Este trabajo fue apoyado por la Fundación Helénica para la Investigación y la Innovación (00376), los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional del Cáncer (NCI) [subvención R15CA231339], la subvención de la Oficina de Ciencias de la Facultad de Farmacia del Centro de Ciencias de la Universidad Tecnológica de Texas (TTUHSC) (a C.M.M.), y por la financiación inicial de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Louisiana Monroe. los Institutos Nacionales de Salud (NIH) a través del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales [Subvención P20 GM103424-21] y el Subprograma de Competitividad en Investigación (RCS) de la Junta de Regentes de Luisiana a través del Fondo de Apoyo de la Junta de Regentes (LEQSF(2021-24)-RD-A-23) (a G.M.). El equipo TTUHSC común utilizado se obtuvo a través de las subvenciones del Instituto de Investigación para la Prevención del Cáncer de Texas (CPRIT, por sus siglas en inglés) RP190524 y RP200572. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la decisión de escribir o la preparación del manuscrito. El resumen gráfico de la Figura 1A se creó con BioRender.com.

Los estudios en animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Tecnológica de Texas (TTUHSC) para los experimentos en TTUHSC y por la Administración Veterinaria de la Prefectura de Grecia Occidental de acuerdo con la Directiva 2010/63 para los experimentos en la Universidad de Patras. Siga diligentemente las normas de eliminación de residuos al deshacerse de los materiales de desecho de animales.
1. Aislamiento de la dermis del ratón
<ol><li>Día 1 NOTA: El día 1; Prepare los siguientes materiales y equipos: cámara de anestesia, cortapelos de animales, isoflurano, pinzas finas, filtros de jeringa de 0,2 μm.<ol><li>Prepare una solución de 2 mg/mL de dispasa en DMEM con 1x solución antibiótica-antimicótica y filtre-esterilize. NOTA: El uso de medio o PBS puede ser reemplazado por HBSS, ya que ha sido utilizado con éxito en otros protocolos reportados12. La solución antibiótica-antimicótica 1x puede sustituirse por la adición de penicilina (100 U.I./mL), estreptomicina (100 μg/mL) y anfotericina (2,5 μg/mL).</li>
		<li>Anestesiar al ratón colocándolo en una cámara de anestesia con administración de isoflurano (0,5-2% de isoflurano, flujo: 1 L/min). Después de que el ratón deje de moverse, transfiéralo fuera de la jaula y continúe con la anestesia ajustando un cono de nariz con un flujo de isoflurano similar. Pellizque los dedos de los pies del animal para confirmar los niveles suficientes de anestesia y controle constantemente al ratón para asegurarse de que se conserve la anestesia profunda (sin motilidad). Cortar aproximadamente 9cm2 del pelaje dorsal y ventral (dorso y abdomen de ratón respectivamente) longitudinalmente a lo largo de la línea media, utilizando una cortadora de pelo. Deje que el ratón se recupere de la anestesia y devuélvalo a la jaula. NOTA: En su lugar, se puede usar crema depilatoria (depilación). Asegúrese de que el pelaje se elimine por completo en las áreas de la piel que se van a aislar mientras se mantiene la integridad de la piel. Trate de recortar el área de piel lo más extendida posible. Para garantizar que se resuelva la posible inflamación de la depilación, el aislamiento celular debe realizarse al día siguiente. Para aumentar el número de células aisladas, agrupe de 2 a 4 ratones por grupo.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 2 NOTA: Mantenga listos los siguientes materiales y equipos: cámara de eutanasia, gabinete de bioseguridad, incubadora de CO2 , etanol, tijeras finas, pinzas finas, pinzas romas, placa de cultivo de tejidos de 100 mm, dispasa, DMEM, 1x solución antibiótica-antimicótica.<ol><li>Eutanasiar al ratón mediante la administración de CO2 y colocarlo en posición supina, exponiendo el área recortada. Rocíe etanol al 70% como desinfectante. NOTA: A partir de este paso, todos los pasos deben realizarse en condiciones estériles (en una cabina de bioseguridad).</li>
		<li>Coloque una placa estéril de cultivo de tejidos de 100 mm sobre hielo.</li>
		<li>Haga un corte superficial de 0.5 pulgadas en el abdomen y corte longitudinalmente a lo largo de la línea media hasta el cuello y la parte inferior del abdomen. Realiza cortes laterales para poder abrir la piel con solapa. NOTA: El tamaño de la incisión y el área de la piel aislada dependen del tamaño del ratón.</li>
		<li>Con pinzas romas, separe cuidadosamente la piel de los tejidos circundantes. Hazlo rodeando todo el torso del ratón, cortando la piel lateralmente alrededor del cuello y la parte inferior del abdomen.</li>
		<li>Coloque con cuidado la piel en la placa de cultivo de tejidos de 100 mm, con el lado de la dermis hacia abajo, manteniendo la piel lo más estirada posible. Cubra los platos y manténgalos en hielo. Completar el aislamiento de todos los ratones del grupo.</li>
		<li>Después de extraer la piel de todos los ratones, incube las placas durante 10 minutos a temperatura ambiente para aplanar el explante.</li>
