تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة تشجيانغ (LY22H020005) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81873466).

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على مواضيع حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) بجامعة ونتشو الطبية (XMSQ2021-0057 ، 19 يوليو 2021). يتم سرد جميع الكواشف والمواد الاستهلاكية في جدول المواد.
1. إعداد وسط الثقافة
<ol><li>10x M199 وسط الاستزراع: قم بإذابة مسحوق M199 إلى تركيز 10x مع 90 مل من الماء منزوع الأيونات وأضف 10 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، ثم مرر عبر مرشح 0.22 ميكرومتر. قم بتخزين الوسط في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.</li>
	<li>وسط زراعة بطانة كاملة: أضف 50 مل من FBS ، و 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين ، و 5 مل من مكمل نمو الخلايا البطانية إلى 460 مل من وسط الخلايا البطانية (ECM). قم بتخزين الوسط في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.</li>
</ol>2. إعداد خلايا الأوعية الدموية
<ol><li>زراعة 1 × 105 خلايا وعائية (الخلايا السلفية البطانية الأوليةالمستزرعة 14 ، الخلايا البطانية ، أو خطوط الخلايا البطانية) مع 8 مل من وسط زراعة البطانة الكامل في طبق زراعة الأنسجة 100 مم عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 إلى 70٪ التقاء.</li>
	<li>قم بإزالة وسط الاستزراع وشطف الطبق 2x بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) لإزالة الخلايا غير المرتبطة والحطام. إزالة PBS وإضافة 3 مل من 0.25٪ تربسين يحتوي على 2.21 مليمتر EDTA ، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.</li>
	<li>قم بتحييد التربسين ب 7 مل من وسط الثقافة البطانية الكامل ، واشطف الخلايا برفق من طبق الاستزراع. تأكيد انفصال الخلايا تحت المجهر الضوئي (تكبير 40x).</li>
	<li>جمع تعليق الخلية في أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 10 دقائق. إزالة طاف وإعادة تعليق الخلايا مع 5 مل من وسط الثقافة البطانية الكامل.</li>
	<li>عد الخلايا باستخدام مقياس الدم وانقل المعلق الذي يحتوي على 2 × 106 خلايا إلى أنبوب معقم سعة 1.5 مل. يحتوي كل قابس على 1.5 × 106 خلايا ، وتستخدم خلايا إضافية بنسبة 25٪ في حالة النفايات. تتضمن كل مجموعة 3 مقابس على الأقل. ملاحظة: بعد التجارب وجد أن 1.5 × 106 خلايا في 300 ميكرولتر من هلام المصفوفة أدت إلى التطور السليم لتكوين الأوعية وبالتالي تم اختيارها للتجريب.</li>
	<li>تعليق خلية الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق لخلايا الحبيبات ، ثم إزالة المادة الطافية.</li>
</ol>3. إعداد هلام ماتريكس
<ol><li>قم بتبريد أنابيب معقمة سعة 1.5 مل تحتوي على حبيبات خلوية في حمام مائي بدرجة حرارة 4 درجات مئوية. قم بتبريد محاقن الأنسولين 30 جم سعة 1 مل في ثلاجة 4 درجات مئوية.</li>
	<li>قم بإذابة جل المصفوفة تماما في حمام مائي بدرجة حرارة 4 درجات مئوية. لا تخلط أو دوامة. قم بتبريد 10x M199 مسبقا واختبر الكاشف / الدواء محل الاهتمام في حمام مائي بدرجة حرارة 4 درجات مئوية.</li>
