자금 지원: 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단(Nos. 82004154, 81900311, 82100336 및 81970345)의 지원을 받았습니다.

이 연구는 쓰촨 대학 화서부 병원 동물 윤리 위원회의 동물 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 쓰촨 대학교 중국 서부 병원 동물 윤리 위원회가 부여한 프로젝트 라이선스(No. 20211404A)에 따라 수행되었습니다. 윤리 지침에 따라 이 연구에 사용된 쥐는 12시간 명암 주기, 온도 22-24°C 및 습도 50%-60%의 통제된 환경에서 유지되었습니다. 쥐들은 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있게 되었다. 이 연구에 사용된 동물은 6-8주 된 Sprague Dawley(SD) 수컷 쥐였으며 무게는 약 250g이고 특정 병원체가 없었습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었다( 자료표 참조).
1. 쥐 호중구의 분리
<ol><li>골수 채취<ol><li>마취를 위해 쥐를 적절한 용기에 넣으십시오( 재료 표 참조). 동물이 의식을 잃을 때까지 쥐에게 3% 이소플루란을 투여합니다. 마취 깊이를 확인하기 위해 발가락 꼬집기 또는 꼬리 꼬집음에 반응이 없는지 확인하십시오.</li>
		<li>쥐가 깊이 마취되면 쥐를 등에 눕히고 한 손으로 꼬리를 잡고 다른 손으로 머리를 잡고 경추 탈구를 수행합니다. 경추가 절단될 때까지 머리를 아래로 당기면서 꼬리에 갑작스럽고 강한 위쪽 힘을 가하여 목을 빠르고 단단히 탈구시킵니다. 호흡 정지 및 심장 박동 부족과 같은 사망 확인이 확인될 때까지 기다렸다가 조직 채취 또는 폐기를 진행합니다.</li>
		<li>쥐를 75% 에탄올에 담그고 몇 분 동안 그대로 두어 털과 피부를 살균합니다. 쥐를 눕히고 엉덩이에서 하지를 절단하여 대퇴골 머리를 보호합니다. 해부 가위를 사용하여 족관절의 인대를 절단하고 무릎 관절을 뒤로 접어 대퇴골과 경골을 노출시킵니다.</li>
		<li>집게와 가위를 사용하여 뼈에 연결된 근육, 힘줄 및 기타 조직을 조심스럽게 제거합니다. Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)으로 뼈를 헹구어 남아 있는 조직 파편과 혈액을 제거합니다. 두 번 더 반복하여 총 세 번 세탁합니다. 깨끗이 씻은 뼈를 멸균 용기에 넣습니다.</li>
		<li>바늘이 달린 5mL 또는 10mL 주사기를 사용하여 뼈의 양쪽 끝을 통해 골수를 찔러 골수 기질을 풉니다. 눈에 보이는 골수를 씻어낼 수 없을 때까지 다른 주사기로 10-15mL Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 배지로 골수를 헹굽니다.</li>
		<li>골수 세포를 300 x g 에서 20°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 5-10mL 적혈구 용해 완충액( 재료 표 참조)을 추가하여 세포를 재현탁시키고 실온에서 3분 동안 배양합니다. 혼합물에 HBSS 부피의 4배를 추가합니다. 실온에서 600 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 피펫으로 상층액을 버리고 생성된 펠릿을 추가 사용을 위해 사용합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>골수에서 호중구 분리<ol><li>2단계 방법의 경우 다음 추가 단계를 수행합니다.<ol><li>제조업체의 지침에 따라 상용화된 쥐 호중구 분리 키트를 사용하여 골수 세포를 분리합니다( 재료 표 참조).</li>
			<li>새로운 15mL 원심분리 튜브에 55% 퍼콜 시약 2mL( 재료 표 참조), 65% 시약 2mL, 70% 시약 2mL, 80% 시약 2mL를 적층하여 밀도 구배를 준비합니다. 20°C에서 40분 동안 800 x g 에서 튜브를 원심분리하고 가속을 5로 설정하고 감속을 0 또는 1로 설정합니다.</li>
