التمويل: تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (أرقام 82004154 و 81900311 و 82100336 و 81970345).

تم إجراء الدراسة بموجب ترخيص مشروع (رقم 20211404A) ممنوح من قبل لجنة أخلاقيات في مستشفى غرب الصين ، جامعة سيتشوان ، وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات في مستشفى غرب الصين ، جامعة سيتشوان لرعاية واستخدام. وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية ، تم الحفاظ على الفئران المستخدمة في هذه الدراسة في بيئة خاضعة للرقابة مع دورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة ، ودرجة حرارة عند 22-24 درجة مئوية ورطوبة 50٪ -60٪. تم منح الفئران إمكانية الوصول إلى الطعام والماء حسب الطلب. كانت المستخدمة في هذه الدراسة من ذكور الفئران Sprague Dawley (SD) البالغة من العمر 6-8 أسابيع ، ويزن حوالي 250 جراما وخالية من مسببات الأمراض. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).
1. عزل العدلات الفئران
<ol><li>حصاد نخاع العظم<ol><li>ضع الجرذ في وعاء مناسب للتخدير (انظر جدول المواد). تطبيق 3٪ إيزوفلوران للفأر حتى يفقد الوعي. تحقق من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القدم أو قرصة الذيل لضمان عمق التخدير.</li>
		<li>بمجرد تخدير الجرذ بعمق ، قم بإجراء خلع عنق الرحم عن طريق وضع الجرذ على ظهره وإمساك ذيله بيد واحدة أثناء إمساك الرأس باليد الأخرى. خلع الرقبة بسرعة وحزم عن طريق تطبيق قوة تصاعدية مفاجئة وقوية على الذيل أثناء سحب الرأس لأسفل حتى يتم قطع العمود الفقري العنقي. انتظر تأكيد الوفاة ، مثل توقف التنفس ونقص ضربات القلب ، قبل الشروع في جمع الأنسجة أو التخلص منها.</li>
		<li>اغمس الفئران في 75٪ من الإيثانول واتركها لبضع دقائق لتعقيم الفراء والجلد. ضع الجرذ على ظهره واقطع الأطراف السفلية عند الورك لحماية رأس عظم الفخذ. استخدم مقص التشريح لقطع الرباط عند مفصل العرقوب وطي مفصل الركبة للخلف لكشف عظم الفخذ والساق.</li>
		<li>باستخدام الملقط والمقص ، قم بإزالة أي عضلات وأوتار وأنسجة أخرى متصلة بالعظام بعناية. اشطف العظام بمحلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) لإزالة أي بقايا أنسجة ودم متبقية. كرر مرتين أخريين ، ليصبح المجموع ثلاث غسلات. ضع العظام النظيفة في وعاء معقم.</li>
		<li>استخدم حقنة سعة 5 أو 10 مل بإبرة لوخز النخاع من خلال طرفي العظم لتخفيف مصفوفة النخاع. اشطف نخاع العظم بوسائط 10-15 مل من معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) بحقنة أخرى ، حتى لا يمكن التخلص من نخاع العظم المرئي.</li>
		<li>الطرد المركزي خلايا نخاع العظم عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية. أضف 5-10 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (انظر جدول المواد) لإعادة تعليق الخلايا واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق. أضف 4 أضعاف حجم HBSS إلى الخليط. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 600 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتجاهل الطافي مع ماصة ، واستخدام الحبيبات الناتجة لمزيد من الاستخدام.</li>
	</ol></li>
	<li>عزل العدلات من نخاع العظم<ol><li>بالنسبة للطريقة المكونة من خطوتين ، قم بتنفيذ الخطوات الإضافية التالية:<ol><li>عزل خلايا نخاع العظم باستخدام مجموعة عزل العدلات التجارية للفئران باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).</li>
			<li>قم بإعداد تدرج الكثافة عن طريق وضع طبقات 2 مل من كاشف percoll بنسبة 55٪ (انظر جدول المواد) ، و 2 مل من 65٪ من الكاشف ، و 2 مل من كاشف 70٪ ، و 2 مل من كاشف 80٪ في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 800 × جم لمدة 40 دقيقة عند 20 درجة مئوية ، مع ضبط التسارع على 5 وضبط التباطؤ على 0 أو 1.</li>