	<li>امزج جل المصفوفة المبرد مسبقا مع 10x M199 الذي يحتوي على 10٪ FBS والكاشف المراد اختباره بنسبة حجم 8.8: 1: 0.2 للحصول على هلام مصفوفة وخليط M199 يحتوي على 1٪ FBS والكاشف.</li>
	<li>أعد تعليق الخلايا ب 400 ميكرولتر من خليط هلام المصفوفة ، واخلطها برفق لتجنب تكوين فقاعات. احتفظ بالأنبوب على الثلج حتى يتم تحضير الفئران للحقن. احتفظ بخليط هلام المصفوفة على الثلج طوال الوقت لتجنب التخثر. ملاحظة: هنا ، تم استخدام 300 ميكرولتر من خليط هلام المصفوفة الذي يحتوي على 1.5 × 106 خلايا لتشكيل سدادة هلام. تحضير 25٪ جل إضافي وفقا ل 25٪ خلايا إضافية في الخطوة 2.</li>
</ol>4. إعداد الماوس
<ol><li>تخدير ذكر الفأر Nu / Nu البالغ من العمر 6-8 أسابيع (18-25 جم) في غرفة جهاز تخدير باستخدام الأيزوفلوران (3٪ إيزوفلوران في أكسجين 100٪ بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة). بعد التخدير الناجح ، الذي يؤكده عدم وجود منعكس تصحيح ومنعكس قرصة إصبع القدم ، حرك الماوس خارج الغرفة ، وحرك الماوس خارج الغرفة وضع قناع تخدير على الماوس وقم بتغيير تركيز الأيزوفلوران إلى 1.5٪ في الأكسجين بنسبة 100٪ بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة. ملاحظة: توفير الدعم الحراري للحيوان باستخدام وسادة التدفئة طوال العملية.</li>
	<li>استخدم مرهم الطبيب البيطري على العينين لمنع الجفاف. الشريط أطراف الفئران على لوحة العمليات في وضع الانبطاح.</li>
</ol>5. حقن خليط هلام ماتريكس
<ol><li>قم بتحميل 300 ميكرولتر من خليط هلام المصفوفة في حقنة أنسولين سعة 1 مل بإبرة 30 جرام. تجنب تكوين الفقاعة. قم بتحميل هلام المصفوفة بسرعة (في غضون 2 دقيقة) لتجنب التصلب خلال هذا الوقت. ضع حقنة الأنسولين المحملة بهلام ماتريكس على الثلج على الفور.</li>
	<li>تنظيف الجلد على ظهر الفئران باستخدام منصات الكحول 75 ٪. حقن تحت الجلد 300 ميكرولتر من خليط هلام المصفوفة في جانب واحد من الجزء الخلفي من الفئران.</li>
	<li>قم بإزالة الإبرة برفق من موقع الحقن لمنع تسرب خليط هلام المصفوفة. تحقق من وجود سنام صغير في موقع الحقن (الشكل 1).</li>
	<li>ضع الماوس على وسادة التسخين لمدة 2 دقيقة للسماح لخليط هلام المصفوفة بالتخثر وتشكيل القابس.</li>
	<li>كرر الخطوات 5.2. إلى 5.4. لإنشاء قابس على الجانب الآخر من الجزء الخلفي من الماوس. ضع علامة على حواف الحدبات باستخدام قلم تمييز.</li>
	<li>راقب الفأر حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. ضع الماوس في قفص منفصل حتى يتم استرداده بالكامل. إيواء الفئران في مختبر التجارب من فئة SPF في 22 ± 2 درجة مئوية مع دورة ضوء / ظلام لمدة 12 ساعة لمدة 7 أيام.</li>
</ol>6. حقن ديكستران-FITC من خلال الوريد الذيل
<ol><li>بعد 7 أيام من حقن هلام المصفوفة، أعد تعليق 0.5 ملغ من ديكستران-فيتسي مع 500 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج (ddH2O) ثم دوامة عنيفة للحصول على محلول ديكستران-FITC عند التركيز النهائي 1 ميكروغرام/ميكرولتر. ملاحظة: استخدم ديكستران-FITC بوزن جزيئي ~ 150 كيلو دالتون لمقايسة تكوين الأوعية ، واستخدم ديكستران-FITC بوزن جزيئي ~ 4 كيلو دالتون لمقايسة نفاذية الأوعية الدموية.</li>
	<li>قم بتحميل 50 ميكرولتر من محلول ديكستران-FITC في محاقن 29G.</li>