		<li>Añadir 6 mL de solución de Dispasa a la placa, asegurándose de que la piel esté completamente sumergida e incubar durante la noche con una leve agitación a 4 °C. NOTA: En lugar de Dispasa, también se puede realizar la digestión con tripsina12, seguida de un tratamiento con Liberase en lugar de Colagenasa Tipo II (abajo).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Aislamiento celular de la dermis
<ol><li>Día 3 NOTA: Mantenga listos los siguientes materiales y equipos: centrífuga, incubadora de CO2 , gabinete de bioseguridad, tijeras, DMEM, 1x solución antibiótica-antimicótica, colagenasa tipo II, PBS, tubo cónico de 50 mL, placas de cultivo de tejidos de 100 mm y 60 mm, solución de ADNasa I, colágeno tipo I, filtros celulares de 70 μm y 40 μm, filtros de jeringa de 0,2 μm, medio LEC.<ol><li>Prepare 500 mL de 1x PBS (1,37 M de NaCl, 27 mM de KCl, 100 mM de Na2HPO4, 18 mM de KH2PO4, pH 7,4) y autoclave durante 20 min a 15 psi o filtro-esterilización. Alternativamente, use PBS estéril disponible en el mercado.</li>
		<li>Prepare 10 mL de solución de 2 mg/mL de colagenasa Tipo II en DMEM con 1x Solución Antibiótica-Antimicótica y filtre-esterilice. NOTA: Realice los siguientes pasos bajo una campana estéril para disminuir las posibilidades de contaminación de la muestra.</li>
		<li>Utilice una pipeta para eliminar el líquido del plato.</li>
		<li>Use fórceps para separar la dermis (parte inferior de la piel) de la epidermis (parte superior) y eliminar cualquier tejido adiposo evidente. Transfiera la dermis a una placa de cultivo de tejidos limpia.</li>
		<li>Agregue 1 mL de DMEM con 1x solución antibiótica-antimicótica en la placa de cultivo de tejidos limpia e inclínela para que el líquido se acumule en un lado de la placa.</li>
		<li>Picar la dermis en2 trozos de 1-2 mm y transferirlos a un nuevo tubo cónico de 50 mL. NOTA: Idealmente, este paso debe completarse dentro de los 4-5 minutos, ya que no se espera que un procesamiento más prolongado proporcione un mayor rendimiento o supervivencia celular.</li>
		<li>Añadir 10 mL de la solución de colagenasa tipo II.</li>
		<li>Añadir 50 μL (25 unidades/mL de la solución) de solución de ADNasa I (reduce la aglomeración celular) y digerir la solución dérmica durante 2 h a 37 °C con agitación continua (utilizar una incubadora giratoria/agitadora a 30-50 rpm). NOTA: Revise periódicamente para identificar si la mayor parte de la dermis ha sido digerida. De lo contrario, aumente el tiempo de digestión (1 h adicional como máximo) y la velocidad de agitación, si es posible.</li>
		<li>Cubrir placas de cultivo de tejidos de 60 mm con 2 mL de colágeno tipo I de 10 μg/mL en ácido acético 0,02 M durante >20 min a 37 °C. Lavar 2 veces con PBS estéril.</li>
		<li>Filtrar la suspensión celular con un colador celular de 70 μm y centrifugar a 250 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender en 10 mL de DMEM con 1x Solución Antibiótica-Antimicótica.</li>
		<li>Filtrar la suspensión celular con un colador celular de 40 μm y centrifugar a 250 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender en 1 mL de medio LEC completo (Medio Base de Crecimiento de Células Endoteliales con Suplemento).</li>
		<li>Coloque las células en la placa de cultivo de tejidos de 60 mm recubierta de colágeno en medios LEC completos. Este será el día 0 del cultivo celular.</li>
		<li>Reemplace el medio después de cada 2 días lavando las celdas con 1x PBS dos veces y agregando medios LEC nuevos.</li>
		<li>Repita el paso 2.1.15 hasta que las celdas tengan un 80-90% de confluente. NOTA: Si la purificación se realiza antes de que las células tengan un 80-90% de confluente, se aislarán menos células endoteliales linfáticas. Este proceso tarda entre 7 y 10 días.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Recubrimiento de perlas magnéticas con anticuerpo LYVE-1
NOTA: Un día antes de la etapa de purificación, prepare los siguientes materiales y equipos: refrigerador de 4 °C, rotor, separador magnético, PBS, perlas magnéticas Anti-Rabbit IgG, tubos de microcentrífuga, filtros de jeringa de 0,2 μm, solución de recubrimiento de perlas magnéticas, anticuerpo LYVE-1.
<ol><li>Prepare la solución de recubrimiento de perlas magnéticas: 20 mL de PBS con 0.1% de BSA y 2 mM de EDTA y filtre-esterilice. Guárdelo a 4 °C. NOTA: No se recomiendan más de unos pocos días de almacenamiento; Compruebe si hay precipitados o contaminación antes de usar.</li>
	<li>Pipetee 500 μL de perlas magnéticas IgG Anti-Conejo en un tubo de microcentrífuga y agregue 1 mL de solución de recubrimiento de perlas magnéticas helada.</li>
	<li>Utilice un separador magnético para lavar las cuentas.</li>
	<li>Repita los lavados 2 veces con 1 ml de la solución helada de recubrimiento de perlas magnéticas.</li>
	<li>Vuelva a suspender las perlas en 500 μL de solución de recubrimiento magnético de perlas y haga alícuotas de 150 μL en tubos de microcentrífuga.</li>
