في هذا البروتوكول ، يتم استخراج خلايا البلاعم أحادية الخلية العظمية عن طريق طريقة الالتزام الثانوية. يمكن لخلايا البلاعم أحادية الخلايا في نخاع العظم أن تتمايز بنجاح إلى خلايا عظمية ، مما يوفر نموذجا مستقرا للخلايا لدراسة الخلايا العظمية في المختبر. هذه الطريقة مناسبة لعينات نخاع العظم الصغيرة ويمكنها استخراج خلايا البلاعم أحادية الخلية العظمية من نخاع العظم ببساطة وسرعة دون الحاجة إلى معدات مختبرية عالية التقنية.
قد تكون زيادة الخلايا الآكلة للعظام هي التسبب المحتمل لهشاشة العظام. خلايا البلاعم أحادية الخلايا في نخاع العظم لها قيمة بحثية معينة كخلايا سلائف عظمية البلاستيد. للبدء ، اغمر الفئران الرحيمة في الكحول بنسبة 75٪ لمدة 10 دقائق للتطهير.
بعد إزالة جميع أطراف الفئران بعناية باستخدام المقص والملقط ، قم بالشفط باستخدام PBS باستخدام ماصة واغسل الدم الملتصق بالأطراف. ثم في اثنين من ملليلتر من 10٪ FBS DMEM في أنبوب خمسة ملليلتر. بعد نقل عظام الأطراف إلى أنبوب خمسة ملليلترات ، استخدم المقص لقطع عظام الأطراف في الأنبوب إلى قطع صغيرة وخلط المتجانسة لإعادة تعليق خلايا نخاع العظم في وسط الزرع.
قف لمدة خمس دقائق حتى تستقر شظايا الأنسجة في قاع الأنبوب. بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من 10٪ FBS DMEM إلى طبق ثقافة 100 ملم ، ثم انقل supernatant إلى طبق الثقافة. احتضان في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة تقريبا.
بعد وقت الحضانة هذا ، ستلتصق غالبية الخلايا الجذعية الوسيطة بجدار طبق المزرعة وتنمو ببطء ، في حين أن معظم خلايا البلاعم أحادية الخلايا العظمية ستظل معلقة في وسط الزرع. انقل تعليق الخلية في طبق الاستزراع 100 ملم إلى قارورة جديدة مساحتها 25 سم مربع واستمر في زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة إضافية. بعد إزالة الوسط القديم بعناية ، استبدله بوسط جديد بعد أن تلتصق خلايا البلاعم أحادية الخلايا العظمية بجدار القارورة.
أظهر قياس التدفق الخلوي أن النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن CD11b و c ، وهي علامة جزيئية على سطح خلايا سلالة البلاعم أحادية الخلية كانت حوالي 37.94٪ مع الانتشار المستمر للخلايا ، أصبحت غالبية الخلايا أكبر ضمن شكل غير منتظم ونمت لتصبح قرصا لاصقا شعاعيا. أظهرت نتائج وصمة عار TRAP أنه بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، زاد عدد الحبيبات الحمراء الأرجوانية داخل الخلايا بشكل كبير في الخلايا المستحثة بمنشط مستقبلات العامل النووي kappa B ligand وعامل تحفيز مستعمرة البلاعم. أظهر تحليل اللطخة الغربية أن مستويات التعبير عن البروتينات المحددة للعظم TRAP والكاثيبسين K قد زادت بشكل كبير في الخلايا المعالجة مقارنة بالمجموعة الضابطة.
أهم شيء في هذا الإجراء هو الوقت المناسب لجمع الخلايا الملتصقة الثانوية في غضون 24 إلى 48 ساعة من الثقافة الأولية ، تبدأ خلايا البلاعم أحادية الخلايا في نخاع العظم في الالتصاق تماما. يمكن تحفيز الخلايا أحادية الخلية العظمية المعزولة بهذه الطريقة في الخلايا العظمية في المختبر ، مما يوفر نموذجا مستقرا للخلايا لدراسة هشاشة العظام.
