלי תפוקה גבוהה באמצעות טיהור חרוזים מגנטיים, במיוחד במקומות שבהם מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות אינו זמין. השיטה מתאימה ליישומים שבהם טוהר תאי האנדותל הלימפטיים עלול להיפגע עבור יישומים במורד הזרם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m Syringe Filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-719C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Hair Clipper</td>
			<td>Wahl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11992-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>542040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>542070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, High Concentration Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td>dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Solution (2,500 U/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynal MPC-L Magnetic Particle Concentrator</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>120-21D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Base Medium &#38; Supplement (LEC medium)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>CCM027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia chamber</td>
			<td>Euthanex Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1432S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LARC-A E-Z Anesthesia Induction Chamber</td>
			<td>Euthanex Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Solution 4% in PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30256FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Mouse LYVE-1</td>
			<td>ReliaTech GmbH</td>
			<td>103-PA50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating/Shaking Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polypropylene Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters w 0.2 &#956;m Pores</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-719C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine dermal lymphatic endothelial cell isolation

מערכת הלימפה משתתפת בוויסות המעקב החיסוני, ספיגת שומנים ואיזון נוזלים ברקמות. הבידוד של תאי אנדותל לימפטיים מורין הוא תהליך חשוב למחקר הלימפה, שכן הוא מאפשר ביצוע ניסויים חוץ גופיים וביוכימיים על התאים המבודדים. יתר על כן, הפיתוח של טכנולוגיית Cre-lox איפשר מחסור ספציפי לרקמות של גנים שלא ניתן למקד באופן גלובלי, מה שהוביל לקביעה מדויקת של תפקידם ברקמות הנחקרות. דיסקציה של תפקידם של גנים מסוימים בפיזיולוגיה הלימפטית ובפתופיזיולוגיה דורשת שימוש במקדמים ספציפיים ללימפה, ולפיכך, אימות ניסיוני של רמות הביטוי של הגנים הממוקדים.
שיטות לבידוד יעיל של תאי אנדותל לימפטיים מעכברי בר או עכברים טרנסגניים מאפשרות שימוש בבדיקות ex vivo ו - in vitro כדי לחקור את המנגנונים המווסתים את תפקודי הלימפה ואת זיהוי רמות הביטוי של החלבונים הנחקרים. פיתחנו, תקננו והצגנו פרוטוקול לבידוד יעיל של תאי אנדותל לימפטיים עוריים (DLECs) באמצעות טיהור חרוזים מגנטי המבוסס על ביטוי LYVE-1. הפרוטוקול המתואר נועד לצייד את החוקרים בכלי להבנה נוספת ולהבהרה של שחקנים חשובים של תפקודי תאי אנדותל לימפה, במיוחד במתקנים שבהם ציוד מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות אינו זמין.