	<li>Añadir 15 μg del anticuerpo LYVE-1 a cada tubo (15 μL a partir de una concentración de stock de anticuerpos de 1 mg/mL).</li>
	<li>Incubar durante la noche a 4 °C con agitación continua.</li>
</ol>4. Purificación de células endoteliales linfáticas
NOTA: Prepare los siguientes materiales y equipos: incubadora de CO2 , agitador, temporizador, parapelícula, DMEM, 1x solución antibiótica-antimicótica, BSA, PBS, solución de recubrimiento de perlas magnéticas, tripsina-EDTA, placas de cultivo de tejidos de 100 mm o 60 mm, filtros de jeringa de 0,2 μm, colágeno tipo I, ácido acético, medio LEC.
<ol><li>Prepare 50 mL de DMEM con 1x Solución Antibiótica-Antimicótica y 0,1% de BSA y filtre-esterilice.</li>
	<li>Cubrir placas de cultivo de tejidos de 60 mm con 10 μg/mL de colágeno tipo I en ácido acético 0,02 M durante >20 min a 37 °C. Lavar 2 veces con PBS estéril.</li>
	<li>Lave las perlas prerrevestidas con 1 mL de solución de recubrimiento magnético de perlas, utilizando un separador magnético.</li>
	<li>Vuelva a suspender las perlas en 150 μL de DMEM con 0,1% de BSA. NOTA: Las perlas ahora se pueden almacenar a 4 °C hasta por 1 mes.</li>
	<li>Lave las celdas 2 veces con PBS.</li>
	<li>Añadir 3 mL de DMEM con BSA al 0,1% (para una placa de cultivo de tejidos de 60 mm) y 50 μL de las perlas conjugadas con anticuerpos a las células. NOTA: Si las células de dos o más ratones se agrupan, utilice una placa de cultivo de tejidos de 100 mm y añada 6 ml de DMEM con 0,1% de BSA.</li>
	<li>Sella el plato con parafilm.</li>
	<li>Coloque el plato en una coctelera agitando a 10 RPM a RT e incube durante exactamente 10 minutos. NOTA: Una incubación más prolongada dará lugar a una unión inespecífica. Para asegurarse de que las cuentas interactúen con toda la superficie de la placa, gire manualmente la placa cada pocos minutos mientras continúa temblando.</li>
	<li>Deseche el medio y lave las celdas una vez con PBS. Inspeccione rápidamente las celdas para verificar la presencia de colonias de LEC en la placa.</li>
	<li>Tripsinizar las células: utilizar 1 mL de tripsina-EDTA e incubar durante 3 min a 37 °C. Inspeccione las celdas para ver si se han desacoplado correctamente.</li>
	<li>Neutralice la solución con 2 mL de medio LEC completo y transfiera la solución a un tubo de polipropileno estéril de 5 mL.</li>
	<li>Utilizando un separador magnético, lave las celdas de 4 x 3 mL de DMEM con 0.1% de BSA para eliminar las celdas no unidas.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células restantes unidas a las perlas en medios LEC completos y en placas de cultivo de tejidos de 60 mm previamente recubiertas de colágeno.</li>
	<li>Incubar las células a 37 °C y cambiar el medio cada dos días después de dos lavados con PBS cada vez.</li>
	<li>Cultive las células hasta que alcancen la confluencia (normalmente toma de 7 a 10 días).</li>
	<li>En ese momento, revise las células bajo el microscopio para ver si hay confluencia y proceda a preparar las células para la citometría de flujo. Si se identifica un porcentaje alto de F4/80+, repita el paso de purificación con LYVE-1 (Paso 4: Purificación de células endoteliales linfáticas) nuevamente o, idealmente, con otro marcador linfático (es decir, podoplanina14). NOTA: Se ha demostrado la alta expresión de la proteína dirigida por el anticuerpo en la población de células purificadas con perlas magnéticas15,16. Sin embargo, para LYVE-1, es importante realizar un control de citometría de flujo para la identificación del porcentaje de otras células LYVE-1+, en su mayoría macrófagos. LYVE-1 solo se expresa en subconjuntos de macrófagos que están asociados con tumores y heridas, mientras que en piel sana, la expresión de LYVE-1 está más restringida a las células endoteliales linfáticas17. Por lo tanto, el cribado F4/80 no es obligatorio, sino que depende del contexto experimental. Los ratones utilizados para la demostración no portaban tumores ni heridas, solo una posible inflamación por depilación, pero incluimos la tinción F4/80 como referencia del porcentaje de macrófagos LYVE-1+.</li>
</ol>5. Citometría de flujo
NOTA: Prepare los siguientes materiales y equipos: centrífuga, incubadora de CO2 , temporizador, hemocitómetro, solución de EDTA, 1x solución antibiótica-antimicótica, BSA, PBS, tripsina-EDTA, tubos de polipropileno, filtros de jeringa de 0,2 μm, etanol al 70%, anticuerpo conjugado F4/80 FITC.
<ol><li>Prepare PBS que contenga 0.1% de BSA y filtre y esterilice.</li>
	<li>Prepare una solución de EDTA de 1 mM en PBS.</li>
	<li>Tripsinizar las células: incubar las células con 1 mL de solución de EDTA 1 mM durante 5 min a 37 °C. NOTA: La incubación con solución de EDTA es un método más suave de desprendimiento celular, que conserva mejor las proteínas transmembrana y es preferible, pero requiere períodos de incubación más largos. Alternativamente, la solución de tripsina-EDTA se puede utilizar para una incubación de 1 min a 37 °C, pero esto puede afectar la afinidad de los anticuerpos para aplicaciones de citometría de flujo.</li>