			<li>멸균 피펫을 사용하여 65%와 70% 그래디언트 시약 사이의 경계에 있는 세포층을 포함하여 70% 그래디언트 층을 수집합니다. 세포 현탁액을 새 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브에 HBSS 15mL를 넣고 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집어 세포를 세척합니다. 실온에서 10분 동안 튜브를 300 x g 으로 원심분리하여 세포를 펠트합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>1단계 방법의 경우 다음 추가 단계를 수행합니다.<ol><li>쥐 호중구 분리 키트를 사용하지 않고 골수 세포를 그래디언트에 적용하십시오.</li>
			<li>멸균 피펫을 사용하여 65%와 70% 그래디언트 사이의 경계에 있는 세포층을 포함하여 70% 그래디언트 층을 수집합니다. 세포 현탁액을 새로운 50mL 원심분리 튜브로 옮기고 HBSS로 세포를 세척합니다. 실온에서 400 x g 에서 5분 동안 튜브를 원심분리하여 세포를 펠트합니다.</li>
			<li>혈구계를 사용하여 분리된 호중구를 계수하고 트리판 블루 염색을 사용하여 생존율을 평가합니다. 참고: 프로토콜은 쥐의 수와 원하는 분리된 호중구 수에 따라 수정할 수 있습니다. 이 방법을 새로운 실험 환경에서 처음 사용할 때 세 마리의 쥐로부터 허용 가능한 양의 뼈를 얻습니다. 모든 절차는 멸균 상태에서 수행해야 합니다. 골수에서 호중구를 분리하는 것은 세포 손상과 생존력 손실을 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 수행되어야 합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. 쥐그물 획득
<ol><li>0.5 x 108-1 x 108 분리된 호중구를 4mL RPMI 배지(10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 보충)에 재현탁하여 멸균된 10cm 페트리 접시에 담습니다.</li>
	<li>NETosis를 유도하기 위해 호중구 현탁액에 500nM PMA( 재료 표 참조)를 추가합니다. 37 °C 및 5 % CO2에서 3 시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>음성 대조군의 경우 DNase I(10U/mL)을 호중구 현탁액에 첨가하여 분비된 NET을 분해합니다.</li>
	<li>그물을 수확하려면 배지를 제거하고 페트리 접시에 부착된 그물을 HBSS로 부드럽게 씻으십시오. 그런 다음 각 플레이트에 대해 4mL의 새 배지로 강하게 세척하여 플레이트에서 그물을 분리합니다.</li>
	<li>NET의 완전한 재현탁을 위해 세척 매체와 피펫을 자주 수집하십시오.</li>
	<li>현탁액을 300× g 에서 20°C에서 10분 동안 원심분리하여 부유 셀을 제거합니다.</li>
	<li>NET이 포함된 현탁액을 멸균 튜브로 옮기고 2주 이내에 추가로 사용할 수 있도록 -20°C에서 보관합니다. 알림: NET은 열화에 민감하므로 최상의 결과를 얻으려면 갓 수확한 재료를 사용하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>3. NET의 존재 여부 확인
<ol><li>4% 파라포름알데히드가 있는 커버슬립에 세포(2.4단계에서)를 15분 동안 고정하고 NET(2.7단계에서)을 30분에서 1시간 동안 고정합니다.</li>
	<li>파라핀 필름으로 덮인 시험관 스탠드의 PBS/PBST 물방울에 커버슬립을 뒤집고 각각 5분씩 세척 과정을 세 번 반복합니다.</li>
	<li>실온에서 10분 동안 0.5% Triton-X-100으로 세포를 투과시키고 PBS/PBST에서 각각 1분씩 3회 세척합니다. 10% 일반 당나귀 혈청( 재료 표 참조)으로 실온에서 1시간 동안 세포를 밀봉합니다.</li>
	<li>항-쥐 호중구 엘라스타제 항체 및 항-쥐 골수과산화효소 항체( 재료 표 참조)로 세포를 4°C에서 밤새 배양합니다. 그런 다음 PBS/PBST에서 커버슬립을 각각 5분 동안 세 번 세탁합니다.</li>
