Financement : Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (nos 82004154, 81900311, 82100336 et 81970345).

L’étude a été réalisée dans le cadre d’une licence de projet (n° 20211404A) accordée par le Comité d’éthique animale de l’Hôpital de Chine occidentale de l’Université du Sichuan, conformément aux directives du Comité d’éthique animale de l’Hôpital de Chine occidentale de l’Université du Sichuan pour le soin et l’utilisation des animaux. Conformément aux directives éthiques, les rats utilisés dans cette étude ont été maintenus dans un environnement contrôlé avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures, une température de 22 à 24 °C et une humidité de 50 % à 60 %. Les rats ont eu accès à de la nourriture et à de l’eau à volonté. Les animaux utilisés dans cette étude étaient des rats mâles Sprague Dawley (SD) âgés de 6 à 8 semaines, pesant environ 250 g et exempts d’agents pathogènes spécifiques. Les animaux ont été obtenus d’une source commerciale (voir la Table des matières).
1. Isolement des neutrophiles du rat
<ol><li>Prélèvement de moelle osseuse<ol><li>Placez le rat dans un récipient approprié pour l’anesthésie (voir le tableau des matériaux). Administrer 3 % d’isoflurane au rat jusqu’à ce que l’animal soit inconscient. Vérifiez l’absence de réponse à un pincement des orteils ou de la queue pour assurer la profondeur de l’anesthésie.</li>
		<li>Une fois le rat profondément anesthésié, effectuez une luxation cervicale en plaçant le rat sur le dos et en tenant sa queue d’une main tout en saisissant la tête de l’autre main. Disloquez le cou rapidement et fermement en appliquant une force soudaine et forte vers le haut sur la queue tout en tirant la tête vers le bas jusqu’à ce que la colonne cervicale soit sectionnée. Attendez la confirmation du décès, comme l’arrêt de la respiration et l’absence de battements cardiaques, avant de procéder au prélèvement ou à l’élimination des tissus.</li>
		<li>Trempez le rat dans de l’éthanol à 75% et laissez-le reposer quelques minutes pour stériliser la fourrure et la peau. Allongez le rat sur le dos et coupez les membres inférieurs de la hanche pour protéger la tête du fémur. Utilisez des ciseaux de dissection pour couper le ligament au niveau de l’articulation du jarret et repliez l’articulation du genou vers l’arrière pour exposer le fémur et le tibia.</li>
		<li>À l’aide de pinces et de ciseaux, retirez soigneusement les muscles, tendons et autres tissus reliés aux os. Rincez les os avec la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) pour éliminer les débris tissulaires et le sang restants. Répétez deux fois de plus, pour un total de trois lavages. Placez les os nettoyés dans un récipient stérile.</li>
		<li>Utilisez une seringue de 5 ou 10 ml avec une aiguille pour enfoncer la moelle à travers les deux extrémités de l’os afin de détacher la matrice de moelle. Rincer la moelle osseuse avec 10 à 15 ml de milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) avec une autre seringue, jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de moelle osseuse visible.</li>
		<li>Centrifuger les cellules de la moelle osseuse à 300 x g pendant 10 min à 20 °C. Ajouter 5 à 10 mL de tampon de lyse des globules rouges (voir la table des matières) pour remettre les cellules en suspension et incuber à température ambiante pendant 3 min. Ajouter 4 fois le volume de HBSS au mélange. Centrifuger les cellules à 600 x g pendant 5 min à température ambiante, jeter le surnageant à l’aide d’une pipette et utiliser la pastille obtenue pour une utilisation ultérieure.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolement des neutrophiles dans la moelle osseuse<ol><li>Pour la méthode en deux étapes, effectuez les étapes supplémentaires suivantes :<ol><li>Isoler les cellules de la moelle osseuse à l’aide de la trousse d’isolement des neutrophiles de rat commercialisée en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matières).</li>
