עבודה זו מומנה על ידי הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ג'יאנג (LY22H020005), והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81873466).

כל הנהלים המערבים נבדקים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של האוניברסיטה הרפואית וונג'ואו (XMSQ2021-0057, 19 ביולי 2021). כל הריאגנטים והחומרים המתכלים מפורטים בטבלת החומרים.
1. הכנת מדיום תרבות
<ol><li>מדיום תרבית M199 10x: יש להמיס אבקת M199 לריכוז של פי 10 עם 90 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה ולהוסיף 10 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS), ולאחר מכן לעבור דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודשיים.</li>
	<li>מדיום תרבית אנדותל מלא: הוסף 50 מ"ל של FBS, 5 מ"ל של פניצילין/סטרפטומיצין, ו-5 מ"ל של תוספת גדילה של תאי אנדותל ל-460 מ"ל של תווך תאי אנדותל (ECM). יש לאחסן את המדיום ב-4°C למשך עד חודש אחד.</li>
</ol>2. הכנת תאי כלי דם
<ol><li>תרבית 1 x 105 תאי כלי דם (תאי אב אנדותל ראשונייםבתרבית 14, תאי אנדותל, או קווי תאי אנדותל) עם 8 מ"ל של תרבית אנדותל מלאה בינונית בצלחת תרבית רקמה של 100 מ"מ ב 37 ° C ו 5% CO2 עד 70% מפגש.</li>
	<li>הסר את מדיום התרבית ושטוף את הכלי 2x עם 1x פוספט buffered מלוחים (PBS) כדי להסיר תאים לא מחוברים ולכלוך. יש להסיר PBS ולהוסיף 3 מ"ל של 0.25% טריפסין המכיל 2.21 mM EDTA, ולדגור ב-37°C למשך דקה אחת.</li>
	<li>נטרלו את הטריפסין עם 7 מ"ל של מדיום תרבית אנדותל מלאה, ושטפו בעדינות תאים מצלחת התרבית. יש לאשר ניתוק תאים תחת מיקרוסקופ אור (הגדלה פי 40).</li>
	<li>יש לאסוף את תרחיף התאים בצינור של 15 מ"ל ובצנטריפוגה במהירות של 400 x גרם למשך 10 דקות. הסר supernatant ו resuspend תאים עם 5 מ"ל של מדיום תרבית אנדותל מלאה.</li>
	<li>לספור תאים באמצעות hemocytometer ולהעביר תרחיף המכיל 2 x 106 תאים לצינור סטרילי 1.5 מ"ל. כל תקע מכיל 1.5 x 106 תאים, 25% תאים נוספים משמשים במקרה של פסולת. כל קבוצה כוללת לפחות 3 תקעים. הערה: לאחר ניסויים נמצא כי 1.5 x 106 תאים ב 300 μL של ג'ל מטריצה הוביל להתפתחות נכונה של אנגיוגנזה ולכן נבחר לניסויים.</li>
	<li>תרחיף תאי צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות לתאי כדור, ולאחר מכן להסיר supernatant.</li>
</ol>3. הכנת ג'ל מטריקס
<ol><li>טרום קירור סטרילי 1.5 מ"ל צינורות המכילים גלולת תא באמבט מים 4 מעלות צלזיוס. מצננים מראש מזרקי אינסולין 30G 1 מ"ל במקרר 4°C.</li>
	<li>להפשיר לחלוטין ג'ל מטריצה באמבט מים 4 מעלות צלזיוס. אין לערבב או לערבל. קירור מראש 10x M199 ובדיקת מגיב/תרופת עניין באמבט מים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>יש לערבב ג'ל מטריצה מקורר מראש עם 10x M199 המכיל 10% FBS ואת הריאגנט שייבדק ביחס נפח של 8.8:1:0.2 כדי לקבל ג'ל מטריצה ותערובת M199 המכילה 1% FBS והמגיב.</li>
	<li>יש להשהות תאים עם 400 μL של תערובת ג'ל המטריצה, לערבב בעדינות כדי למנוע יצירת בועות. שמור את הצינור על קרח עד שהעכברים מוכנים להזרקה. שמור את תערובת ג'ל מטריצה על קרח כל הזמן כדי למנוע קרישה. הערה: כאן, 300 μL של תערובת ג'ל מטריצה המכילה 1.5 x 106 תאים שימש ליצירת תקע ג'ל. הכינו תוספת של 25% ג'ל לפי 25% תאים נוספים בשלב 2.</li>
</ol>4. הכנת עכבר
<ol><li>מרדימים עכבר Nu/Nu זכר בן 6-8 שבועות (18-25 גרם) בתא מכשיר ההרדמה של בעלי חיים עם איזופלורן (3% איזופלורן ב-100% חמצן בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה). לאחר הרדמה מוצלחת, שאושרה על ידי היעדר רפלקס תיקון ורפלקס צביטת בוהן, הוציאו את העכבר מהחדר, הוציאו את העכבר מהחדר והניחו מסכת הרדמה על העכבר ושנו את ריכוז האיזופלורן ל -1.5% ב -100% חמצן בקצב זרימה של 1 ליטר לדקה. הערה: ספק תמיכה תרמית לבעל החיים באמצעות כרית חימום לאורך כל ההליך.</li>