	<li>إصلاح الماوس على أداة حقن الوريد الذيل. نظف الذيل بكرة قطنية كحولية بنسبة 75٪ وحقن 50 ميكرولتر من ديكستران-FITC برفق عبر وريد الذيل.</li>
	<li>ضغط موقع الحقن بقطعة قطن لمدة 1 دقيقة لوقف النزيف ، ثم أعد الفئران إلى القفص لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>كرر الخطوات 6.3. و 6.4. حتى تتلقى جميع الفئران حقن ديكستران-FITC.</li>
</ol>7. مجموعة المكونات هلام ماتريكس
<ol><li>حقن 1٪ من صوديوم بنتوباربيتال داخل الصفاق في برنامج تلفزيوني (200 ملغم / كغم من وزن الجسم) والقتل الرحيم للفئران بإجراء معتمد من IACUC.</li>
	<li>قطع الجلد على طول الحدود المحددة للقابس باستخدام مقص جراحي وإزالة الجلد فوق المكونات هلام المصفوفة.</li>
	<li>اجمع القابس واشطفه في دورق صغير مع 1x PBS لغسل الدم الزائد (الشكل 2 أ). يمكن أن يحدد لون القابس تقريبا درجة وفرة الدم ومحتوى الأوعية الجديدة (الشكل 3 أ).</li>
</ol>8. تضمين مصفوفة هلام المكونات وإعداد القسم
<ol><li>قم بتغطية زر علبة تضمين الأنسجة بحوالي 0.5 مل من جل تضمين الأنسجة ، ثم ضع سدادة هلام المصفوفة على الفور على جل تضمين الأنسجة في الاتجاه المطلوب كما هو موضح في الشكل 2 ب. بعد ذلك ، قم بتضمين القابس مع جل إضافي لتضمين الأنسجة.</li>
	<li>ضع الكاسيتات في فريزر -80 درجة مئوية لمدة 12 ساعة حتى تتصلب.</li>
	<li>لإعداد المقطع السميك ، أخرج كتلة القابس الصلبة واقطع أقساما بسمك 12 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم التجميد وفقا للتعليمات ، وقم بتركيبها على شرائح المجهر.</li>
	<li>شريحة 5-10 أقسام من كل كتلة القابس.</li>
</ol>9. القياس الكمي لتكوين الأوعية (الشكل 3)
<ol><li>احصل على صور مضان من 5 حقول مستقلة للقسم باستخدام مجهر مضان مقلوب بطول موجي 488 نانومتر تحت تكبير 10x.</li>
	<li>افتح ملف الصورة باستخدام برنامج Image J (https://imagej.en.softonic.com/) وانقر فوق الزر تحليل تكوين الأوعية . ثم ، انقر فوق تحليل تباين المرحلة HUVEC زر ، والتبديل إلى جدول نتائج Stat لجمع المعلومات. قم بقياس جميع الصور الفلورية ال 5 المكتسبة لكل قسم.</li>
	<li>تحليل الطول الإجمالي للأوعية الجديدة من مجموعات مختلفة لتقييم إحصائيا الفرق في تولد الأوعية بين هذه المجموعات. ملاحظة: يشير إجمالي طول الأجزاء الرئيسية إلى الطول الإجمالي للسفن الجديدة. يطلق على الكاشف الذي يزيد من طول الأوعية الجديدة اسم pro-angiogenic ، في حين أن الكاشف الذي يقلل من طول الأوعية الجديدة هو مضاد للأوعية الوعائية.</li>
</ol>10. القياس الكمي لنفاذية الأوعية الدموية (الشكل 4)
<ol><li>احصل على صور مضان من 5 حقول مستقلة للقسم باستخدام مجهر مضان مقلوب بطول موجي 488 نانومتر تحت تكبير 20x.</li>
	<li>افتح ملف الصورة باستخدام برنامج Image J. انقر فوق الزر Freehand Selection وقم بوضع دائرة حول منطقة التسرب ، ثم انقر فوق قائمة Analyze وحدد خيار القياس للحصول على معلومات المنطقة الخاصة بمنطقة التسرب. استخدم نسبة منطقة التسرب ومنطقة الصورة للإشارة إلى نفاذية الأوعية الدموية.</li>
	<li>تحليل نسبة مساحة التسرب ومساحة الصورة من مجموعات مختلفة لتقييم إحصائيا الفرق في نفاذية الأوعية الدموية بين هذه المجموعات.</li>
</ol>