			<li>Préparez un gradient de densité en superposant 2 mL de réactif percoll à 55 % (voir le tableau des matériaux), 2 mL de 65 % du réactif, 2 mL de réactif à 70 % et 2 mL de réactif à 80 % dans un nouveau tube à centrifuger de 15 mL. Centrifuger le tube à 800 x g pendant 40 min à 20 °C, avec l’accélération réglée sur 5 et la décélération réglée sur 0 ou 1.</li>
			<li>Prélever la couche de gradient de 70 %, y compris les couches cellulaires à la limite entre le réactif de gradient de 65 % et 70 %, à l’aide d’une pipette stérile. Transférer la suspension cellulaire dans un nouveau tube à centrifuger de 15 ml. Ajouter 15 mL de HBSS dans le tube et retourner doucement le tube plusieurs fois pour laver les cellules. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 10 min à température ambiante pour granuler les cellules.</li>
		</ol></li>
		<li>Pour la méthode en une étape, effectuez les étapes supplémentaires suivantes :<ol><li>Soumettre les cellules de la moelle osseuse aux gradients sans utiliser le kit d’isolement des neutrophiles chez le rat.</li>
			<li>Prélevez la couche de gradient de 70 %, y compris les couches cellulaires à la limite entre 65 % et 70 %, à l’aide d’une pipette stérile. Transférez la suspension cellulaire dans un nouveau tube à centrifuger de 50 ml et lavez les cellules avec HBSS. Centrifuger le tube à 400 x g pendant 5 min à température ambiante pour granuler les cellules.</li>
			<li>Compter les neutrophiles isolés à l’aide d’un hémocytomètre et évaluer la viabilité à l’aide d’une coloration au bleu trypan. REMARQUE : Le protocole peut être modifié en fonction du nombre de rats et du nombre souhaité de neutrophiles isolés. Une quantité acceptable d’os est obtenue à partir de trois rats lorsque cette méthode est utilisée pour la première fois dans un nouveau cadre expérimental. Toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions stériles. L’isolement des neutrophiles de la moelle osseuse doit être effectué le plus rapidement possible pour minimiser les dommages cellulaires et la perte de viabilité.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Acquisition de NET pour rats
<ol><li>Mettre en suspension 0,5 x 108-1 x 108 neutrophiles isolés dans un milieu RPMI de 4 mL (complété par 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine) dans une boîte de Pétri stérile de 10 cm.</li>
	<li>Ajouter 500 nM de PMA (voir le tableau des matériaux) à la suspension de neutrophiles pour induire la NETosis. Incuber pendant 3 h à 37 °C et 5 % de CO2.</li>
	<li>Pour le témoin négatif, ajouter de la DNase I (10 U/mL) dans la suspension de neutrophiles pour dégrader les TNE sécrétées.</li>
	<li>Pour récolter les TNE, retirez le milieu et lavez délicatement les TNE attachées à la boîte de Pétri avec HBSS. Ensuite, utilisez un rinçage intense avec 4 ml de milieu frais pour chaque plaque afin de détacher les TNE de la plaque.</li>
	<li>Prélevez fréquemment le produit de lavage et pipetez pour une remise en suspension complète des TNE.</li>
	<li>Centrifuger la suspension à 300 × g pendant 10 min à 20 °C pour éliminer les cellules flottantes.</li>
	<li>Transférer la suspension contenant les TNE dans un tube stérile et conserver à −20 °C pour une utilisation ultérieure dans les 2 semaines. REMARQUE : Les TNE sont sensibles à la dégradation, il est donc recommandé d’utiliser du matériel fraîchement récolté pour de meilleurs résultats.</li>
</ol>3. Vérification de la présence de TNE
<ol><li>Fixer les cellules (à partir de l’étape 2.4) sur des lamelles avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min et des TNE (à partir de l’étape 2.7) pendant 30 min à 1 h.</li>
	<li>Retournez la lamelle sur une gouttelette PBS/PBST sur un support de tube à essai recouvert d’un film de paraffine et répétez le processus de lavage trois fois pendant 5 minutes chacun.</li>
	<li>Perméabiliser les cellules avec 0,5 % de Triton-X-100 pendant 10 min à température ambiante et laver trois fois dans du PBS/PBST pendant 1 min chacune. Scellez les cellules avec le sérum d’âne normal à 10 % (voir tableau des matériaux) à température ambiante pendant 1 heure.</li>