	<li>2차 항체 A488-conjugated donkey anti-rabbit IgG(H + L), A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) 및 A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1( 재료 표 참조)을 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS/PBST에서 커버슬립을 각각 5분 동안 세 번 세탁합니다.</li>
	<li>10mg/mL DAPI의 염색 세포 핵 및 NET 골격. 그런 다음 PBS/PBST에서 커버슬립을 각각 5분 동안 세 번 세탁합니다.</li>
	<li>유리 슬라이드에 장착 매체 한 방울을 놓고 셀이 있는 커버슬립을 뒤집습니다. 침지 렌즈로 현미경 분석을 위해 1시간 동안 건조시키십시오. 그렇지 않으면 검사할 준비가 된 것입니다. 알림: NET은 매우 깨지기 쉽고 준비 중에 쉽게 손실될 수 있으므로 고정 후에도 조작할 때 세심한 주의를 기울여야 합니다.</li>
</ol>4. NET의 정량화
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 Tris-EDTA(TE) 완충액 및 PicoGreen(dsDNA 분석 시약) 작업 용액을 준비합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>스톡 DNA를 1ng/mL, 10ng/mL, 100ng/mL 및 1μg/mL의 농도로 희석하여 표준물질을 준비합니다. 참고: NET의 농도를 정량화하기 위해 dsDNA 분석 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 제조업체의 지침을 준수했습니다. Tris-EDTA(TE) 완충액 및 dsDNA 분석 시약은 각각 19배 부피의 이중 증류수 또는 199배 부피의 TE 완충액을 사용하여 준비되었습니다. 이어서, 표준 용액(1ng/mL, 10ng/mL, 100ng/mL 및 1μg/mL)을 제조하고, 각 50μL의 시료를 450μL의 TE 완충액과 결합하였다.</li>
	<li>각 샘플의 50μL를 450μL TE 버퍼에 추가합니다.</li>
	<li>표준물질 및 샘플을 포함하여 동일한 부피의 분석 시약 작업 용액과 함께 100μL의 표준물질 또는 샘플을 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.</li>
	<li>직사광선을 피하고 실온에서 2-5분 동안 접시를 배양합니다.</li>
	<li>방출 스펙트럼이 약 530nm이고 흡광도 스펙트럼이 약 480nm인 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 샘플을 판독합니다.</li>
	<li>표준물질에 의해 생성된 표준 곡선을 사용하여 각 샘플의 NETs 농도를 계산합니다.</li>
</ol>5. 세포세포분석에 의한 NETs 분비 분석
<ol><li>96웰 플레이트에서 배양한 세포에 핵 염색( 재료 표 참조)을 추가하여 최종 농도 10ng/mL에 도달하고 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>cell-free DNA(cfDNA, 재료 표 참조) 염색을 세포에 추가하여 최종 농도 300nM에 도달하고 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>부드러운 피펫팅으로 형광 염료를 혼합합니다. 상층액을 버리거나 펠릿을 세척하지 마십시오.</li>
	<li>샘플 플레이트를 유세포 분석기 기기에 로드합니다.</li>
	<li>다양한 채널의 초점 및 노출 시간에 대한 매개변수를 설정합니다: 파란색(예: 377/50nm, em: 470/22nm), 일반적으로 30,000ms의 노출, 녹색(예: 483/32nm, eM: 536/40nm), 일반적으로 5,000ms의 노출.</li>
	<li>다양한 채널에서 전체 플레이트의 매우 균일한 이미지를 캡처합니다.</li>
	<li>다양한 그룹에 대한 핵 염색 수를 분석합니다. 유사하다면 cfDNA 염색 횟수로 NET 분비를 측정할 수 있습니다.</li>
</ol>