	<li>יש להשתמש במשחה וטרינרית על העיניים למניעת יובש. הדביקו את הגפיים של העכברים על לוח הניתוח במצב נוטה.</li>
</ol>5. הזרקת תערובת ג'ל מטריקס
<ol><li>טען 300 μL של תערובת ג'ל מטריצה לתוך מזרק אינסולין 1 מ"ל עם מחט 30G. הימנעו מהיווצרות בועות. טען במהירות את ג'ל המטריצה (תוך 2 דקות) כדי למנוע התמצקות במהלך זמן זה. הניחו מיד את מזרק האינסולין עמוס בג'ל מטריקס על קרח.</li>
	<li>נקו את העור על גבם של עכברים באמצעות רפידות 75% אלכוהול. תת עורית להזריק 300 μL של תערובת ג'ל מטריצה בצד אחד של החלק האחורי של עכברים.</li>
	<li>הסר בעדינות את המחט מאתר ההזרקה כדי למנוע דליפה של תערובת ג'ל המטריצה. בדקו אם יש גיבנת קטנה באתר ההזרקה (איור 1).</li>
	<li>הניחו את העכבר על כרית החימום למשך 2 דקות כדי לאפשר לתערובת ג'ל המטריקס לנקרש וליצור תקע.</li>
	<li>חזור על שלבים 5.2. ל-5.4. כדי ליצור תקע בצד השני של גב העכבר. סמן את קצות הדבשת באמצעות עט טוש.</li>
	<li>התבונן בעכבר עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבת עצם החזה. שים את העכבר בכלוב נפרד עד שהוא התאושש לחלוטין. אחסן את העכברים במעבדת בעלי חיים ניסיונית מסוג SPF ב 22 ± 2 ° C עם מחזור אור / חושך של 12 שעות במשך 7 ימים.</li>
</ol>6. הזרקת דקסטרן-FITC דרך וריד הזנב
<ol><li>לאחר 7 ימים של הזרקת ג'ל מטריצה, יש להשהות מחדש 0.5 מ"ג של דקסטרן-FITC עם 500 מיקרוליטר מים מזוקקים כפול (ddH2O) ולאחר מכן מערבלים באלימות כדי לקבל את תמיסת דקסטרן-FITC בריכוז הסופי של 1 מיקרוגרם/μL. הערה: השתמש ב- dextran-FITC עם משקל מולקולרי של ~150 kDa לבדיקת אנגיוגנזה, והשתמש ב- dextran-FITC עם משקל מולקולרי של ~4 kDa לבדיקת חדירות כלי דם.</li>
	<li>טען 50 μL של תמיסת dextran-FITC לתוך מזרקי 29G.</li>
	<li>תקן את העכבר במכשיר הזרקת וריד הזנב. נקו את הזנב עם כדור צמר גפן 75% אלכוהול והזריקו בעדינות 50 מיקרוליטר של דקסטרן-FITC דרך וריד הזנב.</li>
	<li>דחסו את אתר ההזרקה עם צמר גפן למשך דקה אחת כדי לעצור דימום, ואז החזירו את העכברים לכלוב למשך 30 דקות.</li>
	<li>חזור על שלבים 6.3. ו-6.4. עד שכל העכברים יקבלו זריקת דקסטרן-FITC.</li>
</ol>7. אוסף תקעי ג'ל מטריקס
<ol><li>הזרקה תוך-צפקית של 1% נתרן פנטוברביטלי ב-PBS (200 מ"ג/ק"ג משקל גוף) והרדמת העכברים בהליך מאושר על ידי IACUC.</li>
	<li>חותכים את העור לאורך הגבול המסומן של התקע באמצעות מספריים כירורגיים ולהסיר את העור מעל תקע ג'ל המטריצה.</li>
	<li>אספו את התקע ושטפו בכד קטן עם PBS 1x כדי לשטוף דם עודף (איור 2A). צבע התקע יכול לתאר באופן גס את מידת שפע הדם ואת תכולת כלי הדם (איור 3A).</li>
</ol>8. הטמעת תקע ג'ל מטריצה והכנת חתך
<ol><li>כסו את הכפתור של קלטת ההטבעה של הרקמה בכ-0.5 מ"ל של ג'ל הטבעה של רקמות, ולאחר מכן הניחו מיד את תקע ג'ל המטריצה על ג'ל ההטבעה של הרקמה בכיוון הרצוי כפי שמוצג באיור 2B. לאחר מכן, להטביע את התקע עם ג'ל הטבעה רקמות נוסף.</li>
	<li>הכניסו את הקלטות למקפיא בטמפרטורה של -80°C למשך 12 שעות כדי להתמצק.</li>
	<li>להכנת חתך עבה, מוציאים את בלוק התקע המוצק וחותכים מקטעים בעובי 12 מיקרומטר באמצעות המיקרוטום המקפיא בהתאם להוראה, ומרכיבים על שקופיות מיקרוסקופ.</li>
	<li>פורסים 5-10 חלקים מכל בלוק תקע.</li>
</ol>9. כימות אנגיוגנזה (איור 3)
<ol><li>קבל תמונות פלואורסצנטיות מ -5 שדות עצמאיים של החלק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך באורך גל של 488 ננומטר תחת הגדלה של פי 10.</li>
	<li>פתח את קובץ התמונה באמצעות תוכנת Image J (https://imagej.en.softonic.com/) ולחץ על הלחצן Angiogenesis Analyze . לאחר מכן, לחץ על לחצן נתח ניגודיות פאזות HUVEC ועבור לטבלת תוצאות סטטיסטיות כדי לאסוף מידע. מדוד את כל 5 תמונות הפלואורסצנטיות שנרכשו עבור כל קטע.</li>