	<li>Incuber les cellules avec l’anticorps anti-élastase neutrophile et l’anticorps anti-myéloperoxydase anti-rat (voir tableau des matières) pendant une nuit à 4 °C. Ensuite, laver la lamelle dans PBS/PBST trois fois pendant 5 minutes chacune.</li>
	<li>Incuber les cellules avec l’anticorps secondaire A488 IgG (H + L) anti-lapin conjugué à l’âne, l’IgG anti-souris à l’âne conjugué A594 (H + L) et l’anticorps IgG1 anti-souris à la chèvre conjugué A594 (voir tableau des matières) à température ambiante pendant 1 h dans l’obscurité. Ensuite, laver la lamelle dans PBS/PBST trois fois pendant 5 minutes chacune.</li>
	<li>Noyaux de cellules colorantes et squelettes de TNE avec 10 mg/mL de DAPI. Ensuite, laver la lamelle dans PBS/PBST trois fois pendant 5 minutes chacune.</li>
	<li>Placez une goutte de support de montage sur une lame de verre et retournez la lamelle avec des cellules dessus. Laissez sécher pendant 1 h pour une analyse microscopique avec des lentilles d’immersion ; sinon, il est prêt à être inspecté. REMARQUE : Il faut faire très attention lors de la manipulation des TNE, même après fixation, car elles sont extrêmement fragiles et peuvent facilement être perdues pendant la préparation.</li>
</ol>4. Quantification des TNE
<ol><li>Préparer le tampon Tris-EDTA (TE) et la solution de travail PicoGreen (réactif de test d’ADNdb) conformément aux instructions du fabricant (voir la table des matériaux).</li>
	<li>Préparer les étalons en diluant l’ADN de la mère à des concentrations de 1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL et 1 μg/mL. REMARQUE : Pour quantifier la concentration de TNE, la trousse d’analyse de l’ADNdb (voir le tableau des matières) a été utilisée, conformément aux directives du fabricant. Le tampon Tris-EDTA (TE) et les réactifs de test d’ADNdb ont été préparés en utilisant un volume de 19 fois d’eau doublement distillée ou un volume de 199 fois de tampon TE, respectivement. Par la suite, des solutions étalons (1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL et 1 μg/mL) ont été préparées, et chaque 50 μL de l’échantillon a été combiné avec 450 μL de tampon TE.</li>
	<li>Ajouter 50 μL de chaque échantillon à 450 μL de tampon TE.</li>
	<li>Ajouter 100 μL d’étalons ou d’échantillons ainsi qu’un volume égal de solution de travail de réactif d’essai dans chaque puits dans une plaque de 96 puits, y compris les étalons et les échantillons.</li>
	<li>Incuber la plaque à température ambiante pendant 2 à 5 minutes, en évitant la lumière directe.</li>
	<li>Lisez les échantillons à l’aide d’un lecteur de microplaques à fluorescence avec un spectre d’émission d’environ 530 nm et un spectre d’absorbance d’environ 480 nm.</li>
	<li>Calculer la concentration de TNE dans chaque échantillon à l’aide de la courbe standard générée par les étalons.</li>
</ol>5. Analyse de la sécrétion de TNE par cytométrie cellulaire
<ol><li>Ajouter une coloration du noyau (voir le tableau des matériaux) aux cellules incubées dans la plaque à 96 puits pour atteindre une concentration finale de 10 ng/mL et incuber pendant 30 min.</li>
	<li>Ajouter de l’ADN acellulaire (cfDNA, voir Tableau des matériaux) colorer les cellules pour atteindre une concentration finale de 300 nM et incuber pendant 10 min.</li>
	<li>Mélanger les colorants fluorescents par pipetage doux. Ne jetez pas le surnageant et ne lavez pas la pastille.</li>
	<li>Chargez la plaque d’échantillon dans l’instrument cytométrique.</li>
	<li>Réglez les paramètres de mise au point et de temps d’exposition pour les différents canaux : bleu (ex : 377/50 nm, em : 470/22 nm), généralement avec une exposition de 30 000 ms, vert (ex : 483/32 nm, eM : 536/40 nm) généralement avec une exposition de 5 000 ms.</li>
	<li>Capturez des images très uniformes de l’ensemble de la plaque sur différents canaux.</li>
	<li>Analysez le nombre de taches du noyau pour différents groupes. S’ils sont similaires, la sécrétion de TNE peut être déterminée par le nombre de colorants d’ADNcf.</li>
</ol>