효율적인 Rat Bone Marrow Neutrophil Extracellular Trap 분리

<ol>
	<li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+killing+of+human+neutrophils+by+the+potent+activator+phorbol+12-myristate+13-acetate+(PMA)+accompanied+by+changes+different+from+typical+apoptosis+or+necrosis.">Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+induce+intestinal+damage+and+thrombotic+tendency+in+inflammatory+bowel+disease.">Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).</li><li>Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+arterial+and+venous+thrombosis.">Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).</li><li>Dinallo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+traps+sustain+inflammatory+signals+in+ulcerative+colitis.">Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).</li><li>Dicker, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+are+associated+with+disease+severity+and+microbiota+diversity+in+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).</li><li>Franck, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+PAD4+and+netosis+in+experimental+atherosclerosis+and+arterial+injury:+Implications+for+superficial+erosion.">Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion.</a> Atherosclerosis. 275, e11 (2018).</li><li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).</li><li>Marin-Esteban, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afa/Dr+diffusely+adhering+Escherichia+coli+strain+C1845+induces+neutrophil+extracellular+traps+that+kill+bacteria+and+damage+human+enterocyte-like+cells.">Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells.</a> Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).</li><li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+released+by+neutrophils+impair+revascularization+and+vascular+remodeling+after+stroke.">Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke.</a> Nature Communications. 11 (1), 2488 (2020).</li><li>Sch&#252;ttler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atrial+fibrillation.">Animal models of atrial fibrillation.</a> Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).</li><li>Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+human+neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+isolation+and+handling.">Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling.</a> Journal of Visualized Experiments. 98, e52687 (2015).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+is+the+preferred+source+for+isolation+of+rat+neutrophils+and+the+subsequent+acquisition+of+neutrophil+extracellular+traps.">Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps.</a> Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).</li><li>Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nycodenz+gradient+method+for+the+purification+of+neutrophils+from+the+peripheral+blood+of+rats.">A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats.</a> Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).</li><li>Zindl, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-22-producing+neutrophils+contribute+to+antimicrobial+defense+and+restitution+of+colonic+epithelial+integrity+during+colitis.">IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).</li><li>Wong, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+reveals+the+defining+features+of+the+classical,+intermediate,+and+nonclassical+human+monocyte+subsets.">Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets.</a> Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).</li><li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood.">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).</li><li>Lindena, J., Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+chemiluminescence+properties+of+human,+canine+and+rat+polymorphonuclear+cells.">Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells.</a> Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).</li><li>Lauwers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Transwell+assay+for+the+analysis+of+neutrophil+chemotaxis+using+flow+cytometry+to+refine+the+clinical+investigation+of+immunodeficient+patients.">Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients.</a> Clinical Immunology. 238, 108994 (2022).</li><li>Evrard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+analysis+of+bone+marrow+neutrophils+reveals+populations+specialized+in+expansion,+trafficking,+and+effector+functions.">Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions.</a> Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).</li></ol>

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

호중구의 분리는 NETosis를 연구하는 데 있어 중추적인 단계를 구성하며, 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해서는 적절한 분리 방법을 선택하는 것이 가장 중요합니다. 고려해야 할 중요한 요소는 격리 중 림프구 오염의 발생입니다. 이 문제를 해결하는 것은 골수에서 쥐 호중구를 분리할 때 특히 중요합니다. 림프구(1.0337-1.0765, 최대 1.0526)에 비해 호중구(1.0814-1.0919, 최대 1.0919)의 뚜렷한 밀도 범위에도...