	<li>לנתח את האורך הכולל של neo-vessels מקבוצות שונות כדי להעריך סטטיסטית את ההבדל באנגיוגנזה בין קבוצות אלה. הערה: אורך מקטעי האב הכולל מציין את האורך הכולל של כלי הניאו. המגיב שמגדיל את אורך הניאו-כלי נקרא פרו-אנגיוגני, ואילו המגיב שמקטין את אורך הניאו-כלי הוא אנטי-אנגיוגני.</li>
</ol>10. כימות חדירות כלי הדם (איור 4)
<ol><li>קבל תמונות פלואורסצנטיות מ -5 שדות עצמאיים של החלק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך באורך גל של 488 ננומטר תחת הגדלה של פי 20.</li>
	<li>פתח את קובץ התמונה באמצעות תוכנת Image J. לחץ על כפתור הבחירה ביד חופשית והקף את אזור הדליפה, ולאחר מכן לחץ על תפריט ניתוח ובחר באפשרות מדידה כדי לקבל את פרטי האזור של אזור הדליפה. השתמש ביחס בין אזור הדליפה לאזור התמונה כדי לציין חדירות כלי דם.</li>
	<li>נתח את היחס בין אזור הדליפה לאזור התמונה מקבוצות שונות כדי להעריך סטטיסטית את ההבדל בחדירות כלי הדם בין קבוצות אלה.</li>
</ol>

פישוט מחקרי אנגיוגנזה עם בדיקת תקע ג'ל מטריצה שונה

<ol>
	<li>Bikfalvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+and+conceptual+developments+in+vascular+biology+and+angiogenesis+research:+a+personal+view.">History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view.</a> Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+mechanisms+of+vessel+normalization+for+cancer+and+other+angiogenic+diseases.">Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases.</a> Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).</li><li>De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumour+angiogenesis.">Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis.</a> Nature reviews Cancer. 17 (8), 457-474 (2017).</li><li>Griffioen, A., Molema, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis:+potentials+for+pharmacologic+intervention+in+the+treatment+of+cancer,+cardiovascular+diseases,+and+chronic+inflammation.">Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation.</a> Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).</li><li>Viallard, C., Larriv&#233;e, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis+and+vascular+normalization:+alternative+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets.</a> Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).</li><li>Craig, M., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETS+transcription+factors+in+embryonic+vascular+development.">ETS transcription factors in embryonic vascular development.</a> Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).</li><li>Losordo, D., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+angiogenesis+and+vasculogenesis+for+ischemic+disease.+Part+I:+angiogenic+cytokines.">Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines.</a> Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-angiogenesis-new+concept+for+therapy+of+solid+tumors.">Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors.</a> Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer,+vascular,+rheumatoid+and+other+disease.">Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease.</a> Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opinion+-+Angiogenesis:+an+organizing+principle+for+drug+discovery.">Opinion - Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).