	<li>Neutralice la solución con 2 mL de medio LEC completo y transfiera la solución a un tubo de polipropileno estéril de 5 mL.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 250 × g durante 5 min.</li>
	<li>Lavar con PBS.</li>
	<li>Repita la centrifugación y el lavado con PBS.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células en PBS que contengan 0,1% de BSA y cuéntelas con un hemocitómetro o un método alternativo. Alícuota ~1 × 106 células en tubos de polipropileno con un volumen final de 100 μl. A partir de este paso, realice todos los pasos a 4 °C. NOTA: Las células se pueden fijar antes de teñir o teñir mientras están vivas. La fijación puede ser subóptima para la citometría de flujo, ya que algunos anticuerpos pueden no detectar los antígenos después de la fijación; Por lo tanto, recomendamos realizar la citometría de flujo inmediatamente después del paso anterior y omitir el paso de fijación. Si eso no es posible, la fijación antes del experimento de citometría de flujo permitirá un retraso en el paso de la citometría de flujo. Si se va a realizar la fijación, se debe evaluar previamente el rendimiento de los anticuerpos en el contexto de las células fijas.</li>
	<li>Realice la fijación (paso opcional; si las células no se van a fijar, proceda con la inmunotinción): vuelva a suspender las células en etanol al 70% helado y mezcle suavemente durante 10 minutos con hielo. NOTA: La fijación de etanol puede permeabilizar las células y conducir a la liberación de GFP; Sin embargo, la fijación a base de paraformaldehído puede destruir los colorantes utilizados para la citometría de flujo e, idealmente, se puede evitar.</li>
	<li>Incubar durante 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar las celdas 2x por centrifugación a 250 × g durante 5 min en 1x PBS.</li>
	<li>Continúe con el siguiente paso o vuelva a suspender las células en 0,5-1 mL de 1x PBS y almacene a 4 °C.</li>
</ol>6. Inmunotinción
NOTA: Manipule las células con cuidado y evite el pipeteo extenso, cuando sea posible, para mantener la integridad de la membrana celular y minimizar la muerte celular, asegurándose de que las células no formen grumos. A partir de las células endoteliales aisladas, prepare los siguientes grupos: células no teñidas y células teñidas con otro marcador de células endoteliales (es decir, VEGFR3, podoplanina), F4/80 y ambos. Incluya las células endoteliales linfáticas de ratón disponibles comercialmente y los macrófagos, si están disponibles, como controles positivos. Para fines de demostración, y debido a la fluorescencia endógena de tdTomato (PE+), hemos utilizado la tinción F4/80 conjugada con FITC.
<ol><li>Diluir el anticuerpo primario en PBS con BSA al 0,1% de acuerdo con la dilución recomendada u optimizada. Añadir 0,5 μg (1 μL de solución de anticuerpos) del anticuerpo conjugado F4/80 con FITC a los 100 μL de la suspensión celular.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células después de la adición del anticuerpo fluorescente conjugado diluido. Mezcle moviendo el tubo de polipropileno para asegurarse de que no haya grumos y que todas las celdas estén correctamente recubiertas.</li>
	<li>Incubar durante 1 h a temperatura ambiente (celdas fijas) o 30 min en hielo (celdas vivas) en la oscuridad.</li>
	<li>Lave las células 2 veces centrigándolas a 250 × g durante 5 min a 4 °C (para células vivas) o a temperatura ambiente (para células fijas), utilizando PBS con 0,1% de BSA en la oscuridad.</li>
	<li>Para anticuerpos no fluorescentes conjugados<ol><li>Diluya el anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo en el tampón de incubación. Para los anticuerpos de Alexa Flour, use una dilución 1:500.</li>
		<li>Añadir el anticuerpo secundario a 100 μL de la solución de suspensión celular.</li>
		<li>Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (células fijas) o en hielo (células vivas).</li>
		<li>Lavar dos veces por centrifugación a 250 × g durante 5 min a 4 °C (para células vivas) o a temperatura ambiente (para células fijas) en el tampón de incubación.</li>
	</ol></li>
	<li>Resuspenda las células en 0,5 mL de 1x PBS y analícelas con un citómetro de flujo.</li>
	<li>Siga estos pasos de la estrategia de activación para identificar la población de macrófagos dentro de las células que expresan LYVE-1:<ol><li>Considere la dispersión hacia adelante y hacia los lados para distinguir la población celular.</li>
		<li>Considere la dispersión hacia adelante para el tamaño, el área y la altura de la celda para distinguir las celdas individuales (singletes).</li>
		<li>Tenga en cuenta la expresión de F4/80 (FITC) y la expresión de RFP (PE) para identificar macrófagos (F4/80+) dentro de las células murinas aisladas que expresan tdTomato (PE) (debido a la presencia de un reportero fluorescente de tdTomato en los ratones específicos, que se describe a continuación).</li>
	</ol></li>
</ol>