تبسيط دراسات تكوين الأوعية باستخدام مقايسة سدادة هلام مصفوفة معدلة

<ol>
	<li>Bikfalvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+and+conceptual+developments+in+vascular+biology+and+angiogenesis+research:+a+personal+view.">History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view.</a> Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+mechanisms+of+vessel+normalization+for+cancer+and+other+angiogenic+diseases.">Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases.</a> Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).</li><li>De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumour+angiogenesis.">Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis.</a> Nature reviews Cancer. 17 (8), 457-474 (2017).</li><li>Griffioen, A., Molema, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis:+potentials+for+pharmacologic+intervention+in+the+treatment+of+cancer,+cardiovascular+diseases,+and+chronic+inflammation.">Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation.</a> Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).</li><li>Viallard, C., Larriv&#233;e, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis+and+vascular+normalization:+alternative+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets.</a> Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).</li><li>Craig, M., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETS+transcription+factors+in+embryonic+vascular+development.">ETS transcription factors in embryonic vascular development.</a> Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).</li><li>Losordo, D., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+angiogenesis+and+vasculogenesis+for+ischemic+disease.+Part+I:+angiogenic+cytokines.">Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines.</a> Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-angiogenesis-new+concept+for+therapy+of+solid+tumors.">Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors.</a> Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer,+vascular,+rheumatoid+and+other+disease.">Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease.</a> Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opinion+-+Angiogenesis:+an+organizing+principle+for+drug+discovery.">Opinion - Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).</li><li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1&#946;+augments+the+angiogenesis+of+endothelial+progenitor+cells+in+an+NF-&#954;B/CXCR7-dependent+manner.">Interleukin-1&#946; augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-&#954;B/CXCR7-dependent manner.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).</li><li>Dai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+transcriptional+upregulation+of+IDH2+to+tune+mitochondrial+dynamics+and+rescue+angiogenic+function+of+diabetic+EPCs.">Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs.</a> Redox Biology. 56, 102449 (2022).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liraglutide+Improves+the+Angiogenic+Capability+of+EPC+and+Promotes+Ischemic+Angiogenesis+in+Mice+under+Diabetic+Conditions+through+an+Nrf2-Dependent+Mechanism.">Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism.</a> Cells. 11 (23), 3821 (2022).</li><li>Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three+dimensional+collagen+matrix+models+of+endothelial+lumen+formation+during+vasculogenesis+and+angiogenesis.">In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis.</a> Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).</li><li>Malinda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+matrigel+migration+and+angiogenesis+assay.">In vivo matrigel migration and angiogenesis assay.</a> Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays.">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li><li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF21+promotes+ischaemic+angiogenesis+and+endothelial+progenitor+cells+function+under+diabetic+conditions+in+an+AMPK/NAD+-dependent+manner.">FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).</li><li>Gavard, J., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+controls+endothelial-cell+permeability+by+promoting+the+beta-arrestin-dependent+endocytosis+of+VE-cadherin.">VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin.</a> Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).</li><li>Birdsey, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+transcription+factor+ERG+promotes+vascular+stability+and+growth+through+Wnt/&#946;-catenin+signaling.">The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/&#946;-catenin signaling.</a> Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+CXCR4+antagonist+enhances+angiogenesis+via+modifying+the+ischaemic+tissue+environment.">A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).</li></ol>

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

نقدم طريقة موثوقة ومريحة للتقييم الكمي لتكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي دون تلطيخ. في هذا البروتوكول ، تم خلط الخلايا الوعائية مع هلام المصفوفة في وجود كواشف مؤيدة لتولد الأوعية أو مضادة لتولد الأوعية ، ثم حقنها تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران Nu / Nu لتشكيل سدادة هلامية (<strong cla...