</li><li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1&#946;+augments+the+angiogenesis+of+endothelial+progenitor+cells+in+an+NF-&#954;B/CXCR7-dependent+manner.">Interleukin-1&#946; augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-&#954;B/CXCR7-dependent manner.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).</li><li>Dai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+transcriptional+upregulation+of+IDH2+to+tune+mitochondrial+dynamics+and+rescue+angiogenic+function+of+diabetic+EPCs.">Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs.</a> Redox Biology. 56, 102449 (2022).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liraglutide+Improves+the+Angiogenic+Capability+of+EPC+and+Promotes+Ischemic+Angiogenesis+in+Mice+under+Diabetic+Conditions+through+an+Nrf2-Dependent+Mechanism.">Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism.</a> Cells. 11 (23), 3821 (2022).</li><li>Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three+dimensional+collagen+matrix+models+of+endothelial+lumen+formation+during+vasculogenesis+and+angiogenesis.">In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis.</a> Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).</li><li>Malinda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+matrigel+migration+and+angiogenesis+assay.">In vivo matrigel migration and angiogenesis assay.</a> Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays.">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li><li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF21+promotes+ischaemic+angiogenesis+and+endothelial+progenitor+cells+function+under+diabetic+conditions+in+an+AMPK/NAD+-dependent+manner.">FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).</li><li>Gavard, J., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+controls+endothelial-cell+permeability+by+promoting+the+beta-arrestin-dependent+endocytosis+of+VE-cadherin.">VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin.</a> Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).</li><li>Birdsey, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+transcription+factor+ERG+promotes+vascular+stability+and+growth+through+Wnt/&#946;-catenin+signaling.">The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/&#946;-catenin signaling.</a> Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+CXCR4+antagonist+enhances+angiogenesis+via+modifying+the+ischaemic+tissue+environment.">A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

אנו מציגים שיטה אמינה ונוחה להערכה כמותית של אנגיוגנזה in vivo ללא כתמים. בפרוטוקול זה, תאי כלי הדם עורבבו עם ג'ל מטריקס בנוכחות ריאגנטים פרו-אנגיוגניים או אנטי-אנגיוגניים, ולאחר מכן הוזרקו תת-עורית לחלק האחורי של עכברי Nu/Nu כדי ליצור תקע ג'ל (איור 1). לאחר 7 ימים של היווצרות ת...

אנגיוגנזה, תהליך היווצרות כלי הדם הניאו-כליים מכלי דם קיימים, ממלאת תפקיד קריטי בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון התפתחות עוברית, ריפוי פצעים, טרשת עורקים, התפתחות גידולים וכו '.1,2,3,4,5. תהליך דינמי זה כולל מספר שלבים, כולל השפלה של המטריצה, התפשטות תאי כלי דם, הגירה וארגון עצמי ליצירת מבנים צינוריים וייצוב של כלי הדם6. קידום אנגיוגנזה הוכח כקריטי בטיפול באוטם שריר הלב, שבץ וסוגים אחרים של מחלות איסכמיות7 תוך עיכוב אנגיוגנזה נחשב אסטרטגיה מבטיחה בטיפול בסרטן8 ומחלות שגרונית9. אנגיוגנזה נחשבת לעיקרון מארגן לגילוי תרופות10. לפיכך, בניית שיטה אמינה ונוחה להערכת היקף האנגיוגנזה היא קריטית למחקר מכני או גילוי תרופות במחלות תלויות אנגיוגנזה.