			<li>اجمع طبقة التدرج بنسبة 70٪ ، بما في ذلك طبقات الخلايا عند الحد بين كاشف التدرج 65٪ و 70٪ ، باستخدام ماصة معقمة. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل. أضف 15 مل HBSS في الأنبوب واقلب الأنبوب برفق عدة مرات لغسل الخلايا. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوير الخلايا.</li>
		</ol></li>
		<li>بالنسبة للأسلوب المكون من خطوة واحدة، قم بتنفيذ الخطوات الإضافية التالية:<ol><li>إخضاع خلايا نخاع العظم للتدرجات دون استخدام مجموعة عزل العدلات في الفئران.</li>
			<li>اجمع طبقة التدرج بنسبة 70٪ ، بما في ذلك طبقات الخلايا عند الحد بين 65٪ و 70٪ من التدرج ، باستخدام ماصة معقمة. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل واغسل الخلايا باستخدام HBSS. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوير الخلايا.</li>
			<li>عد العدلات المعزولة باستخدام مقياس الدم وتقييم الجدوى باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق. ملاحظة: يمكن تعديل البروتوكول اعتمادا على عدد الفئران والعدد المطلوب من العدلات المعزولة. يتم الحصول على كمية مقبولة من العظام من ثلاثة فئران عند استخدام هذه الطريقة لأول مرة في بيئة تجريبية جديدة. يجب تنفيذ جميع الإجراءات في ظل ظروف معقمة. يجب إجراء عزل العدلات من نخاع العظم في أسرع وقت ممكن لتقليل تلف الخلايا وفقدان قابليتها للحياة.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. اقتناء شبكات الفئران
<ol><li>إعادة تعليق 0.5 × 108-1 × 108 العدلات المعزولة في 4 مل من وسائط RPMI (مكملة بمصل بقري جنيني 10٪ (FBS) و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين) في طبق بتري معقم 10 سم.</li>
	<li>أضف 500 نانومتر PMA (انظر جدول المواد) إلى معلق العدلات للحث على NETosis. احتضان لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.</li>
	<li>للتحكم السلبي ، أضف DNase I (10 U / mL) إلى تعليق العدلات لتحلل الشبكات المفرزة.</li>
	<li>لحصاد الشبكات ، قم بإزالة الوسائط وغسل الشبكات المرفقة برفق بطبق بتري باستخدام HBSS. بعد ذلك ، استخدم التنظيف المكثف مع 4 مل من الوسائط الطازجة لكل لوحة لفصل الشبكات عن اللوحة.</li>
	<li>اجمع وسط الغسيل والماصة بشكل متكرر لإعادة التعليق الكامل للشبكات.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي التعليق عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية لإزالة أي خلايا عائمة.</li>
	<li>انقل المعلق الذي يحتوي على الشبكات إلى أنبوب معقم واحفظه في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمزيد من الاستخدام في غضون أسبوعين. ملاحظة: الشبكات حساسة للتحلل ، لذلك يوصى باستخدام المواد التي تم حصادها حديثا للحصول على أفضل النتائج.</li>
</ol>3. التحقق من وجود الشبكات
<ol><li>ثبت الخلايا (من الخطوة 2.4) على أغطية تحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة وشبكات (من الخطوة 2.7) لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة.</li>
	<li>اقلب الغطاء على قطرة PBS / PBST على حامل أنبوب اختبار مغطى بغشاء البارافين وكرر عملية الغسيل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها.</li>
	<li>تتخلل الخلايا بنسبة 0.5٪ Triton-X-100 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتغسل ثلاث مرات في PBS / PBST لمدة 1 دقيقة لكل منهما. ختم الخلايا مع مصل حمار طبيعي 10٪ (انظر جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.</li>
	<li>احتضان الخلايا بالجسم المضاد لإستاز العدلات المضاد للفئران والجسم المضاد للميلوبيروكسيديز المضاد للفئران (انظر جدول المواد) طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، اغسل غطاء الغطاء في PBS / PBST ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.</li>