يلعب تكوين الأوعية ، عملية تكوين الأوعية الجديدة من الأوعية الموجودة مسبقا ، دورا مهما في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية ، مثل التطور الجنيني ، والتئام الجروح ، وتصلب الشرايين ، وتطور الورم ، وما إلى ذلك 1،2،3،4،5. تتضمن هذه العملية الديناميكية عدة خطوات ، بما في ذلك تدهور المصفوفة ، وتكاثر الخلايا الوعائية ، والهجرة والتنظيم الذاتي لتشكيل هياكل أنبوبية وتثبيت الأوعية الجديدة6. ثبت أن تعزيز تكوين الأوعية أمر بالغ الأهمية في علاج احتشاء عضلة القلب والسكتة الدماغية وأنواع أخرى من الأمراض الإقفارية7 بينما يعتبر تثبيط تكوين الأوعية استراتيجية واعدة في علاج السرطانات8 وأمراض الروماتويد9. يعتبر تكوين الأوعية مبدأ تنظيميا لاكتشاف الأدوية10. وبالتالي ، فإن بناء طريقة موثوقة ومريحة لتقييم مدى تكوين الأوعية أمر بالغ الأهمية للبحث الميكانيكي أو اكتشاف الأدوية في الأمراض التي تعتمد على تولد الأوعية.
تم تطوير العديد من النماذج في المختبر وفي الجسم الحي لتقييم تولد الأوعية11. من بين هذه النماذج ، لا يمكن للنماذج ثنائية الأبعاد (2-D) ، مثل فحص تشكيل أنبوب هلامالمصفوفة 12 ، تشكيل هياكل أنبوبية وظيفية. يمكن للنماذج الحيوانية ، مثل نموذج نقص تروية الطرف الخلفي13،14 ، إعادة إنتاج عملية تكوين الأوعية ولكنها معقدة وتتطلب نظام تصوير تدفق الدم بالليزر البقعي. توفر النماذج ثلاثية الأبعاد لتشكل الأوعية الدموية ، مثل مقايسة سدادة هلام المصفوفة ، منصة بسيطة يمكنها تقليد عملية تكوين الأوعية في الجسم الحي15 ، لكن اكتشاف تكوين الأوعية يتطلب الكيمياء المناعية أو تلطيخ التألق المناعي16،17،18 ، وهي متغيرة وسيئة التصور.
هنا ، نصف بروتوكولا لمقايسة سدادة هلام المصفوفة المعدلة حيث تم خلط خلايا الأوعية الدموية مع هلام المصفوفة وحقنها تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران لتشكيل سدادة. في السدادة ، تحتاج الخلايا الوعائية إلى تحلل المصفوفة ، والتكاثر ، والهجرة ، والتنظيم الذاتي لتشكيل أوعية وظيفية في النهاية مع تدفق الدم في البيئة الداخلية. بعد ذلك ، يتم حقن ديكستران المسمى بالفلورسنت عبر الوريد الخلفي ، ليتدفق عبر القابس ، ويتم تصور الملصق للإشارة إلى الأوعية الجديدة. يمكن تقييم محتوى تولد الأوعية كميا من خلال طول الأوعية. يمكن أن تشكل هذه الطريقة أوعية وظيفية لا يمكن إنتاجها في نماذج تولد الأوعية ثنائية الأبعاد12 ، ولا تحتاج إلى عملية صبغ معقدة كما هو الحال في مقايسة سدادة هلام المصفوفةالعادية 11. كما أنه لا يتطلب أدوات محددة باهظة الثمن مثل نظام تصوير تدفق الدم بالليزر في نموذج نقص تروية الأطراف الخلفية13،14،19. هذه الطريقة متعددة الاستخدامات ومنخفضة التكلفة وقابلة للقياس الكمي وسهلة الأداء ، ويمكن استخدامها لتحديد القدرة المؤيدة أو المضادة لتولد الأوعية الدموية للأدوية أو استخدامها في الأبحاث الميكانيكية المشاركة في تكوين الأوعية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>188105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia System</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R640-S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoslicer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CryoStar NX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans-FITC-150kDa</td>
			<td>WEIHUA BIO</td>
			<td>WH007N07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans-FITC-4kDa</td>
			<td>WEIHUA BIO</td>
			<td>WH007N0705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Cassettes</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>80203-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Medium</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>35809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Supplements</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10100147C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor 1</td>
			<td>AtaGenix</td>
			<td>9043p-082318-A01</td>
			<td>FGF1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>Boruida</td>
			<td>30-50-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>300841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory&#160;Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>BSA124S-CW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td>Matrix gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31100-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound</td>
			<td>SUKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue embedding gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitate Acid</td>
			<td>KunChuang</td>
			<td>KC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Liquid</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments</td>
			<td>RWD</td>
			<td>RWD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tail Vein Injection Instrument</td>
			<td>KEW BASIS</td>
			<td>KW-XXY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T1320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Temperature Freezer</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>U410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Endothelial Growth Factor</td>
			<td>CHAMOT</td>
			<td>CM058-5HP</td>
			<td>VEGF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified in vivo matrix gel plug assay for angiogenesis studies