The lymphatic system plays a pivotal role in human physiology. It is considered a vital homeostatic factor, that facilitates important functions, such as the maintenance of tissue-plasma fluid balance, immune surveillance, and lipid absorption1, as well as recently-identified functions, such as the repair ability of the heart2 and regenerative capacity of bone and hematopoiesis3. Despite the significant role of the lymphatic system, several aspects of the role of the lymphatics, as well as the molecular mechanisms governing certain physiological parameters and responses remain elusive. Moreover, lymphatic vascular defects are triggering or deteriorating factors in certain pathophysiological conditions. Well-known examples are the primary and secondary lymphedemas, depending on the genetic or non-genetic origin of the disease, respectively, while the role of the lymphatic system on primary tumor growth and metastatic dissemination is pivotal, as it can act as a conduit for metastasis and modulator of immune functions1.
The lag in the study and knowledge of the lymphatic compared to the blood vasculature is mainly due to the later discovery of the lymphatic system in comparison with the blood vascular system and the delay in the identification of lymphatic-specific molecular markers. This has greatly improved in recent decades, leading to the alteration of the conventional picture of the lymphatics at steady state and in diseased conditions1. Similar to angiogenesis, lymphangiogenesis is the formation of new lymphatic vessels from pre-existing ones and plays a pivotal role in the development of a wide spectrum of diseases4,5,6. However, unlike angiogenesis, the investigation of lymphangiogenesis has been limited to mostly in vivo models focusing on developmental vessel formation and structural defects in pathological models. The isolation of the lymphatic endothelial cells is important for in vitro studies, and this can be provided by the presented protocol.
Several protocols for lymphatic endothelial isolation from mice have been developed, which require the use of fluorescence-activated cell sorting7. The advantage of the cell sorter, where available, is the higher degree of purity, contrary to bead-based isolation, with the latter providing a higher yield. The protocol utilizes the expression of lymphatic endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE-1), a lymphatic endothelial marker, important for cell trafficking within the lymphatic vessels4,8. Since LYVE-1 expression is limited to the lymphatic capillaries and not the collecting lymphatic vessels, the technique is suitable for the isolation of lymphatic endothelial cells specifically from the lymphatic capillaries, contrary to other lymphatic markers, such as podoplanin, which are expressed uniformly in all lymphatic endothelial cells9. For the protocol, other important lymphatic markers that were not transmembrane, such as Prox1, were excluded.
As the physiological outcome was lymphangiogenesis, which is usually initiated at the lymphatic capillaries, LYVE-1 was selected as a target due to its selectivity in these cells and because the selected antibody provided a high yield. The enzymes used were collagenase type II, which is generally known to be more effective in collagen dissociation than type I10, and dispase, a broader protease, regularly used for dermis-epidermis separation11; however, other enzymes for tissue separation have been reported12,13 and can be used. The goal of this protocol is to describe a method for dermal lymphatic endothelial cell isolation from lymphatic capillaries of adult mice with high yield using magnetic bead purification, especially in places where fluorescence-activated cell sorting is not readily available. The method is suitable for applications where the purity of lymphatic endothelial cells can be compromised for downstream applications.

מחבר זרקור: בידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל לימפה עורית מורין

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

Our group's research focuses on delineating the mechanisms regulating endothelial cell physiology. This protocol describes a method for magnetic bead-based isolation of renal endothelial cells, specifically from thermal lymphatic capillaries in facilities where fluorescence-activated cell sorting is not available. The protocol allows the isolation of lymphatic endothelial cells from transgenic mice to study their physiology in vitro.It is particularly suitable where the purity of the lymphatic endothelial cells can be compromised for downstream applications. This process provides a high yield of lymphatic endothelial cells obtained from the lymphatic capillaries and not other collecting vessels. It is also a nice alternative in the case of the absence of cell sorting facilities.