	<li>احتضان الخلايا بالجسم المضاد الثانوي A488 المترافق للحمار المضاد للأرانب IgG (H + L) ، و A594 المترافق للحمار المضاد للفأر IgG (H + L) ، والماعز المترافق A594 المضاد للفأر IgG1 (انظر جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في الظلام. بعد ذلك ، اغسل غطاء الغطاء في PBS / PBST ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.</li>
	<li>نوى الخلايا الملطخة والهياكل العظمية الصافية مع 10 ملغ / مل DAPI. بعد ذلك ، اغسل غطاء الغطاء في PBS / PBST ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.</li>
	<li>ضع قطرة من وسيط التثبيت على شريحة زجاجية واقلب غطاء الغطاء مع وجود خلايا عليه. اتركه يجف لمدة 1 ساعة للتحليل المجهري باستخدام عدسات الغمر ؛ خلاف ذلك ، فهو جاهز للتفتيش. ملاحظة: يجب توخي الحذر الشديد عند معالجة الشبكات ، حتى بعد التثبيت ، لأنها هشة للغاية ويمكن أن تضيع بسهولة أثناء التحضير.</li>
</ol>4. التحديد الكمي للشبكات
<ol><li>قم بإعداد محلول Tris-EDTA (TE) العازلة وحل عمل PicoGreen (كاشف مقايسة dsDNA) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).</li>
	<li>إعداد المعايير عن طريق تخفيف الحمض النووي للمخزون إلى تركيزات 1 نانوغرام / مل ، 10 نانوغرام / مل ، 100 نانوغرام / مل ، و 1 ميكروغرام / مل. ملاحظة: لتحديد تركيز الشبكات ، تم استخدام مجموعة فحص dsDNA (انظر جدول المواد) ، مع الالتزام بإرشادات الشركة المصنعة. تم تحضير المخزن المؤقت Tris-EDTA (TE) وكواشف مقايسة dsDNA باستخدام حجم 19 ضعفا من الماء المقطر المزدوج أو حجم 199 ضعفا من المخزن المؤقت TE ، على التوالي. بعد ذلك ، تم تحضير المحاليل القياسية (1 نانوغرام / مل ، 10 نانوغرام / مل ، 100 نانوغرام / مل ، و 1 ميكروغرام / مل) ، وتم دمج كل 50 ميكرولتر من العينة مع 450 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE.</li>
	<li>أضف 50 ميكرولتر من كل عينة إلى 450 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE.</li>
	<li>أضف 100 ميكرولتر من المعايير أو العينات جنبا إلى جنب مع حجم متساو من محلول عمل كاشف الفحص لكل بئر في لوحة 96 بئرا ، بما في ذلك المعايير والعينات.</li>
	<li>احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-5 دقائق ، وتجنب الضوء المباشر.</li>
	<li>اقرأ العينات باستخدام قارئ صفيحة مجهرية مضان مع طيف انبعاث يبلغ حوالي 530 نانومتر وطيف امتصاص يبلغ حوالي 480 نانومتر.</li>
	<li>احسب تركيز الشبكات في كل عينة باستخدام المنحنى القياسي الناتج عن المعايير.</li>
</ol>5. تحليل إفراز الشبكات عن طريق قياس الخلايا الخلوية
<ol><li>أضف صبغة النواة (انظر جدول المواد) إلى الخلايا المحتضنة في الصفيحة المكونة من 96 بئرا للوصول إلى تركيز نهائي قدره 10 نانوغرام / مل واحتضانها لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>أضف صبغة الحمض النووي الخالية من الخلايا (cfDNA ، انظر جدول المواد) إلى الخلايا للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 300 نانومتر واحتضانها لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>امزج أصباغ الفلورسنت عن طريق سحب لطيف. لا تتخلص من المادة الطافية أو تغسل الحبيبات.</li>
	<li>قم بتحميل لوحة العينة في أداة مقياس الخلايا.</li>
	<li>اضبط معلمات التركيز ووقت التعرض للقنوات المختلفة: أزرق (على سبيل المثال: 377/50 نانومتر ، em: 470/22 نانومتر) ، عادة مع تعرض 30000 مللي ثانية ، أخضر (على سبيل المثال: 483/32 نانومتر ، eM: 536/40 نانومتر) عادة مع تعرض 5000 مللي ثانية.</li>
	<li>التقط صورا موحدة للغاية للوحة بأكملها في قنوات مختلفة.</li>
	<li>تحليل عدد بقع النواة لمجموعات مختلفة. إذا كانت متشابهة ، يمكن تحديد إفراز NETs من خلال عدد بقع cfDNA.</li>
</ol>