تم تطوير العديد من النماذج للتحقيق في تكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي. ومع ذلك ، فإن معظم هذه النماذج معقدة ومكلفة ، وتتطلب معدات متخصصة ، أو يصعب تنفيذها للتحليل الكمي اللاحق. نقدم هنا مقايسة سدادة هلام مصفوفة معدلة لتقييم تكوين الأوعية في الجسم الحي. في هذا البروتوكول ، تم خلط الخلايا الوعائية مع هلام المصفوفة في وجود أو عدم وجود كواشف مؤيدة لتولد الأوعية أو مضادة لتولد الأوعية ، ثم حقنها تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران المتلقية. بعد 7 أيام ، يتم حقن محلول ملحي عازل للفوسفات يحتوي على ديكستران-FITC عبر الوريد الذيلي ويتم تدويره في أوعية لمدة 30 دقيقة. يتم جمع سدادات هلام المصفوفة ودمجها مع هلام تضمين الأنسجة ، ثم يتم قطع أقسام 12 ميكرومتر للكشف عن التألق دون تلطيخ. في هذا الفحص ، يمكن استخدام dextran-FITC ذو الوزن الجزيئي العالي (~ 150000 Da) للإشارة إلى الأوعية الوظيفية للكشف عن طولها ، بينما يمكن استخدام dextran-FITC ذات الوزن الجزيئي المنخفض (~ 4400 Da) للإشارة إلى نفاذية الأوعية الجديدة. في الختام ، يمكن أن يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة ومريحة للدراسة الكمية لتكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي.

Angiogenesis, the process of formation of neo-vessels from pre-existing vessels, plays a critical role in many physiological and pathological processes, such as embryonic development, wound healing, atherosclerosis, tumor development, etc.1,2,3,4,5. This dynamic process involves several steps, including the degradation of the matrix, vascular cell proliferation, migration and self-organization to form tubular structures and the stabilization of the neo-vessels6. Promoting angiogenesis has been demonstrated to be critical in the treatment of myocardial infarction, stroke and other kinds of ischemic diseases7 while inhibiting angiogenesis has been considered a promising strategy in the treatment of cancers8 and rheumatoid diseases9. Angiogenesis has been considered an organizing principle for drug discovery10. Thus, the construction of a reliable and convenient method to assess the extent of angiogenesis is critical for mechanical research or drug discovery in angiogenesis-dependent diseases.
Several in vitro and in vivo models have been developed to evaluate angiogenesis11. Among these, two-dimensional (2-D) models, like matrix gel tube formation assay12, cannot form functional tubular structures. The animal models, such as the hind limb ischemia model13,14, can reproduce the angiogenesis process but are complex and require a laser speckle blood flow imaging system. 3D models of vascular morphogenesis, like matrix gel plug assay, provide a simple platform that can mimic the process of angiogenesis in vivo15, but the detection of angiogenesis requires immunohistochemistry or immunofluorescence staining16,17,18, which are variable and poorly visualized.
Here, we describe a protocol for a modified matrix gel plug assay where vascular cells were mixed with matrix gel and subcutaneously injected into the back of mice to form a plug. In the plug, vascular cells need to degrade the matrix, proliferate, migrate, and self-organize to finally form functional vessels with blood flow in the internal environment. Thereafter, fluorescent-labeled dextran is injected via the tail vein, to flow through the plug, and the label is visualized to indicate neo-vessels. The content of angiogenesis can be quantitatively evaluated by the length of the vessels. This method can form functional vessels that cannot be produced in 2-D angiogenesis models12, and does not need complex stain process as in ordinary matrix gel plug assay11. It also does not require expensive specific instruments like laser speckle blood flow imaging system in hind limb ischemia model13,14,19. This method is versatile, low-cost, quantifiable, and easy to perform, and can be used to determine the pro- or anti-angiogenic capability of drugs or be used in mechanical research involved in angiogenesis.

تسليط الضوء على المؤلف: التحقيق في تكوين الأوعية ونفاذية الأوعية من خلال مقايسة سدادة هلام مصفوفة معدلة

تعديل في الجسم الحي مصفوفة هلام المكونات مقايسة لدراسات تولد الأوعية

Our research deals with angiogenesis, the process of formation of new vessels from preexisting vessels. It plays a critical role in many physiological and pathological processes, such as embryonic development or curing atherosclerosis, tumor development, etc. The construction of a reliable model to evaluate the extent of angiogenesis is critical for myocardial research or the discovery of medicines for angiogenesis-depend diseases.However, most of the existing models are complex, expensive, and require specialized equipment. Here, we present a modified matrix gel plug assay that can be used to investigate angiogenesis and vessel permeability without staining in a simple, more intuitive, as well as efficient manner.

الشكل 1 هو المخطط الانسيابي الذي يوضح كيفية تحضير خليط هلام المصفوفة والخلايا الوعائية ووسط الاستزراع والكاشف. ثم تم حقن الخليط تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران Nu / Nu وتسخينه باستخدام وسادة تسخين لتسريع تجلط الدم لتشكيل سدادة هلامية في النهاية.
<strong class="xf...