호중구는 선천성 면역 반응에서 중추적인 역할을 하는 백혈구의 중요한 하위 집합을 구성합니다. 이들은 다양한 프로테아제와 항균 펩타이드를 함유하는 다엽 핵과 과립을 특징으로 한다1. 호중구는 주로 탈과립화, 식균작용 및 NET의 형성을 통해 기능합니다. NET의 관찰은 1996년 Takei et al.이 호중구를 phorbol myristate acetate(PMA)2로 자극하는 실험에서 처음 이루어졌습니다. 그 후, NET 형성 과정은 2004년 Brinkmann et al.3에 의해 "NETosis"라는 용어로 만들어졌습니다. 그들의 연구는 호중구 매개 항균 반응에서 NET의 중요한 역할을 더욱 조명했습니다. NET은 크로마틴, 히스톤 및 항균 단백질로 구성된 거미줄 모양의 구조로, 감염성 및 염증성 자극에 반응하여 활성화된 호중구에서 방출됩니다. NET은 침입하는 병원체를 가두고 고농도의 항균 펩타이드와 프로테아제에 노출시켜 고정시키고 죽일 수 있습니다 1,3. 또한 NET은 자가사멸 세포의 청소에 기여하고 염증 해결에 관여합니다. 최근 연구에 따르면 NET의 과도한 형성 또는 NET 분해 장애는 조직 손상, 자가면역 질환, 혈전 형성 및 혈관 재형성 장애를 유발할 수 있습니다 4,5,6,7,8,9,10.
심근경색 및 심실동맥류 형성에 따른 조절되지 않는 섬유증에서 NET의 병원성 역할은 혈관 주위 섬유증의 확장을 통해 입증되었습니다 4,11. 심근 경색 모델과 생쥐의 골수에서 호중구를 분리하는 것은 모두 잘 확립되어 있습니다. 인간의 혈액에 풍부한 백혈구의 일종인 다형핵(PMN) 백혈구는 인간 호중구를 분리하는 훌륭한 공급원 역할을 합니다. 이 방법은 골수를 채취할 필요가 없어 안전성과 효율성이 향상됩니다.
NET은 심장 리모델링과 관련된 심방세동에서도 중요한 역할을 합니다. 그러나, 개나 돼지와 같은 큰 동물을 이용하여 심방세동을 모델링하였는데, 이는 마우스는 특정 이온 채널이나 신호전달 경로가 녹다운되거나 녹아웃되지 않는 한, 재진입 주기 또는 AF 모델을 확립할 수 있을 만큼 충분히 큰 심방이 없기 때문이다12. 앞서 설명한 바와 같이 쥐의 심방세동을 유도하고 쥐의 말초 혈액에서 호중구를 분리하는 것이 가능하지만, 연구자들은 말초 혈액에서 2 x 105-5 x 105 호중구만 분리할 수 있다는 한계에 부딪혔습니다(쥐당 10mL). 각 시점에서 충분한 NET을 추출하려면 약 10-25마리의 쥐(총 5 x 106 개의 호중구)가 필요했으며, 그 결과 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며 종종 수율이 낮은 공정이 발생했다13. 이와 관련하여, Li He와 동료들은 쥐로부터 적절한 NET을 얻기 위한 골수 지향 전략을 제시한다14. 이 논문에서 그들은 쥐 골수에서 호중구를 분리하는 방법에 대한 포괄적인 설명을 제공하고 쥐 말초 호중구와 골수 호중구의 NET 분비 능력을 비교합니다. 개괄된 두 가지 방법은 서로 다른 실험 목표를 충족하며, 둘 다 필요한 쥐의 수를 줄이면서 충분한 양의 쥐 골수 호중구를 생성합니다. 2단계 분리 방법은 우수한 호중구 정제를 입증한 반면, 1단계 분석법은 허용 가능한 정제 수준으로 시간 효율적인 것으로 입증되었습니다. 또한, 연구진은 쥐의 골수 호중구와 말초 호중구 사이의 NETosis 및 NET 형성을 비교하여 PMN과 동일한 효능을 발견했습니다. 이러한 발견은 심방세동의 호중구 관련 연구에 크게 기여하고 호중구 분포가 다른 다양한 실험 동물에서 호중구 분리를 위한 다양한 소스를 유연하게 선택하는 것의 중요성을 강조합니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A32790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A32744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A21125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rat myeloperoxidase</td>
			<td>Abcam, England</td>
			<td>ab134132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rat neutrophil elastase</td>
			<td>Abcam, England</td>
			<td>ab21595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo Image Cytometer</td>
			<td>Nexelom, USA</td>
			<td>200-BFFL-5C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10099141C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>C14175500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD, China</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>SL050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>biosharp, China</td>
			<td>BL539A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone, USA</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE, USA</td>
			<td>P8370-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>&#160;P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picogreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>P11496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat neutrophil isolation kit</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>P9200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>R1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media</td>
			<td>Hyclone, USA</td>
			<td>SH30809.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RWD Universal Animal Anesthesia Machine</td>
			<td>RWD, China</td>
			<td>R500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley (SD) rats</td>
			<td>Dashuo, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SytoxGreen</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>T1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Biofroxx, German</td>
			<td>1139ML100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unique approach for isolating rat bone marrow neutrophils with comparable capacity