كفاءة الفئران نخاع العظام العدلات خارج الخلية فخ العزل

<ol>
	<li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+killing+of+human+neutrophils+by+the+potent+activator+phorbol+12-myristate+13-acetate+(PMA)+accompanied+by+changes+different+from+typical+apoptosis+or+necrosis.">Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+induce+intestinal+damage+and+thrombotic+tendency+in+inflammatory+bowel+disease.">Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).</li><li>Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+arterial+and+venous+thrombosis.">Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).</li><li>Dinallo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+traps+sustain+inflammatory+signals+in+ulcerative+colitis.">Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).</li><li>Dicker, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+are+associated+with+disease+severity+and+microbiota+diversity+in+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).</li><li>Franck, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+PAD4+and+netosis+in+experimental+atherosclerosis+and+arterial+injury:+Implications+for+superficial+erosion.">Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion.</a> Atherosclerosis. 275, e11 (2018).</li><li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).</li><li>Marin-Esteban, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afa/Dr+diffusely+adhering+Escherichia+coli+strain+C1845+induces+neutrophil+extracellular+traps+that+kill+bacteria+and+damage+human+enterocyte-like+cells.">Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells.</a> Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).</li><li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+released+by+neutrophils+impair+revascularization+and+vascular+remodeling+after+stroke.">Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke.</a> Nature Communications. 11 (1), 2488 (2020).</li><li>Sch&#252;ttler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atrial+fibrillation.">Animal models of atrial fibrillation.</a> Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).</li><li>Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+human+neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+isolation+and+handling.">Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling.</a> Journal of Visualized Experiments. 98, e52687 (2015).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+is+the+preferred+source+for+isolation+of+rat+neutrophils+and+the+subsequent+acquisition+of+neutrophil+extracellular+traps.">Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps.</a> Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).</li><li>Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nycodenz+gradient+method+for+the+purification+of+neutrophils+from+the+peripheral+blood+of+rats.">A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats.</a> Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).</li><li>Zindl, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-22-producing+neutrophils+contribute+to+antimicrobial+defense+and+restitution+of+colonic+epithelial+integrity+during+colitis.">IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).</li><li>Wong, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+reveals+the+defining+features+of+the+classical,+intermediate,+and+nonclassical+human+monocyte+subsets.">Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets.</a> Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).</li><li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood.">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).</li><li>Lindena, J., Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+chemiluminescence+properties+of+human,+canine+and+rat+polymorphonuclear+cells.">Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells.</a> Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).</li><li>Lauwers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Transwell+assay+for+the+analysis+of+neutrophil+chemotaxis+using+flow+cytometry+to+refine+the+clinical+investigation+of+immunodeficient+patients.">Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients.</a> Clinical Immunology. 238, 108994 (2022).</li><li>Evrard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+analysis+of+bone+marrow+neutrophils+reveals+populations+specialized+in+expansion,+trafficking,+and+effector+functions.">Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions.</a> Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

يشكل عزل العدلات خطوة محورية في دراسة NETosis ، حيث يكون اختيار طريقة العزل المناسبة أمرا بالغ الأهمية للحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها. أحد العوامل المهمة التي يجب وزنها هو حدوث تلوث الخلايا اللمفاوية أثناء العزل. تعتبر معالجة هذا التحدي مهمة بشكل خاص عند عزل عدلات الفئران عن نخاع العظا?...