Watch this Scientific Journal Video about Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies at JoVE.com

يمكن للطريقة المعروضة هنا تقييم تأثير الكواشف على تكوين الأوعية الدموية أو نفاذية الأوعية الدموية في الجسم الحي دون تلطيخ. تستخدم الطريقة حقن ديكستران-FITC عبر الوريد الخلفي لتصور الأوعية الجديدة أو تسرب الأوعية الدموية.

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized ...

يتناول بحثنا تكوين الأوعية الدموية ، وهي عملية تكوين أوعية جديدة من الأوعية الموجودة مسبقا. يلعب دورا مهما في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية ، مثل التطور الجنيني أو علاج تصلب الشرايين ، وتطور الورم ، وما إلى ذلك. يعد بناء نموذج موثوق به لتقييم مدى تكوين الأوعية أمرا بالغ الأهمية لأبحاث عضلة القلب أو اكتشاف أدوية للأمراض التي تعتمد على تكوين الأوعية.ومع ذلك ، فإن معظم النماذج الحالية معقدة ومكلفة وتتطلب معدات متخصصة. هنا ، نقدم مقايسة سدادة هلام مصفوفة معدلة يمكن استخدامها للتحقيق في تكوين الأوعية ونفاذية الأوعية دون تلطيخ بطريقة بسيطة وأكثر سهولة وكفاءة.

modified-in-vivo-matrix-gel-plug-assay-for-angiogenesis-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies

555 Views.  Pingyang Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University. يتناول بحثنا تكوين الأوعية الدموية ، وهي عملية تكوين أوعية جديدة من الأوعية الموجودة مسبقا. يلعب دورا مهما في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية ، مثل التطور الجنيني أو علاج تصلب الشرايين ، وتطور الورم ، وما إلى ذلك. يعد بناء نموذج موثوق به لتقييم مدى تكوين الأوعية أم?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: التحقيق في تكوين الأوعية ونفاذية الأوعية من خلال مقايسة سدادة هلام مصفوفة معدلة

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized equipment, or are hard to perform for subsequent quantitative analysis. Here we present a modified matrix gel plug assay to evaluate angiogenesis in vivo. In this protocol, vascular cells were mixed with matrix gel in the presence or absence of pro-angiogenic or anti-angiogenic reagents, and then subcutaneously injected into the back of recipient mice. After 7 days, phosphate buffer saline containing dextran-FITC is injected via the tail vein and circulated in vessels for 30 min. Matrix gel plugs are collected and embedded with tissue embedding gel, then 12 &#181;m sections are cut for fluorescence detection without staining. In this assay, dextran-FITC with high molecular weight (~150,000 Da) can be used to indicate functional vessels for detecting their length, while dextran-FITC with low molecular weight (~4,400 Da) can be used to indicate the permeability of neo-vessels. In conclusion, this protocol can provide a reliable and convenient method for the quantitative study of angiogenesis in vivo.

The method presented here can evaluate the effect of reagents on angiogenesis or vascular permeability in vivo without staining. The method uses dextran-FITC injection via the tail vein to visualize neo-vessels or vascular leakage.

Preparing Vascular Cells for In Vivo Matrix Gel Plug Assay

Begin by preparing the complete endothelial culture medium using 460 milliliters of endothelial cell medium, and adding into it, 50 milliliters of FBS, five milliliters of penicillin streptomycin, and five milliliters of endothelial cell growth supplement. The prepared media can be stored at four degrees celsius for a month. Next, in a 100 millimeter tissue culture dish containing 0.1 million vascular cells at eight milliliters of the prepared complete endothelial culture medium and culture the cells at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide until 70%co-fluency is achieved.Then, remove the culture medium from the dish and rinse the cells twice with PBS to eliminate unattached cells and debris. After removing the PBS, add three milliliters of 0.25%trypsin, containing 2.21 millimolar EDTA to the cells and incubate the dish at 37 degrees Celsius for one minute. Verify cell detachment under a light microscope at 40 times magnification.Neutralize the trypsin with seven milliliters of complete endothelial culture medium and gently rinse the cells off the culture dish. Centrifuge the cell suspension after collecting it in a 15 milliliter tube at 400G for 10 minutes. Re-suspend the cells in five milliliters of complete endothelial culture medium after removing the supernatant, then count the cells using a hemo-cytometer, and transfer a calculated volume of suspension containing 2 million cells to a sterile 1.5 milliliter tube.Pellet the cells by centrifuging the suspension at 400G for five minutes before removing the supernatant. The vascular cells are now ready for mixing with the matrix gel for matrix gel plug assay.