이 연구의 주요 목표는 쥐 골수에서 호중구 세포외 트랩(NET)을 분리하기 위한 신뢰할 수 있고 효율적인 접근 방식을 개발하는 것이었습니다. 이러한 노력은 말초 혈액에서 NET을 추출하는 전통적인 방법과 관련된 제한으로 인해 발생했으며, 주로 분리에 사용할 수 있는 호중구가 부족하기 때문입니다. 이 연구는 골수에서 쥐 호중구를 얻기 위한 두 가지 뚜렷한 방법론, 즉 만족스러운 정제 수준을 산출하는 간소화된 1단계 절차와 향상된 정제 효율을 나타내는 더 많은 시간 집약적인 2단계 프로세스를 보여주었습니다. 중요한 것은, 두 기술 모두 쥐 한 마리당 5천만에서 1억 마리에 이르는 상당한 양의 생존 가능한 호중구를 산출했다는 것입니다. 이 효율성은 인간과 쥐 공급원 모두에서 호중구를 분리하여 얻은 결과를 반영했습니다. 의미심장하게도, 쥐의 골수에서 유래한 호중구는 말초 혈액에서 얻은 호중구와 비교할 때 NET을 분비하는 능력이 비슷했습니다. 그러나 골수 기반 방법은 지속적으로 호중구와 NET을 모두 현저하게 더 많이 생산했습니다. 이 접근법은 추가 다운스트림 응용 분야를 위해 이러한 세포 구성 요소를 훨씬 더 많이 얻을 수 있는 잠재력을 보여주었습니다. 특히, 이러한 분리된 NET과 호중구는 염증, 감염 및 자가면역 질환의 영역에 걸쳐 다양한 응용 분야에 대한 가능성을 가지고 있습니다.

Neutrophils constitute a critical subset of leukocytes that play a pivotal role in the innate immune response. They are characterized by multilobed nuclei and granules containing various proteases and antimicrobial peptides1. Neutrophils primarily function through degranulation, phagocytosis, and the formation of NETs. The observation of NETs was first made by Takei et al. in 1996 during an experiment where neutrophils were stimulated with phorbol myristate acetate (PMA)2. Subsequently, the process of NET formation was coined &#34;NETosis&#34; by Brinkmann et al.3 in 2004. Their research further illuminated the crucial role of NETs in neutrophil-mediated antimicrobial responses. NETs are web-like structures composed of chromatin, histones, and antimicrobial proteins that are released from activated neutrophils in response to infectious and inflammatory stimuli. NETs can immobilize and kill invading pathogens by trapping them and exposing them to a high concentration of antimicrobial peptides and proteases1,3. Additionally, NETs contribute to the clearance of apoptotic cells and participate in inflammation resolution. Recent studies also indicate that an excessive formation of NETs or impaired NET degradation can lead to tissue damage, autoimmune disorders, thrombogenesis, and impaired revascularization4,5,6,7,8,9,10.
The pathogenic role of NETs in uncontrolled fibrosis following myocardial infarction and the formation of ventricular aneurysms has been demonstrated through the expansion of perivascular fibrosis4,11. The myocardial infarction model and the isolation of neutrophils from bone marrow in mice are both well-established. Polymorphonuclear (PMN) leukocytes, a type of white blood cell abundant in human blood, serve as an excellent source for isolating human neutrophils. This method eliminates the need to harvest bone marrow, thus enhancing safety and efficiency.
NETs also play a role in atrial fibrillation associated with cardiac remodeling. However, large animals such as dogs and pigs were utilized to model atrial fibrillation, as mice lack an atrium sizable enough to establish a re-entrant cycle or the AF model, unless specific ion channels or signaling pathways are knocked down or knocked out12. While it&#39;s possible to induce atrial fibrillation in rats and isolate neutrophils from rat peripheral blood as previously described, researchers encountered a limitation whereby only 2 x 105-5 x 105 neutrophils could be isolated from peripheral blood (10 mL per rat). Extracting sufficient NETs at each time point required approximately 10-25 rats (5 x 106 neutrophils in total), resulting in a time-consuming, expensive, and often low-yield process13. In this regard, Li He and colleagues present a bone marrow-oriented strategy to obtain adequate NETs from rats14. In their article, they provide a comprehensive description of isolating neutrophils from rat bone marrow and compare the NET secretion capabilities of rat peripheral and bone marrow neutrophils. The two methods outlined cater to distinct experimental goals, both resulting in sufficient quantities of rat bone marrow neutrophils while reducing the number of required rats. The two-step isolation method demonstrated superior neutrophil purification, while the one-step method proved time-efficient with acceptable purification levels. Furthermore, the researchers compared NETosis and NET formation between rat bone marrow neutrophils and their peripheral counterparts, finding equal potency with PMN. These findings significantly contribute to neutrophil-related studies of atrial fibrillation and underscore the importance of flexibly selecting different sources for neutrophil isolation in various experimental animals with differing neutrophil distributions.