מספר מודלים in vitro ו- in vivo פותחו כדי להעריך אנגיוגנזה11. בין אלה, מודלים דו-ממדיים (2-D), כמו בדיקת היווצרות צינור ג'ל מטריצה12, אינם יכולים ליצור מבנים צינוריים פונקציונליים. המודלים של בעלי החיים, כגון איסכמיה של הגפה האחורית מודל13,14, יכולים לשחזר את תהליך האנגיוגנזה אך הם מורכבים ודורשים מערכת הדמיה של זרימת דם בלייזר. מודלים תלת ממדיים של מורפוגנזה וסקולרית, כמו בדיקת תקע ג'ל מטריצה, מספקים פלטפורמה פשוטה שיכולה לחקות את תהליך האנגיוגנזה in vivo15, אך זיהוי אנגיוגנזה דורש אימונוהיסטוכימיה או צביעת אימונופלואורסנציה 16,17,18, שהם משתנים ומדמיינים בצורה גרועה.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבדיקת תקע ג'ל מטריצה שונה שבו תאי כלי הדם עורבבו עם ג'ל מטריצה והוזרקו תת עורית לחלק האחורי של עכברים כדי ליצור תקע. בתקע, תאי כלי הדם צריכים לפרק את המטריצה, להתרבות, לנדוד ולהתארגן בעצמם כדי ליצור סוף סוף כלי דם פונקציונליים עם זרימת הדם בסביבה הפנימית. לאחר מכן, דקסטרן עם תווית פלואורסצנטית מוזרק דרך וריד הזנב, כדי לזרום דרך התקע, והתווית מומחשת כדי לציין ניאו-כלי. התוכן של אנגיוגנזה ניתן להעריך כמותית על ידי אורך כלי. שיטה זו יכולה ליצור כלי דם פונקציונליים שלא ניתן לייצר במודלים אנגיוגנזה דו-ממדית12, ואינה זקוקה לתהליך כתמים מורכב כמו בבדיקת תקע ג'ל מטריצה רגילה11. זה גם לא דורש מכשירים ספציפיים יקרים כמו מערכת הדמיה זרימת דם לייזר כתמים באיסכמיה של הגפיים האחוריות מודל 13,14,19. שיטה זו היא רב-תכליתית, זולה, ניתנת לכימות וקלה לביצוע, וניתן להשתמש בה כדי לקבוע את היכולת הפרו-אנגיוגנית או האנטי-אנגיוגנית של תרופות או לשמש במחקר מכני המעורב באנגיוגנזה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>188105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia System</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R640-S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoslicer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CryoStar NX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans-FITC-150kDa</td>
			<td>WEIHUA BIO</td>
			<td>WH007N07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans-FITC-4kDa</td>
			<td>WEIHUA BIO</td>
			<td>WH007N0705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Cassettes</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>80203-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Medium</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>35809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Supplements</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10100147C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor 1</td>
			<td>AtaGenix</td>
			<td>9043p-082318-A01</td>
			<td>FGF1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>Boruida</td>
			<td>30-50-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>300841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory&#160;Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>BSA124S-CW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td>Matrix gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31100-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound</td>
			<td>SUKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue embedding gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitate Acid</td>
			<td>KunChuang</td>
			<td>KC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Liquid</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments</td>
			<td>RWD</td>
			<td>RWD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tail Vein Injection Instrument</td>
			<td>KEW BASIS</td>
			<td>KW-XXY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T1320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Temperature Freezer</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>U410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Endothelial Growth Factor</td>
			<td>CHAMOT</td>
			<td>CM058-5HP</td>
			<td>VEGF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified in vivo matrix gel plug assay for angiogenesis studies

מספר מודלים פותחו כדי לחקור אנגיוגנזה in vivo. עם זאת, רוב המודלים הללו מורכבים ויקרים, דורשים ציוד מיוחד, או קשה לבצע אותם לניתוח כמותי לאחר מכן. כאן אנו מציגים בדיקת תקע ג'ל מטריצה שונה להערכת אנגיוגנזה in vivo. בפרוטוקול זה, תאי כלי הדם עורבבו עם ג'ל מטריקס בנוכחות או היעדר ריאגנטים פרו-אנגיוגניים או אנטי-אנגיוגניים, ולאחר מכן הוזרקו תת עורית לגבם של עכברים מושתלים. לאחר 7 ימים, מלח חיץ פוספט המכיל dextran-FITC מוזרק דרך וריד הזנב ומופץ בכלי הדם במשך 30 דקות. תקעי ג'ל מטריקס נאספים ומוטבעים בג'ל הטבעה רקמות, ואז חותכים קטעי 12 מיקרומטר לזיהוי פלואורסצנטי ללא כתמים. בבדיקה זו, dextran-FITC עם משקל מולקולרי גבוה (~ 150,000 Da) יכול לשמש כדי לציין כלי דם פונקציונליים לגילוי אורכם, בעוד dextran-FITC עם משקל מולקולרי נמוך (~ 4,400 Da) יכול לשמש כדי לציין את החדירות של neo-vessels. לסיכום, פרוטוקול זה יכול לספק שיטה אמינה ונוחה למחקר כמותי של אנגיוגנזה in vivo.