Isolation efficace du piège extracellulaire de neutrophiles de moelle osseuse de rat

<ol>
	<li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+killing+of+human+neutrophils+by+the+potent+activator+phorbol+12-myristate+13-acetate+(PMA)+accompanied+by+changes+different+from+typical+apoptosis+or+necrosis.">Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+induce+intestinal+damage+and+thrombotic+tendency+in+inflammatory+bowel+disease.">Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).</li><li>Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+arterial+and+venous+thrombosis.">Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).</li><li>Dinallo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+traps+sustain+inflammatory+signals+in+ulcerative+colitis.">Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).</li><li>Dicker, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+are+associated+with+disease+severity+and+microbiota+diversity+in+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).</li><li>Franck, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+PAD4+and+netosis+in+experimental+atherosclerosis+and+arterial+injury:+Implications+for+superficial+erosion.">Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion.</a> Atherosclerosis. 275, e11 (2018).</li><li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).</li><li>Marin-Esteban, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afa/Dr+diffusely+adhering+Escherichia+coli+strain+C1845+induces+neutrophil+extracellular+traps+that+kill+bacteria+and+damage+human+enterocyte-like+cells.">Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells.</a> Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).</li><li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+released+by+neutrophils+impair+revascularization+and+vascular+remodeling+after+stroke.">Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke.</a> Nature Communications. 11 (1), 2488 (2020).</li><li>Sch&#252;ttler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atrial+fibrillation.">Animal models of atrial fibrillation.</a> Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).</li><li>Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+human+neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+isolation+and+handling.">Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling.</a> Journal of Visualized Experiments. 98, e52687 (2015).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+is+the+preferred+source+for+isolation+of+rat+neutrophils+and+the+subsequent+acquisition+of+neutrophil+extracellular+traps.">Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps.</a> Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).</li><li>Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nycodenz+gradient+method+for+the+purification+of+neutrophils+from+the+peripheral+blood+of+rats.">A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats.</a> Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).</li><li>Zindl, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-22-producing+neutrophils+contribute+to+antimicrobial+defense+and+restitution+of+colonic+epithelial+integrity+during+colitis.">IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).</li><li>Wong, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+reveals+the+defining+features+of+the+classical,+intermediate,+and+nonclassical+human+monocyte+subsets.">Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets.</a> Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).</li><li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood.">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).</li><li>Lindena, J., Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+chemiluminescence+properties+of+human,+canine+and+rat+polymorphonuclear+cells.">Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells.</a> Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).</li><li>Lauwers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Transwell+assay+for+the+analysis+of+neutrophil+chemotaxis+using+flow+cytometry+to+refine+the+clinical+investigation+of+immunodeficient+patients.">Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients.</a> Clinical Immunology. 238, 108994 (2022).</li><li>Evrard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+analysis+of+bone+marrow+neutrophils+reveals+populations+specialized+in+expansion,+trafficking,+and+effector+functions.">Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions.</a> Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).</li></ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

L’isolement des neutrophiles constitue une étape cruciale dans l’étude de la NETosis, où le choix d’une méthode d’isolement appropriée est primordial pour obtenir des résultats fiables. Un facteur important à prendre en compte est la survenue d’une contamination lymphocytaire pendant l’isolement. Il est particulièrement important de relever ce défi lorsqu’il s’agit d’isoler les neutrophiles de rat de la moelle osseuse. Malgré la gamme de densité distincte des neutrophiles (1,0814-1,0919, avec...