저자 스포트라이트: 골수에서 쥐 호중구와 NET을 분리하기 위한 최적화된 방법

비슷한 용량의 쥐 골수 호중구를 분리하기 위한 독특한 접근법

We have developed a method of isolating rat neutrophils and subsequently extracting NETs. This method offers to optimize the accessibility for conducting NETs-related experiments in both rats and rat-derived cell lines. In our study, we conducted a comparation between neutrophils that were isolated from the peripheral blood and bone marrow threads.Our findings highlight the superiority of bone marrow-derived neutrophils, showcasing a substantial numerical advantage in isolated neutrophil counts alongside their proficient capability to synchronize. Our bone marrow-based method for isolating rat neutrophils and NETs fills a research gap by optimizing isolation techniques for these cell types. Unlike previous methods that primarily used peripheral blood, our protocol targets bone marrow, increasing neutrophil in large yields, and offering a more accurate rat model for studying neutrophil and rat biology.

여기에 요약된 프로토콜은 두 가지 뚜렷한 방법을 설명하며, 각 방법은 개선된 정제 또는 간소화된 단계를 특징으로 합니다. 두 방법 모두 쥐 당 약 0.5 x 108-1 x 108 호중구를 산출했습니다. annexin V-FITC/PI 세포사멸 검출 키트를 사용한 유세포 분석 분석은 생쥐 및 인간과 유사한 90% 이상의 세포 생존율을 보였습니다(그림 1). 골수에서 호중구를 분리하는 동안 림?...

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이 연구는 쥐의 골수에서 풍부한 호중구 세포외 트랩(NET)을 분리하는 두 가지 기술을 간략하게 설명합니다. 한 가지 방법은 상용 호중구 분리 키트와 밀도 구배 원심분리를 결합하는 반면, 다른 방법은 밀도 구배 원심분리만 사용합니다. 두 접근법 모두 말초 혈액 호중구의 NET을 능가하는 기능적 NET을 산출합니다.

The primary aim of this research was to develop a reliable and efficient approach for isolating neutrophil extracellular traps (NETs) from rat bone ...

쥐 호중구를 분리한 후 NET을 추출하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 랫드와 랫트 유래 세포주 모두에서 NET 관련 실험을 수행하기 위한 접근성을 최적화합니다. 이 연구에서는 말초 혈액과 골수에서 분리된 호중구를 비교했습니다.우리의 발견은 골수 유래 호중구의 우수성을 강조하며, 능숙한 동기화 능력과 함께 분리된 호중구 수에서 상당한 수치적 이점을 보여줍니다. 쥐 호중구와 NET을 분리하기 위한 당사의 골수 기반 방법은 이러한 세포 유형에 대한 분리 기술을 최적화하여 연구 격차를 해소합니다. 주로 말초 혈액을 사용했던 이전 방법과 달리, 당사의 프로토콜은 골수를 표적으로 하여 호중구를 대량으로 증가시키고 호중구 및 쥐 생물학을 연구하기 위한 보다 정확한 쥐 모델을 제공합니다.

unique-approach-for-isolating-rat-bone-marrow-neutrophils-with

Research

JoVE Journal

Biology

Unique Approach for Isolating Rat Bone Marrow Neutrophils with Comparable Capacity

1.3K 조회수.  Sichuan University. 쥐 호중구를 분리한 후 NET을 추출하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 랫드와 랫트 유래 세포주 모두에서 NET 관련 실험을 수행하기 위한 접근성을 최적화합니다. 이 연구에서는 말초 혈액과 골수에서 분리된 호중구를 비교했습니다.우리의 발견은 골수 유래 호중구의 우수성을 강조하며, 능숙한 동기화 능력과 함께 분리된 호중구 수에서 상당한 수치적 이점을 보여줍?...