تحضير خلايا الأوعية الدموية لمقايسة سدادة جل مصفوفة الجسم الحي

Preparing Matrix Gel with Vascular Cells for In Vivo Matrix Gel Plug Assay

To begin, prepare 10 times M199 culture medium by dissolving M199 powder to 10 times concentration in 90 milliliters of deionized water, followed by the addition of 10 milliliters of FBS. Filter the solution through a 0.22 micron filter. The filtered medium can be stored at four degrees Celsius for up to two months.For preparing the matrix gel with vascular cells, use about 2 million vascular cells. Cool the sterile 1.5 milliliter tube containing the appropriately prepared cell pellet in an ice bath. Thaw the matrix gel completely in an ice bath without mixing or vortexing it.Similarly, cool the prepared 10 times M199 culture media along with the test reagent or drug of interest to four degrees Celsius. Next, maintaining a volume ratio of 8.8 to 1 to 0.2, combine the pre-cooled matrix gel with the pre-cooled 10 times M199 media containing 10%FBS, and the pre-cooled test reagent to produce the matrix gel mixture. Finally, re-suspend the pre-cooled cells in 400 microliters of the prepared matrix gel mixture by mixing gently to avoid forming bubbles.Keep the tube containing the cells in matrix gel on ice until the mice are ready for the matrix gel injection.

تحضير ماتريكس جل مع خلايا الأوعية الدموية لمقايسة قابس جل مصفوفة الجسم الحي

Matrix Gel Mixture Injection into Mouse for Matrix Gel Plug Assay

To begin, place the 30 gauge one milliliter insulin syringes in a four degrees Celsius refrigerator for cooling. Keep the freshly prepared matrix gel mix containing vascular cells on ice until the mouse is ready for the injection. Next, place the properly anesthetized mouse on the operating board in a prone position and secure its limbs onto the board using tape.Load a pre cooled insulin syringe with 300 microliters of the matrix gel mixture, avoiding the formation of bubbles. Disinfect the skin on the back of the mouse using 75%alcohol pads, then subcutaneously inject 300 microliters of the matrix gel mixture in the syringe into one side of the animal's back. Gently remove the needle from the injection site to prevent any leakage of the gel mixture.Ensure the formation of a small hump at the injection site. Position the mouse on a heating pad for two minutes to allow the matrix gel mixture to coagulate and form a plug. Repeat the demonstrated steps to create a plug on the other side of the mouse's back.Mark the edges of the hump using a marker pen. House the animal in a specific pathogen free experimental animal laboratory at 20 to 24 degrees with 12 hour light and 12 hour dark cycles for seven days.

حقن خليط ماتريكس جل في الماوس لمقايسة قابس ماتريكس جل

Dextran-FITC Injection and Matrix Gel Plug Collection from Mouse for Matrix Gel Plug Assay

To inject the mouse with Dextran, FITC seven days post the matrix gel injection, RESUSPEND 0.5 milligrams of Dextran, FITC in 500 microliters of double distilled water. Thoroughly vortex it to obtain a one microgram per microliter Dextran, FITC solution. Fill a 29 gauge syringe with 50 microliters of the Dextran FITC solution.Secure the mouse on the tail vein injection instrument, sanitize the tail with a 75%alcohol soaked cotton ball before carefully injecting 50 microliters of the Dextran FITC solution in the syringe into the tail vein. Apply pressure to the injection site with the cotton swab for one minute to staunch bleeding. Return the mouse to its cage and let it relax for 30 minutes before collecting the matrix gel plug.To collect the gel plug, cut the skin of the euthanized mouse along the marked border of the plug, using surgical scissors. And remove the skin above the matrix gel plug. Collect the plug and rinse it in a beaker with phosphate buffered saline to wash off any excess blood.Next, cover the bottom of the tissue embedding cassette with about 0.5 milliliters of tissue embedding gel. Then swiftly place the matrix gel plug on the tissue embedding gel in the planned orientation. Embed the plug with additional tissue embedding gel.Solidify the cassettes at minus 80 degrees Celsius for 12 hours. After removing the solidified plug block, cut 12 micron thick sections using a freezing microtome. Then mount the sections onto microscope slides.