Les neutrophiles constituent un sous-ensemble essentiel de leucocytes qui jouent un rôle central dans la réponse immunitaire innée. Ils sont caractérisés par des noyaux et des granules multilobés contenant diverses protéases et peptides antimicrobiens1. Les neutrophiles fonctionnent principalement par dégranulation, phagocytose et formation de TNE. L’observation des TNE a été faite pour la première fois par Takei et al. en 1996 lors d’une expérience où les neutrophiles ont été stimulés avec de l’acétate de myristate de phorbol (PMA)2. Par la suite, le processus de formation des TNE a été baptisé « NETose » par Brinkmann et al.3 en 2004. Leurs recherches ont mis en lumière le rôle crucial des TNE dans les réponses antimicrobiennes médiées par les neutrophiles. Les TNE sont des structures en forme de toile composées de chromatine, d’histones et de protéines antimicrobiennes qui sont libérées par les neutrophiles activés en réponse à des stimuli infectieux et inflammatoires. Les TNE peuvent immobiliser et tuer les agents pathogènes envahissants en les piégeant et en les exposant à une forte concentration de peptides et de protéases antimicrobiens 1,3. De plus, les TNE contribuent à l’élimination des cellules apoptotiques et participent à la résolution de l’inflammation. Des études récentes indiquent également qu’une formation excessive de TNEs ou une dégradation altérée des TNE peut entraîner des lésions tissulaires, des troubles auto-immuns, une thrombogenèse et une altération de la revascularisation 4,5,6,7,8,9,10.
Le rôle pathogène des TNE dans la fibrose non contrôlée après un infarctus du myocarde et la formation d’anévrismes ventriculaires a été démontré par l’expansion de la fibrose périvasculaire 4,11. Le modèle d’infarctus du myocarde et l’isolement des neutrophiles de la moelle osseuse chez la souris sont tous deux bien établis. Les leucocytes polymorphonucléaires (PMN), un type de globule blanc abondant dans le sang humain, constituent une excellente source pour isoler les neutrophiles humains. Cette méthode élimine le besoin de prélever de la moelle osseuse, améliorant ainsi la sécurité et l’efficacité.
Les TNE jouent également un rôle dans la fibrillation auriculaire associée au remodelage cardiaque. Cependant, de gros animaux tels que des chiens et des porcs ont été utilisés pour modéliser la fibrillation auriculaire, car les souris n’ont pas d’oreillette suffisamment grande pour établir un cycle de ré-entrée ou le modèle AF, à moins que des canaux ioniques ou des voies de signalisation spécifiques ne soient renversés ou éliminés12. Bien qu’il soit possible d’induire la fibrillation auriculaire chez le rat et d’isoler les neutrophiles du sang périphérique du rat comme décrit précédemment, les chercheurs ont rencontré une limite selon laquelle seuls 2 x 105-5 x 105 neutrophiles pouvaient être isolés du sang périphérique (10 ml par rat). L’extraction d’un nombre suffisant de TNE à chaque point nécessitait environ 10 à 25 rats (5 x 106 neutrophiles au total), ce qui entraînait un processus long, coûteux et souvent à faible rendement13. À cet égard, Li He et ses collègues présentent une stratégie axée sur la moelle osseuse pour obtenir des TNE adéquates à partir de rats14. Dans leur article, ils fournissent une description complète de l’isolement des neutrophiles de la moelle osseuse du rat et comparent les capacités de sécrétion de TNE des neutrophiles périphériques et de la moelle osseuse du rat. Les deux méthodes décrites répondent à des objectifs expérimentaux distincts, les deux aboutissant à des quantités suffisantes de neutrophiles de moelle osseuse de rat tout en réduisant le nombre de rats nécessaires. La méthode d’isolement en deux étapes a démontré une purification supérieure des neutrophiles, tandis que la méthode en une étape s’est avérée efficace en termes de temps avec des niveaux de purification acceptables. De plus, les chercheurs ont comparé la NETosis et la formation de TNE entre les neutrophiles de la moelle osseuse du rat et leurs homologues périphériques, trouvant une puissance égale à celle de la PMN. Ces résultats contribuent de manière significative aux études de la fibrillation auriculaire liées aux neutrophiles et soulignent l’importance de sélectionner de manière flexible différentes sources d’isolement des neutrophiles chez divers animaux de laboratoire avec des distributions de neutrophiles différentes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A32790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A32744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A21125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rat myeloperoxidase</td>
			<td>Abcam, England</td>
			<td>ab134132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rat neutrophil elastase</td>
			<td>Abcam, England</td>
			<td>ab21595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo Image Cytometer</td>
			<td>Nexelom, USA</td>
			<td>200-BFFL-5C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10099141C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>C14175500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD, China</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>SL050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>biosharp, China</td>
			<td>BL539A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone, USA</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE, USA</td>
			<td>P8370-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>&#160;P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picogreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>P11496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat neutrophil isolation kit</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>P9200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>R1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media</td>
			<td>Hyclone, USA</td>
			<td>SH30809.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RWD Universal Animal Anesthesia Machine</td>
			<td>RWD, China</td>
			<td>R500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley (SD) rats</td>
			<td>Dashuo, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SytoxGreen</td>
			<td>Thermofisher, USA</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>T1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Biofroxx, German</td>
			<td>1139ML100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unique approach for isolating rat bone marrow neutrophils with comparable capacity