Aislamiento de células endoteliales de capilares linfáticos dérmicos murinos

<ol>
	<li>Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphatic+vasculature+in+the+21(st)+century:+novel+functional+roles+in+homeostasis+and+disease.">The lymphatic vasculature in the 21(st) century: novel functional roles in homeostasis and disease.</a> Cell. 182 (2), 270-296 (2020).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoangiocrine+signals+promote+cardiac+growth+and+repair.">Lymphoangiocrine signals promote cardiac growth and repair.</a> Nature. 588 (7839), 705-711 (2020).</li><li>Biswas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessels+in+bone+support+regeneration+after+injury.">Lymphatic vessels in bone support regeneration after injury.</a> Cell. 186 (2), 382-397 (2023).</li><li>Tammela, T., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis:+molecular+mechanisms+and+future+promise.">Lymphangiogenesis: molecular mechanisms and future promise.</a> Cell. 140 (4), 460-476 (2010).</li><li>Ji, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+and+ROCK+mediate+histamine-induced+vascular+leakage+and+anaphylactic+shock.">RhoA and ROCK mediate histamine-induced vascular leakage and anaphylactic shock.</a> Nature Communications. 6, 6725 (2015).</li><li>Schledzewski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+endothelium-specific+hyaluronan+receptor+LYVE-1+is+expressed+by+stabilin-1+,+F4/80+,+CD11b++macrophages+in+malignant+tumours+and+wound+healing+tissue+in+vivo+and+in+bone+marrow+cultures+in+vitro:+implications+for+the+assessment+of+lymphangiogenesis.">Lymphatic endothelium-specific hyaluronan receptor LYVE-1 is expressed by stabilin-1+, F4/80+, CD11b+ macrophages in malignant tumours and wound healing tissue in vivo and in bone marrow cultures in vitro: implications for the assessment of lymphangiogenesis.</a> Journal of Pathology. 209 (1), 67-77 (2006).</li><li>Akwii, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-2-induced+lymphatic+endothelial+cell+migration+drives+lymphangiogenesis+via+the+beta1+integrin-RhoA-formin+axis.">Angiopoietin-2-induced lymphatic endothelial cell migration drives lymphangiogenesis via the beta1 integrin-RhoA-formin axis.</a> Angiogenesis. 25 (3), 373-396 (2022).</li><li>Petrova, T. V., Koh, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+functions+of+lymphatic+vessels.">Biological functions of lymphatic vessels.</a> Science. 369 (6500), eaax4063 (2020).</li><li>Fidler, I. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposiform+lymphangiomatosis:+a+distinct+aggressive+lymphatic+anomaly.">Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly.</a> Journal of Pediatris. 164 (2), 383-388 (2014).</li><li>Ji, Y., Chen, S., Peng, S., Xia, C., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposiform+lymphangiomatosis+and+kaposiform+hemangioendothelioma:+similarities+and+differences.">Kaposiform lymphangiomatosis and kaposiform hemangioendothelioma: similarities and differences.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 165 (2019).</li><li>Kriehuber, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+dermal+lymphatic+and+blood+endothelial+cells+reveal+stable+and+functionally+specialized+cell+lineages.">Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages.</a> Journal of Experimental Medicine. 194 (6), 797-808 (2001).</li><li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells.">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li><li>Garrafa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification,+and+heterogeneity+of+human+lymphatic+endothelial+cells+from+different+tissues.">Isolation, purification, and heterogeneity of human lymphatic endothelial cells from different tissues.</a> Lymphology. 38 (4), 159-166 (2005).</li><li>Kazenwadel, J., Secker, G. A., Betterman, K. L., Harvey, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+using+primary+embryonic+mouse+lymphatic+endothelial+cells+uncover+key+roles+for+FGFR1+signalling+in+lymphangiogenesis.">In vitro assays using primary embryonic mouse lymphatic endothelial cells uncover key roles for FGFR1 signalling in lymphangiogenesis.</a> PLoS One. 7 (7), e40497 (2012).</li><li>Steele, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+egress+via+lymphatic+vessels+is+tuned+by+antigen+encounter+and+limits+tumor+control.">T cell egress via lymphatic vessels is tuned by antigen encounter and limits tumor control.</a> Nature Immunology. 24 (4), 664-675 (2023).</li><li>Mammoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+age-dependent+changes+in+cell+size+on+endothelial+cell+proliferation+and+senescence+through+YAP1.">Effects of age-dependent changes in cell size on endothelial cell proliferation and senescence through YAP1.</a> Aging. 11 (17), 7051-7069 (2019).</li><li>Regina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+ageing+and+endothelial+cell+senescence:+Molecular+mechanisms+of+physiology+and+diseases.">Vascular ageing and endothelial cell senescence: Molecular mechanisms of physiology and diseases.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 159, 14-21 (2016).</li><li>Muhleder, S., Fernandez-Chacon, M., Garcia-Gonzalez, I., Benedito, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+sprouting,+proliferation,+or+senescence:+tipping+the+balance+from+physiology+to+pathology.">Endothelial sprouting, proliferation, or senescence: tipping the balance from physiology to pathology.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (4), 1329-1354 (2021).</li></ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.