تشكل العدلات مجموعة فرعية حرجة من كريات الدم البيضاء التي تلعب دورا محوريا في الاستجابة المناعية الفطرية. وهي تتميز بنوى وحبيبات متعددة الفصوص تحتوي على مختلف البروتياز والببتيدات المضادة للميكروبات1. تعمل العدلات بشكل أساسي من خلال التحلل ، البلعمة ، وتشكيل NETs. تم إجراء ملاحظة الشبكات لأول مرة بواسطة Takei et al. في عام 1996 خلال تجربة حيث تم تحفيز العدلات باستخدام أسيتات فوربول ميريستات (PMA) 2. في وقت لاحق ، تمت صياغة عملية تكوين NET "NETosis" بواسطة Brinkmann et al.3 في عام 2004. سلط بحثهم الضوء على الدور الحاسم لشبكات NETs في استجابات مضادات الميكروبات بوساطة العدلات. الشبكات عبارة عن هياكل تشبه الويب تتكون من الكروماتين والهستونات والبروتينات المضادة للميكروبات التي يتم إطلاقها من العدلات المنشطة استجابة للمحفزات المعدية والالتهابية. يمكن للشبكات شل حركة وقتل مسببات الأمراض الغازية عن طريق محاصرتها وتعريضها لتركيز عال من الببتيدات المضادة للميكروبات والبروتياز 1,3. بالإضافة إلى ذلك ، تساهم الشبكات في إزالة الخلايا المبرمج والمشاركة في حل الالتهاب. تشير الدراسات الحديثة أيضا إلى أن التكوين المفرط للشبكات أو ضعف تدهور الشبكة يمكن أن يؤدي إلى تلف الأنسجة ، واضطرابات المناعة الذاتية ، وتكوين الجلطات ، وضعف إعادة التوعي4،5،6،7،8،9،10.
تم إثبات الدور الممرض للشبكات في التليف غير المنضبط بعد احتشاء عضلة القلب وتشكيل تمدد الأوعية الدموية البطيني من خلال توسيع التليف حول الأوعية الدموية4،11. نموذج احتشاء عضلة القلب وعزل العدلات من نخاع العظام في الفئران كلاهما راسخ. الكريات البيض متعددة الأشكال (PMN) ، وهي نوع من خلايا الدم البيضاء الوفيرة في دم الإنسان ، بمثابة مصدر ممتاز لعزل العدلات البشرية. هذه الطريقة تلغي الحاجة إلى حصاد نخاع العظام ، وبالتالي تعزيز السلامة والكفاءة.
تلعب الشبكات أيضا دورا في الرجفان الأذيني المرتبط بإعادة تشكيل القلب. ومع ذلك ، تم استخدام الكبيرة مثل والخنازير لنمذجة الرجفان الأذيني ، حيث تفتقر الفئران إلى الأذين الكبير بما يكفي لإنشاء دورة إعادة الدخول أو نموذج AF ، ما لم يتم هدم أو طرق إشارات محددة أو طردها12. في حين أنه من الممكن إحداث الرجفان الأذيني في الفئران وعزل العدلات من الدم المحيطي للفئران كما هو موضح سابقا ، واجه الباحثون قيدا حيث يمكن عزل 2 × 105-5 × 105 عدلات فقط من الدم المحيطي (10 مل لكل فئران). يتطلب استخراج شبكات كافية في كل نقطة زمنية ما يقرب من 10-25 فأرا (5 × 106 عدلات في المجموع) ، مما يؤدي إلى عملية تستغرق وقتا طويلا ومكلفة وغالبا ما تكون منخفضة الغلة13. في هذا الصدد ، يقدم Li He وزملاؤه استراتيجية موجهة نحو نخاع العظام للحصول على شبكات كافية من الفئران14. في مقالتهم ، يقدمون وصفا شاملا لعزل العدلات من نخاع عظم الفئران ومقارنة قدرات إفراز NET للعدلات الطرفية ونخاع العظم في الفئران. تلبي الطريقتان التوضيحيتان أهدافا تجريبية متميزة ، وكلاهما ينتج عنه كميات كافية من العدلات في نخاع عظم الفئران مع تقليل عدد الفئران المطلوبة. أظهرت طريقة العزل المكونة من خطوتين تنقية فائقة للعدلات ، بينما أثبتت الطريقة المكونة من خطوة واحدة كفاءتها من حيث الوقت مع مستويات تنقية مقبولة. علاوة على ذلك ، قارن الباحثون NETosis وتشكيل NET بين العدلات في نخاع عظم الفئران ونظيراتها المحيطية ، ووجدوا قوة متساوية مع PMN. تساهم هذه النتائج بشكل كبير في الدراسات المتعلقة بالعدلات حول الرجفان الأذيني وتؤكد على أهمية الاختيار المرن لمصادر مختلفة لعزل العدلات في التجارب المختلفة ذات توزيعات العدلات المختلفة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A32790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A32744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A21125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rat myeloperoxidase</td>
			<td>Abcam, England</td>
			<td>ab134132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rat neutrophil elastase</td>
			<td>Abcam, England</td>
			<td>ab21595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo Image Cytometer</td>
			<td>Nexelom, USA</td>
			<td>200-BFFL-5C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10099141C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>C14175500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD, China</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>SL050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>biosharp, China</td>
			<td>BL539A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone, USA</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE, USA</td>
			<td>P8370-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>&#160;P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picogreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>P11496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat neutrophil isolation kit</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>P9200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>R1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media</td>
			<td>Hyclone, USA</td>
			<td>SH30809.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RWD Universal Animal Anesthesia Machine</td>
			<td>RWD, China</td>
			<td>R500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley (SD) rats</td>
			<td>Dashuo, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SytoxGreen</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>T1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Biofroxx, German</td>
			<td>1139ML100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unique approach for isolating rat bone marrow neutrophils with comparable capacity