השיטה פותחה כדי לזהות את ביטוי החלבון של GTPase קטן, RhoA, שהגן המקודד שלו נפל בשני האללים ונמחק תחת השפעת מקדם האנדותל הלימפתי המושרה בטמוקסיפן Prox1-CreERT2 18. ניתן לתרבית את ה- LECs המבודדים עד ארבעה דורות, ולאחר מכן הם הופכים למזדקנים. הם הוקפאו, הופשרו ועוררו בהצלחה עם אנגיופויטין-2. בשל המספר המוגבל של מעברי תאים, לא ניסינו מחזורי הקפאה-הפשרה מרובים. תפוקת התאים הטיפוסית בבידוד מעכבר אחד מספקת מפגש של 40-50% (~ 1.5 × 106 תאים) של צלחת 60 מ"מ, וההתרבות איטית, מכיוון שהמנה מגיעה למפגש לאחר 5 ימים כאשר אנו מבצעים את הטיהור מבוסס LYVE-1.
לאחר הטיהור הראשון, לתאי LYVE-1+ יש מפגש של 15% של צלחת 60 מ"מ (~ 4 × 105 תאים). סבב שני של טיהור הוא אופציונלי, והנתונים והתמונות המסופקים הם כולם עם סבב אחד של טיהור. ישנם מספר תאים שאינם נבחרים, הנושאים חרוזים מגנטיים, ונראה כי מספר החרוזים שהוצמדו לא הספיק לבחירתם. תוספת של DNAse במקביל לעיכול dispase מומלץ תמיד, כאמור, אם כי לא ראינו עלייה ניכרת בתשואה. עבור ניסוי ההדגמה בכתב היד הנוכחי, השתמשנו בעכברים הנושאים את כתב הפלואורסצנט tdTomato, שבו השתמשנו בעבר בשילוב עם גנים floxed ומקדמים שונים16,18. מטרת השימוש בעכברים אלה הייתה (אדום; PE+) תצוגה פלואורסצנטית של התאים המבודדים.
השלבים השונים של עיבוד הרקמה מודגמים באיור 1A, עם תמונות של העור המורחב של העכברים לפני הטיפול הלילי בדיספאז (איור 1B), הסרת האפידרמיס מהדרמיס למחרת (איור 1C), וטחינת הדרמיס לצורך בידוד התאים מיד לאחר מכן (איור 1D). לאחר טיהור תאי LYVE-1+ באמצעות הדגירה עם החרוזים המגנטיים, התאים מזוהים בקלות עם כמה חרוזים שמחוברים אליהם (איור 2) במפגש נמוך, שבו תאים בודדים מוצגים 24 שעות לאחר הבידוד (איור 2A-C) ובמפגש גבוה, 7 ימים לאחר מכן (איור 2D). מוצגות תמונות בהגדלה נמוכה מאוכלוסיית התאים המעורבים שבודדו מהדרמיס של העכבר (איור 2E).
נתוני ציטומטריית זרימה אינדיקטיבית מוצגים מהניתוח האופציונלי כדי לזהות את אחוז המקרופאגים LYVE-1+ באוכלוסיית תאי אנדותל הלימפה המבודדים. איור 3 מראה את אסטרטגיית גאטומטריית הציטומטריה של הזרימה, כאשר 5% מתאי LYVE-1+ שנבחרו היו חיוביים עבור F4/80 (מקרופאגים). אחוז זה גדל מ -3% מתאי F4/80+ בתאי העור המורין המבודדים (לא מטוהרים) (לא מוצגים). הפלואורסצנטיות האדומה האנדוגנית של העכברים הטרנסגניים מאפשרת ניטור משלים באמצעות פלואורסצנטיות. ככל שהתאים מתרבים, צפיפות החרוזים המגנטיים המחוברים יורדת, ושלב טיהור אופציונלי כנגד סמנים לימפטיים אחרים כגון VEGFR3 או פודופלנין14 יכול לספק אוכלוסיית תאי אנדותל לימפטיים מטוהרים יותר.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65393/65393fig01.jpg"> איור 1: הדגמה של שלבים שונים בתהליך בידוד הרקמה והתאים. (A) סכימה גרפית של שלבי הפרוטוקול. (B) העור הנכרת ממוקם בצלחות תרבית רקמה עם תמיסת דיספז לדגירת לילה בטמפרטורה של 4°C. (C) ניתוק האפידרמיס מהדרמיס הבסיסי למחרת. (D) עיבוד רקמות של הדרמיס לצורך הפרדה ובידוד של תאי הרקמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65393/65393fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65393/65393fig02.jpg"> איור 2: תמונות מייצגות של תאי +LYVE-1 מטוהרים. (A,B) תמונות ברייטפילד (למעלה) ופלואורסצנטי (למטה) של תאים בודדים מבודדים מסוג LYVE-1+, 24 שעות לאחר הטיהור, עם החרוזים מחוברים; פסי קנה מידה = 31 ו- 25 מיקרומטר. (C) ברייטפילד (משמאל), פלואורסצנטי (במרכז) ותמונות ממוזגות (מימין) של תא מייצג 24 שעות לאחר הטיהור; סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. (D) תמונות שדה בהיר (למעלה) ופלואורסצנטי (למטה) של התאים המבודדים עם התפשטות ובמפגש גבוה 7 ימים לאחר הטיהור; סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (E) ברייטפילד (משמאל) ופלואורסצנטי (במרכז) תמונות הגדלה נמוכה של אוכלוסיית תאים מעורבת 5 ימים לאחר הבידוד מהדרמיס; סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65393/65393fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65393/65393fig03.jpg"> איור 3: אסטרטגיית ציטומטריית זרימה ונתונים. חישוב אחוז אוכלוסיית המקרופאגים בתוך תאי LYVE-1+ שנבחרו (כחול: תאים בודדים (סינגלט); אדום: אשכולות תאים). קיצורים: FSC-A = אזור פיזור-שיא קדמי; SSC-A = אזור פיזור צדדי; FSC-H = גובה פיזור שיא קדימה; RFP = חלבון פלואורסצנטי אדום; FITC = isothiocyanate fluorescein; PE = phycoerythrin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65393/65393fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation at JoVE.com