El sistema linfático es un importante regulador de la función homeostática del organismo, siendo las funciones más importantes el mantenimiento del plasma líquido, la eliminación de subproductos del metabolismo celular y moléculas tóxicas, la absorción de lípidos y el tráfico de células inmunitarias 1,19. La identificación de marcadores apropiados ha provocado una explosión de nuevos datos en el campo linfático, revelando nuevas funciones de la vas...

El sistema linfático desempeña un papel fundamental en la fisiología humana. Se considera un factor homeostático vital, que facilita funciones importantes, como el mantenimiento del equilibrio de líquidos tejido-plasmático, la vigilancia inmunitaria y la absorción de lípidos1, así como funciones recientemente identificadas, como la capacidad de reparación del corazón2 y la capacidad regenerativa del hueso y la hematopoyesis3. A pesar del importante papel del sistema linfático, varios aspectos del papel de los linfáticos, así como los mecanismos moleculares que gobiernan ciertos parámetros fisiológicos y respuestas, siguen siendo difíciles de alcanzar. Además, los defectos vasculares linfáticos son factores desencadenantes o deteriorantes de determinadas condiciones fisiopatológicas. Ejemplos bien conocidos son los linfedemas primarios y secundarios, dependiendo del origen genético o no genético de la enfermedad, respectivamente, mientras que el papel del sistema linfático en el crecimiento del tumor primario y la diseminación metastásica es fundamental, ya que puede actuar como conducto para la metástasis y modulador de las funciones inmunes1.
El retraso en el estudio y conocimiento de la vasculatura linfática en comparación con la vasculatura sanguínea se debe principalmente al descubrimiento más tardío del sistema linfático en comparación con el sistema vascular sanguíneo y al retraso en la identificación de marcadores moleculares linfáticos específicos. Esto ha mejorado mucho en las últimas décadas, lo que lleva a la alteración del cuadro convencional de los linfáticos en estado estacionario y en condiciones de enfermedad1. Al igual que la angiogénesis, la linfangiogénesis es la formación de nuevos vasos linfáticos a partir de los preexistentes y desempeña un papel fundamental en el desarrollo de un amplio espectro de enfermedades 4,5,6. Sin embargo, a diferencia de la angiogénesis, la investigación de la linfangiogénesis se ha limitado principalmente a modelos in vivo centrados en la formación de vasos en desarrollo y defectos estructurales en modelos patológicos. El aislamiento de las células endoteliales linfáticas es importante para los estudios in vitro, y esto puede ser proporcionado por el protocolo presentado.
Se han desarrollado varios protocolos para el aislamiento endotelial linfático de ratones, que requieren el uso de la clasificación celular activada por fluorescencia7. La ventaja del clasificador de células, cuando está disponible, es el mayor grado de pureza, a diferencia del aislamiento basado en perlas, ya que este último proporciona un mayor rendimiento. El protocolo utiliza la expresión del receptor endotelial linfático de hialuronano 1 (LYVE-1), un marcador endotelial linfático, importante para el tráfico celular dentro de los vasos linfáticos 4,8. Dado que la expresión de LYVE-1 se limita a los capilares linfáticos y no a los vasos linfáticos colectores, la técnica es adecuada para el aislamiento de las células endoteliales linfáticas específicamente de los capilares linfáticos, a diferencia de otros marcadores linfáticos, como la podoplanina, que se expresan uniformemente en todas las células endoteliales linfáticas9. Para el protocolo, se excluyeron otros marcadores linfáticos importantes que no eran transmembrana, como Prox1.
Dado que el resultado fisiológico fue la linfangiogénesis, que generalmente se inicia en los capilares linfáticos, se seleccionó LYVE-1 como objetivo debido a su selectividad en estas células y porque el anticuerpo seleccionado proporcionó un alto rendimiento. Las enzimas utilizadas fueron la colagenasa tipo II, que generalmente se sabe que es más eficaz en la disociación del colágeno que el tipo I10, y la dispasa, una proteasa más amplia, utilizada regularmente para la separación dermis-epidermis11; Sin embargo, se han descrito otras enzimas para la separación de tejidos12,13 y pueden ser utilizadas. El objetivo de este protocolo es describir un método para el aislamiento de células endoteliales linfáticas dérmicas de capilares linfáticos de ratones adultos con alto rendimiento utilizando purificación magnética de perlas, especialmente en lugares donde la clasificación celular activada por fluorescencia no está fácilmente disponible. El método es adecuado para aplicaciones en las que la pureza de las células endoteliales linfáticas puede verse comprometida para aplicaciones posteriores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m Syringe Filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-719C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Hair Clipper</td>
			<td>Wahl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11992-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>542040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>542070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, High Concentration Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td>dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Solution (2,500 U/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynal MPC-L Magnetic Particle Concentrator</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>120-21D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Base Medium &#38; Supplement (LEC medium)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>CCM027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia chamber</td>
			<td>Euthanex Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1432S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LARC-A E-Z Anesthesia Induction Chamber</td>
			<td>Euthanex Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Solution 4% in PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30256FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Mouse LYVE-1</td>
			<td>ReliaTech GmbH</td>
			<td>103-PA50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating/Shaking Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polypropylene Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters w 0.2 &#956;m Pores</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-719C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine dermal lymphatic endothelial cell isolation