كان الهدف الأساسي من هذا البحث هو تطوير نهج موثوق وفعال لعزل مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) من نخاع عظم الفئران. نشأ هذا الجهد بسبب القيود المرتبطة بالطريقة التقليدية لاستخراج الشبكات من الدم المحيطي ، ويرجع ذلك أساسا إلى ندرة العدلات المتاحة للعزل. كشفت الدراسة عن منهجيتين متميزتين للحصول على العدلات الفئران من نخاع العظام: إجراء مبسط من خطوة واحدة أسفر عن مستويات تنقية مرضية ، وعملية من خطوتين أكثر كثافة للوقت أظهرت كفاءة تنقية معززة. الأهم من ذلك ، أن كلتا التقنيتين أسفرت عن كمية كبيرة من العدلات القابلة للحياة ، تتراوح بين 50 إلى 100 مليون لكل فئران. عكست هذه الكفاءة النتائج التي تم الحصول عليها من عزل العدلات من كل من المصادر البشرية والفئران. بشكل ملحوظ ، أظهرت العدلات المشتقة من نخاع عظم الفئران قدرات مماثلة لإفراز الشبكات عند مقارنتها بالعدلات التي تم الحصول عليها من الدم المحيطي. ومع ذلك ، فإن الطريقة القائمة على نخاع العظم أنتجت باستمرار كميات أكبر بشكل ملحوظ من كل من العدلات و NETs. أظهر هذا النهج إمكانية الحصول على كميات أكبر بكثير من هذه المكونات الخلوية لمزيد من التطبيقات النهائية. والجدير بالذكر أن هذه الشبكات المعزولة والعدلات تبشر بمجموعة من التطبيقات ، تغطي مجالات الالتهاب والعدوى وأمراض المناعة الذاتية.