מאמר זה מתאר שיטה לבידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל מורין מנימי לימפה עוריים. תאי האנדותל הלימפטיים המבודדים יכולים לשמש לניסויים במבחנה במורד הזרם ולניתוח ביטוי חלבונים.

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...

המחקר של הקבוצה שלנו מתמקד בהתוויית המנגנונים המווסתים את הפיזיולוגיה של תאי האנדותל. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל כלייתיים, במיוחד מנימי לימפה תרמיים במתקנים שבהם מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות אינו זמין. הפרוטוקול מאפשר בידוד של תאי אנדותל לימפטיים מעכברים טרנסגניים כדי לחקור את הפיזיולוגיה שלהם במבחנה.זה מתאים במיוחד כאשר הטוהר של תאי אנדותל הלימפה יכול להיפגע עבור יישומים במורד הזרם. תהליך זה מספק תפוקה גבוהה של תאי אנדותל לימפטיים המתקבלים מנימי הלימפה ולא מכלי איסוף אחרים. זוהי גם חלופה נחמדה במקרה של היעדר מתקני מיון תאים.

murine-dermal-lymphatic-endothelial-cell-isolation

Google

Research

JoVE Journal

Biology

945 Views.  Texas Tech University Health Sciences Center. המחקר של הקבוצה שלנו מתמקד בהתוויית המנגנונים המווסתים את הפיזיולוגיה של תאי האנדותל. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל כלייתיים, במיוחד מנימי לימפה תרמיים במתקנים שבהם מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות אינו זמין. הפרוטוקול מאפשר בידוד ש...

Video: מחבר זרקור: בידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל לימפה עורית מורין

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic endothelial cells is an important process for lymphatic research, as it allows the performance of in vitro and biochemical experiments on the isolated cells. Moreover, the development of Cre-lox technology has enabled the tissue-specific deficiency of genes that cannot be globally targeted, leading to the precise determination of their role in the studied tissues. The dissection of the role of certain genes in lymphatic physiology and pathophysiology requires the use of lymphatic-specific promoters, and thus, the experimental verification of the expression levels of the targeted genes.
Methods for efficient isolation of lymphatic endothelial cells from wild-type or transgenic mice enable the use of ex vivo and in vitro assays to study the mechanisms regulating the lymphatic functions and the identification of the expression levels of the studied proteins. We have developed, standardized and present a protocol for the efficient isolation of murine dermal lymphatic endothelial cells (DLECs) via magnetic bead purification based on LYVE-1 expression. The protocol outlined aims to equip researchers with a tool to further understand and elucidate important players of lymphatic endothelial cell functions, especially in facilities where fluorescence-activated cell sorting equipment is not available.