El sistema linfático participa en la regulación de la vigilancia inmunitaria, la absorción de lípidos y el equilibrio de líquidos tisulares. El aislamiento de células endoteliales linfáticas murinas es un proceso importante para la investigación linfática, ya que permite la realización de experimentos in vitro y bioquímicos en las células aisladas. Además, el desarrollo de la tecnología Cre-lox ha permitido la deficiencia de genes específicos de tejido que no se pueden abordar globalmente, lo que ha llevado a la determinación precisa de su papel en los tejidos estudiados. La disección del papel de ciertos genes en la fisiología linfática y la fisiopatología requiere el uso de promotores linfáticos específicos y, por lo tanto, la verificación experimental de los niveles de expresión de los genes objetivo.
Los métodos para el aislamiento eficiente de células endoteliales linfáticas de ratones salvajes o transgénicos permiten el uso de ensayos ex vivo e in vitro para estudiar los mecanismos que regulan las funciones linfáticas y la identificación de los niveles de expresión de las proteínas estudiadas. Hemos desarrollado, estandarizado y presentado un protocolo para el aislamiento eficiente de células endoteliales linfáticas dérmicas murinas (DLECs) mediante purificación magnética de perlas basadas en la expresión de LYVE-1. El protocolo descrito tiene como objetivo equipar a los investigadores con una herramienta para comprender mejor y dilucidar los actores importantes de las funciones de las células endoteliales linfáticas, especialmente en instalaciones donde no se dispone de equipos de clasificación de células activadas por fluorescencia.

The lymphatic system plays a pivotal role in human physiology. It is considered a vital homeostatic factor, that facilitates important functions, such as the maintenance of tissue-plasma fluid balance, immune surveillance, and lipid absorption1, as well as recently-identified functions, such as the repair ability of the heart2 and regenerative capacity of bone and hematopoiesis3. Despite the significant role of the lymphatic system, several aspects of the role of the lymphatics, as well as the molecular mechanisms governing certain physiological parameters and responses remain elusive. Moreover, lymphatic vascular defects are triggering or deteriorating factors in certain pathophysiological conditions. Well-known examples are the primary and secondary lymphedemas, depending on the genetic or non-genetic origin of the disease, respectively, while the role of the lymphatic system on primary tumor growth and metastatic dissemination is pivotal, as it can act as a conduit for metastasis and modulator of immune functions1.
The lag in the study and knowledge of the lymphatic compared to the blood vasculature is mainly due to the later discovery of the lymphatic system in comparison with the blood vascular system and the delay in the identification of lymphatic-specific molecular markers. This has greatly improved in recent decades, leading to the alteration of the conventional picture of the lymphatics at steady state and in diseased conditions1. Similar to angiogenesis, lymphangiogenesis is the formation of new lymphatic vessels from pre-existing ones and plays a pivotal role in the development of a wide spectrum of diseases4,5,6. However, unlike angiogenesis, the investigation of lymphangiogenesis has been limited to mostly in vivo models focusing on developmental vessel formation and structural defects in pathological models. The isolation of the lymphatic endothelial cells is important for in vitro studies, and this can be provided by the presented protocol.
Several protocols for lymphatic endothelial isolation from mice have been developed, which require the use of fluorescence-activated cell sorting7. The advantage of the cell sorter, where available, is the higher degree of purity, contrary to bead-based isolation, with the latter providing a higher yield. The protocol utilizes the expression of lymphatic endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE-1), a lymphatic endothelial marker, important for cell trafficking within the lymphatic vessels4,8. Since LYVE-1 expression is limited to the lymphatic capillaries and not the collecting lymphatic vessels, the technique is suitable for the isolation of lymphatic endothelial cells specifically from the lymphatic capillaries, contrary to other lymphatic markers, such as podoplanin, which are expressed uniformly in all lymphatic endothelial cells9. For the protocol, other important lymphatic markers that were not transmembrane, such as Prox1, were excluded.
As the physiological outcome was lymphangiogenesis, which is usually initiated at the lymphatic capillaries, LYVE-1 was selected as a target due to its selectivity in these cells and because the selected antibody provided a high yield. The enzymes used were collagenase type II, which is generally known to be more effective in collagen dissociation than type I10, and dispase, a broader protease, regularly used for dermis-epidermis separation11; however, other enzymes for tissue separation have been reported12,13 and can be used. The goal of this protocol is to describe a method for dermal lymphatic endothelial cell isolation from lymphatic capillaries of adult mice with high yield using magnetic bead purification, especially in places where fluorescence-activated cell sorting is not readily available. The method is suitable for applications where the purity of lymphatic endothelial cells can be compromised for downstream applications.