Neutrophils constitute a critical subset of leukocytes that play a pivotal role in the innate immune response. They are characterized by multilobed nuclei and granules containing various proteases and antimicrobial peptides1. Neutrophils primarily function through degranulation, phagocytosis, and the formation of NETs. The observation of NETs was first made by Takei et al. in 1996 during an experiment where neutrophils were stimulated with phorbol myristate acetate (PMA)2. Subsequently, the process of NET formation was coined &#34;NETosis&#34; by Brinkmann et al.3 in 2004. Their research further illuminated the crucial role of NETs in neutrophil-mediated antimicrobial responses. NETs are web-like structures composed of chromatin, histones, and antimicrobial proteins that are released from activated neutrophils in response to infectious and inflammatory stimuli. NETs can immobilize and kill invading pathogens by trapping them and exposing them to a high concentration of antimicrobial peptides and proteases1,3. Additionally, NETs contribute to the clearance of apoptotic cells and participate in inflammation resolution. Recent studies also indicate that an excessive formation of NETs or impaired NET degradation can lead to tissue damage, autoimmune disorders, thrombogenesis, and impaired revascularization4,5,6,7,8,9,10.
The pathogenic role of NETs in uncontrolled fibrosis following myocardial infarction and the formation of ventricular aneurysms has been demonstrated through the expansion of perivascular fibrosis4,11. The myocardial infarction model and the isolation of neutrophils from bone marrow in mice are both well-established. Polymorphonuclear (PMN) leukocytes, a type of white blood cell abundant in human blood, serve as an excellent source for isolating human neutrophils. This method eliminates the need to harvest bone marrow, thus enhancing safety and efficiency.
NETs also play a role in atrial fibrillation associated with cardiac remodeling. However, large animals such as dogs and pigs were utilized to model atrial fibrillation, as mice lack an atrium sizable enough to establish a re-entrant cycle or the AF model, unless specific ion channels or signaling pathways are knocked down or knocked out12. While it&#39;s possible to induce atrial fibrillation in rats and isolate neutrophils from rat peripheral blood as previously described, researchers encountered a limitation whereby only 2 x 105-5 x 105 neutrophils could be isolated from peripheral blood (10 mL per rat). Extracting sufficient NETs at each time point required approximately 10-25 rats (5 x 106 neutrophils in total), resulting in a time-consuming, expensive, and often low-yield process13. In this regard, Li He and colleagues present a bone marrow-oriented strategy to obtain adequate NETs from rats14. In their article, they provide a comprehensive description of isolating neutrophils from rat bone marrow and compare the NET secretion capabilities of rat peripheral and bone marrow neutrophils. The two methods outlined cater to distinct experimental goals, both resulting in sufficient quantities of rat bone marrow neutrophils while reducing the number of required rats. The two-step isolation method demonstrated superior neutrophil purification, while the one-step method proved time-efficient with acceptable purification levels. Furthermore, the researchers compared NETosis and NET formation between rat bone marrow neutrophils and their peripheral counterparts, finding equal potency with PMN. These findings significantly contribute to neutrophil-related studies of atrial fibrillation and underscore the importance of flexibly selecting different sources for neutrophil isolation in various experimental animals with differing neutrophil distributions.

تسليط الضوء على المؤلف: الطريقة المثلى لعزل العدلات الفئران والشبكات من نخاع العظام

نهج فريد لعزل العدلات نخاع عظم الفئران بسعة مماثلة

We have developed a method of isolating rat neutrophils and subsequently extracting NETs. This method offers to optimize the accessibility for conducting NETs-related experiments in both rats and rat-derived cell lines. In our study, we conducted a comparation between neutrophils that were isolated from the peripheral blood and bone marrow threads.Our findings highlight the superiority of bone marrow-derived neutrophils, showcasing a substantial numerical advantage in isolated neutrophil counts alongside their proficient capability to synchronize. Our bone marrow-based method for isolating rat neutrophils and NETs fills a research gap by optimizing isolation techniques for these cell types. Unlike previous methods that primarily used peripheral blood, our protocol targets bone marrow, increasing neutrophil in large yields, and offering a more accurate rat model for studying neutrophil and rat biology.