This paper describes a method for magnetic bead-based isolation of murine endothelial cells from dermal lymphatic capillaries. The isolated lymphatic endothelial cells can be used for downstream in vitro experiments and protein expression analysis.

Isolation of Cells from Murine Dermis

Perform the protocol inside a biosafety cabinet on the euthanized mouse appropriately shaved and disinfected with 70%ethanol. Create a 0.5-inch superficial incision in the animal's abdomen using scissors. Cut longitudinally along the midline towards the neck and lower abdomen.Additionally, make lateral cuts to flap open the skin. Using blunt forceps, gently separate the skin from surrounding tissues, while going around the animal's torso cutting the skin laterally around the neck and the lower abdomen. Carefully place the skin with the dermis side facing down in a 100-millimeter tissue culture plate.And ensure the skin is as stretched as possible. Add six milliliters of Dispase solution to the plate, ensuring the skin is completely covered. Then, cover the plate.Wrap the plate with Parafilm. Incubate the plate at room temperature for 10 minutes to flatten the explant. The next day, using a pipette, remove the liquid from the plate containing the isolated skin.Then, with the aid of forceps, separate the dermis from the epidermis while removing any visible adipose tissue from it. And place the isolated dermis into a clean tissue culture plate. Add one milliliter of DMEM containing 1X antibiotic-antimycotic solution to the dermis in the culture plate.Tilt the plate to accumulate the liquid on one side of the plate. Then, mince the dermis into pieces of one to two square millimeters. And transfer them to a new 50-milliliter conical tube.Add 10 milliliters of collagenase type II solution to the tube. Incubate it for two hours at 37 degrees Celsius with continuous agitation at 30 to 50 rpm to digest the dermis. Filter the cell suspension through a 70-micron cell strainer.And centrifuge it at 250g for five minutes. After discarding the supernatant, resuspend the pellet in 10 millimeters of DMEM containing antibiotic-antimycotic solution. Filter the cell suspension through a 40-micron cell strainer before centrifuging, as demonstrated previously.Resuspend the resulting cell pellet in one milliliter of complete LEC media. Then, plate the cells in complete LEC media in a collagen-coated 60-millimeter tissue culture plate. Replace the media every two days by washing cells with PBS twice and adding fresh LEC media.Low magnification images of cells isolated from the murine dermis showed a mixed cell population.

בידוד תאים ממורין דרמיס

Murine Lymphatic Endothelial Cell Purification

To purify urine lymphatic endothelial cells, use cells isolated from the murine dermis after they reach about 80 to 90%Co-fluency, begin by washing pre-coded magnetic beads in a magnetic separator using one milliliter of magnetic bead coating solution. Resuspend the beads in 150 microliters of DMEM containing 0.1%BSA. Next, wash the cells in the 60 millimeter tissue culture plate twice with PBS.Mix 50 microliters of the antibody conjugated beads with three milliliters of DMEM containing 0.1%BSA and add it to the cells. Seal the dish with biofilm, then incubate the dish on a shaker agitating at 10 RPM at room temperature for exactly 10 minutes. Discard the medium before washing the cells once with PBS.Quickly inspect the cells to verify the presence of LEC colonies on the plate. Add one milliliter of tripsin EDTA to the cells and incubate for three minutes at 37 degrees Celsius to trypsinize the cells. Inspect the cells for successful cell detachment.After neutralizing the solution with two milliliters of complete LEC media. Transfer the cell solution to a five milliliter sterile polypropylene tube. Using a magnetic separator, wash the cells with three milliliters of DMEM containing 0.1%BSA to remove unbound cells.Resuspend the remaining bead bound cells in complete LEC media and plate them onto collagen coated 60 millimeter tissue culture plates. Brightfield and fluorescence imaging easily identified the LYVE1 positive lymphatic endothelial cells after purification and showed several beads attached to them. The cells displayed low-confluency 24 hours after purification, while they were highly cofluent, seven days after purification.