Autor destacado: Aislamiento basado en perlas magnéticas de células endoteliales linfáticas dérmicas murinas

Aislamiento de células endoteliales linfáticas dérmicas murinas

El método se desarrolló para identificar la expresión proteica de una pequeña GTPasa, RhoA, cuyo gen codificante se floxó en ambos alelos y se eliminó bajo el efecto del promotor endotelial específico linfático inducible por tamoxifeno Prox1-CreERT2 18. Las LEC aisladas pueden cultivarse hasta durante cuatro generaciones, después de las cuales se vuelven senescentes. Han sido congelados, descongelados y estimulados con éxito con angiopoyetina-2. Debido al número limi...

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Este artículo describe un método para el aislamiento basado en perlas magnéticas de células endoteliales murinas de capilares linfáticos dérmicos. Las células endoteliales linfáticas aisladas se pueden utilizar para experimentos in vitro posteriores y análisis de expresión de proteínas.

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...

La investigación de nuestro grupo se centra en delinear los mecanismos que regulan la fisiología de las células endoteliales. Este protocolo describe un método para el aislamiento basado en perlas magnéticas de células endoteliales renales, específicamente de capilares linfáticos térmicos en instalaciones donde la clasificación de células activadas por fluorescencia no está disponible. El protocolo permite aislar células endoteliales linfáticas de ratones transgénicos para estudiar su fisiología in vitro.Es particularmente adecuado cuando la pureza de las células endoteliales linfáticas puede verse comprometida para aplicaciones posteriores. Este proceso proporciona un alto rendimiento de células endoteliales linfáticas obtenidas de los capilares linfáticos y no de otros vasos colectores. También es una buena alternativa en el caso de la ausencia de instalaciones de clasificación por celdas.

murine-dermal-lymphatic-endothelial-cell-isolation

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

1.0K vistas.  Texas Tech University Health Sciences Center. La investigación de nuestro grupo se centra en delinear los mecanismos que regulan la fisiología de las células endoteliales. Este protocolo describe un método para el aislamiento basado en perlas magnéticas de células endoteliales renales, específicamente de capilares linfáticos térmicos en instalaciones donde la clasificación de células activadas por fluorescencia no está disponible. El protocolo permite aislar células endoteliales linfáticas de ratones transgénicos para estu...

Video: Autor destacado: Aislamiento basado en perlas magnéticas de células endoteliales linfáticas dérmicas murinas

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic endothelial cells is an important process for lymphatic research, as it allows the performance of in vitro and biochemical experiments on the isolated cells. Moreover, the development of Cre-lox technology has enabled the tissue-specific deficiency of genes that cannot be globally targeted, leading to the precise determination of their role in the studied tissues. The dissection of the role of certain genes in lymphatic physiology and pathophysiology requires the use of lymphatic-specific promoters, and thus, the experimental verification of the expression levels of the targeted genes.
Methods for efficient isolation of lymphatic endothelial cells from wild-type or transgenic mice enable the use of ex vivo and in vitro assays to study the mechanisms regulating the lymphatic functions and the identification of the expression levels of the studied proteins. We have developed, standardized and present a protocol for the efficient isolation of murine dermal lymphatic endothelial cells (DLECs) via magnetic bead purification based on LYVE-1 expression. The protocol outlined aims to equip researchers with a tool to further understand and elucidate important players of lymphatic endothelial cell functions, especially in facilities where fluorescence-activated cell sorting equipment is not available.

This paper describes a method for magnetic bead-based isolation of murine endothelial cells from dermal lymphatic capillaries. The isolated lymphatic endothelial cells can be used for downstream in vitro experiments and protein expression analysis.