يحدد البروتوكول الموضح هنا طريقتين متميزتين ، تتميز كل منهما بتنقية محسنة أو خطوات مبسطة. أسفرت كلتا الطريقتين عن حوالي 0.5 × 108-1 × 108 عدلات لكل فئران. أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي ، باستخدام مجموعة الكشف عن موت الخلايا المبرمج V-FITC / PI المرفقة ، صلاحية الخلية أعلى من 90٪ ، مقارنة ب?...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Optimized Method for Isolating Rat Neutrophils and NETs from Bone Marrow at JoVE.com

يحدد هذا البحث تقنيتين لعزل مصائد العدلات خارج الخلية الوفيرة (NETs) من نخاع عظم الفئران. تجمع إحدى الطرق بين مجموعة عزل العدلات التجارية والطرد المركزي المتدرج للكثافة ، بينما تستخدم الطريقة الأخرى الطرد المركزي المتدرج للكثافة فقط. كلا النهجين يتمخضان عن شبكات وظيفية تفوق تلك الموجودة في العدلات الدموية المحيطية.

The primary aim of this research was to develop a reliable and efficient approach for isolating neutrophil extracellular traps (NETs) from rat bone ...

لقد طورنا طريقة لعزل العدلات الفئران واستخراج الشبكات لاحقا. توفر هذه الطريقة تحسين إمكانية الوصول لإجراء التجارب المتعلقة بالشبكات في كل من الفئران وخطوط الخلايا المشتقة من الفئران. في دراستنا ، أجرينا مقارنة بين العدلات التي تم عزلها من الدم المحيطي وخيوط نخاع العظام.تسلط النتائج التي توصلنا إليها الضوء على تفوق العدلات المشتقة من نخاع العظم ، مما يدل على ميزة عددية كبيرة في عدد العدلات المعزولة إلى جانب قدرتها على المزامنة. تملأ طريقتنا القائمة على نخاع العظام لعزل العدلات والشبكات في الفئران فجوة بحثية من خلال تحسين تقنيات العزل لهذه الأنواع من الخلايا. على عكس الطرق السابقة التي استخدمت الدم المحيطي في المقام الأول ، يستهدف بروتوكولنا نخاع العظام ، وزيادة العدلات في الغلة الكبيرة ، وتقديم نموذج فئران أكثر دقة لدراسة العدلات وبيولوجيا الفئران.

unique-approach-for-isolating-rat-bone-marrow-neutrophils-with

Research

JoVE Journal

Biology

Unique Approach for Isolating Rat Bone Marrow Neutrophils with Comparable Capacity

1.3K Views.  Sichuan University. لقد طورنا طريقة لعزل العدلات الفئران واستخراج الشبكات لاحقا. توفر هذه الطريقة تحسين إمكانية الوصول لإجراء التجارب المتعلقة بالشبكات في كل من الفئران وخطوط الخلايا المشتقة من الفئران. في دراستنا ، أجرينا مقارنة بين العدلات التي تم عزلها من الدم المحيطي وخيوط نخاع العظام.

Video: تسليط الضوء على المؤلف: الطريقة المثلى لعزل العدلات الفئران والشبكات من نخاع العظام

The primary aim of this research was to develop a reliable and efficient approach for isolating neutrophil extracellular traps (NETs) from rat bone marrow. This effort arose due to limitations associated with the traditional method of extracting NETs from peripheral blood, mainly due to the scarcity of available neutrophils for isolation. The study revealed two distinct methodologies for obtaining rat neutrophils from bone marrow: a streamlined one-step procedure that yielded satisfactory purification levels, and a more time-intensive two-step process that exhibited enhanced purification efficiency. Importantly, both techniques yielded a substantial quantity of viable neutrophils, ranging between 50 to 100 million per rat. This efficiency mirrored the results obtained from isolating neutrophils from both human and murine sources. Significantly, neutrophils derived from rat bone marrow exhibited comparable abilities to secrete NETs when compared with neutrophils obtained from peripheral blood. However, the bone marrow-based method consistently produced notably larger quantities of both neutrophils and NETs. This approach demonstrated the potential to obtain significantly greater amounts of these cellular components for further downstream applications. Notably, these isolated NETs and neutrophils hold promise for a range of applications, spanning the realms of inflammation, infection, and autoimmune diseases.

This research outlines two techniques for isolating abundant neutrophil extracellular traps (NETs) from rat bone marrow. One method combines a commercial neutrophil isolation kit with density gradient centrifugation, while the other employs only density gradient centrifugation. Both approaches yield functional NETs surpassing those from peripheral blood neutrophils.