L’objectif principal de cette recherche était de développer une approche fiable et efficace pour isoler les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) de la moelle osseuse du rat. Cet effort est dû aux limites associées à la méthode traditionnelle d’extraction des TNE du sang périphérique, principalement en raison de la rareté des neutrophiles disponibles pour l’isolement. L’étude a révélé deux méthodologies distinctes pour obtenir des neutrophiles de rat à partir de la moelle osseuse : une procédure simplifiée en une étape qui a donné des niveaux de purification satisfaisants, et un processus en deux étapes plus long qui a montré une efficacité de purification améliorée. Il est important de noter que les deux techniques ont produit une quantité substantielle de neutrophiles viables, allant de 50 à 100 millions par rat. Cette efficacité reflétait les résultats obtenus en isolant les neutrophiles de sources humaines et murines. De manière significative, les neutrophiles dérivés de la moelle osseuse du rat présentaient des capacités comparables à sécréter des TNE par rapport aux neutrophiles obtenus à partir du sang périphérique. Cependant, la méthode basée sur la moelle osseuse a systématiquement produit des quantités nettement plus importantes de neutrophiles et de TNE. Cette approche a démontré le potentiel d’obtenir des quantités significativement plus importantes de ces composants cellulaires pour d’autres applications en aval. Notamment, ces TNE et neutrophiles isolés sont prometteurs pour une gamme d’applications, couvrant les domaines de l’inflammation, des infections et des maladies auto-immunes.

Neutrophils constitute a critical subset of leukocytes that play a pivotal role in the innate immune response. They are characterized by multilobed nuclei and granules containing various proteases and antimicrobial peptides1. Neutrophils primarily function through degranulation, phagocytosis, and the formation of NETs. The observation of NETs was first made by Takei et al. in 1996 during an experiment where neutrophils were stimulated with phorbol myristate acetate (PMA)2. Subsequently, the process of NET formation was coined &#34;NETosis&#34; by Brinkmann et al.3 in 2004. Their research further illuminated the crucial role of NETs in neutrophil-mediated antimicrobial responses. NETs are web-like structures composed of chromatin, histones, and antimicrobial proteins that are released from activated neutrophils in response to infectious and inflammatory stimuli. NETs can immobilize and kill invading pathogens by trapping them and exposing them to a high concentration of antimicrobial peptides and proteases1,3. Additionally, NETs contribute to the clearance of apoptotic cells and participate in inflammation resolution. Recent studies also indicate that an excessive formation of NETs or impaired NET degradation can lead to tissue damage, autoimmune disorders, thrombogenesis, and impaired revascularization4,5,6,7,8,9,10.
The pathogenic role of NETs in uncontrolled fibrosis following myocardial infarction and the formation of ventricular aneurysms has been demonstrated through the expansion of perivascular fibrosis4,11. The myocardial infarction model and the isolation of neutrophils from bone marrow in mice are both well-established. Polymorphonuclear (PMN) leukocytes, a type of white blood cell abundant in human blood, serve as an excellent source for isolating human neutrophils. This method eliminates the need to harvest bone marrow, thus enhancing safety and efficiency.
NETs also play a role in atrial fibrillation associated with cardiac remodeling. However, large animals such as dogs and pigs were utilized to model atrial fibrillation, as mice lack an atrium sizable enough to establish a re-entrant cycle or the AF model, unless specific ion channels or signaling pathways are knocked down or knocked out12. While it&#39;s possible to induce atrial fibrillation in rats and isolate neutrophils from rat peripheral blood as previously described, researchers encountered a limitation whereby only 2 x 105-5 x 105 neutrophils could be isolated from peripheral blood (10 mL per rat). Extracting sufficient NETs at each time point required approximately 10-25 rats (5 x 106 neutrophils in total), resulting in a time-consuming, expensive, and often low-yield process13. In this regard, Li He and colleagues present a bone marrow-oriented strategy to obtain adequate NETs from rats14. In their article, they provide a comprehensive description of isolating neutrophils from rat bone marrow and compare the NET secretion capabilities of rat peripheral and bone marrow neutrophils. The two methods outlined cater to distinct experimental goals, both resulting in sufficient quantities of rat bone marrow neutrophils while reducing the number of required rats. The two-step isolation method demonstrated superior neutrophil purification, while the one-step method proved time-efficient with acceptable purification levels. Furthermore, the researchers compared NETosis and NET formation between rat bone marrow neutrophils and their peripheral counterparts, finding equal potency with PMN. These findings significantly contribute to neutrophil-related studies of atrial fibrillation and underscore the importance of flexibly selecting different sources for neutrophil isolation in various experimental animals with differing neutrophil distributions.

Pleins feux sur l’auteur : Méthode optimisée pour isoler les neutrophiles et les TNE de rat de la moelle osseuse

Approche unique pour isoler les neutrophiles de la moelle osseuse du rat avec une capacité comparable

Le protocole décrit ici délimite deux méthodes distinctes, chacune caractérisée par une purification améliorée ou des étapes simplifiées. Les deux méthodes ont donné environ 0,5 x 108-1 x 108 neutrophiles par rat. L’analyse par cytométrie en flux, utilisant le kit de détection de l’apoptose annexine V-FITC/PI, a montré une viabilité cellulaire supérieure à 90 %, comparable à celle de la souris et de l’homme (Figure 1). Alors que la contamination ...

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Cette recherche décrit deux techniques pour isoler les pièges extracellulaires neutrophiles abondants (TNE) de la moelle osseuse du rat. Une méthode combine un kit d’isolement des neutrophiles commercial avec une centrifugation à gradient de densité, tandis que l’autre utilise uniquement la centrifugation à gradient de densité. Les deux approches produisent des TNE fonctionnelles surpassant celles des neutrophiles du sang périphérique.

The primary aim of this research was to develop a reliable and efficient approach for isolating neutrophil extracellular traps (NETs) from rat bone ...

Nous avons mis au point une méthode d’isolement des neutrophiles de rat et d’extraction ultérieure des TNE. Cette méthode permet d’optimiser l’accessibilité pour la réalisation d’expériences liées aux TNE chez le rat et dans des lignées cellulaires dérivées de rats. Dans notre étude, nous avons effectué une comparaison entre les neutrophiles isolés du sang périphérique et des fils de moelle osseuse.Nos résultats mettent en évidence la supériorité des neutrophiles dérivés de la moelle osseuse, montrant un avantage numérique substantiel dans le nombre de neutrophiles isolés ainsi que leur capacité de synchronisation. Notre méthode basée sur la moelle osseuse pour isoler les neutrophiles et les TNE de rat comble une lacune de la recherche en optimisant les techniques d’isolement pour ces types de cellules. Contrairement aux méthodes précédentes qui utilisaient principalement le sang périphérique, notre protocole cible la moelle osseuse, augmentant les neutrophiles à grands rendements et offrant un modèle de rat plus précis pour étudier les neutrophiles et la biologie des rats.

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Research

JoVE Journal

Biology

Unique Approach for Isolating Rat Bone Marrow Neutrophils with Comparable Capacity

1.3K vues.  Sichuan University. Nous avons mis au point une méthode d’isolement des neutrophiles de rat et d’extraction ultérieure des TNE. Cette méthode permet d’optimiser l’accessibilité pour la réalisation d’expériences liées aux TNE chez le rat et dans des lignées cellulaires dérivées de rats. Dans notre étude, nous avons effectué une comparaison entre les neutrophiles isolés du sang périphérique et des fils de moelle osseuse.Nos résultats mettent en évidence la supériorité des neutro...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Méthode optimisée pour isoler les neutrophiles et les TNE de rat de la moelle osseuse

The primary aim of this research was to develop a reliable and efficient approach for isolating neutrophil extracellular traps (NETs) from rat bone marrow. This effort arose due to limitations associated with the traditional method of extracting NETs from peripheral blood, mainly due to the scarcity of available neutrophils for isolation. The study revealed two distinct methodologies for obtaining rat neutrophils from bone marrow: a streamlined one-step procedure that yielded satisfactory purification levels, and a more time-intensive two-step process that exhibited enhanced purification efficiency. Importantly, both techniques yielded a substantial quantity of viable neutrophils, ranging between 50 to 100 million per rat. This efficiency mirrored the results obtained from isolating neutrophils from both human and murine sources. Significantly, neutrophils derived from rat bone marrow exhibited comparable abilities to secrete NETs when compared with neutrophils obtained from peripheral blood. However, the bone marrow-based method consistently produced notably larger quantities of both neutrophils and NETs. This approach demonstrated the potential to obtain significantly greater amounts of these cellular components for further downstream applications. Notably, these isolated NETs and neutrophils hold promise for a range of applications, spanning the realms of inflammation, infection, and autoimmune diseases.

This research outlines two techniques for isolating abundant neutrophil extracellular traps (NETs) from rat bone marrow. One method combines a commercial neutrophil isolation kit with density gradient centrifugation, while the other employs only density gradient centrifugation. Both approaches yield functional NETs surpassing those from peripheral blood neutrophils.