Angiogenesis, the process of formation of neo-vessels from pre-existing vessels, plays a critical role in many physiological and pathological processes, such as embryonic development, wound healing, atherosclerosis, tumor development, etc.1,2,3,4,5. This dynamic process involves several steps, including the degradation of the matrix, vascular cell proliferation, migration and self-organization to form tubular structures and the stabilization of the neo-vessels6. Promoting angiogenesis has been demonstrated to be critical in the treatment of myocardial infarction, stroke and other kinds of ischemic diseases7 while inhibiting angiogenesis has been considered a promising strategy in the treatment of cancers8 and rheumatoid diseases9. Angiogenesis has been considered an organizing principle for drug discovery10. Thus, the construction of a reliable and convenient method to assess the extent of angiogenesis is critical for mechanical research or drug discovery in angiogenesis-dependent diseases.
Several in vitro and in vivo models have been developed to evaluate angiogenesis11. Among these, two-dimensional (2-D) models, like matrix gel tube formation assay12, cannot form functional tubular structures. The animal models, such as the hind limb ischemia model13,14, can reproduce the angiogenesis process but are complex and require a laser speckle blood flow imaging system. 3D models of vascular morphogenesis, like matrix gel plug assay, provide a simple platform that can mimic the process of angiogenesis in vivo15, but the detection of angiogenesis requires immunohistochemistry or immunofluorescence staining16,17,18, which are variable and poorly visualized.
Here, we describe a protocol for a modified matrix gel plug assay where vascular cells were mixed with matrix gel and subcutaneously injected into the back of mice to form a plug. In the plug, vascular cells need to degrade the matrix, proliferate, migrate, and self-organize to finally form functional vessels with blood flow in the internal environment. Thereafter, fluorescent-labeled dextran is injected via the tail vein, to flow through the plug, and the label is visualized to indicate neo-vessels. The content of angiogenesis can be quantitatively evaluated by the length of the vessels. This method can form functional vessels that cannot be produced in 2-D angiogenesis models12, and does not need complex stain process as in ordinary matrix gel plug assay11. It also does not require expensive specific instruments like laser speckle blood flow imaging system in hind limb ischemia model13,14,19. This method is versatile, low-cost, quantifiable, and easy to perform, and can be used to determine the pro- or anti-angiogenic capability of drugs or be used in mechanical research involved in angiogenesis.

מחבר זרקור: חקירת אנגיוגנזה וחדירות כלי דם באמצעות בדיקת תקע ג'ל מטריצה שונה

שונה בבדיקת תקע ג'ל מטריצת Vivo למחקרי אנגיוגנזה

Our research deals with angiogenesis, the process of formation of new vessels from preexisting vessels. It plays a critical role in many physiological and pathological processes, such as embryonic development or curing atherosclerosis, tumor development, etc. The construction of a reliable model to evaluate the extent of angiogenesis is critical for myocardial research or the discovery of medicines for angiogenesis-depend diseases.However, most of the existing models are complex, expensive, and require specialized equipment. Here, we present a modified matrix gel plug assay that can be used to investigate angiogenesis and vessel permeability without staining in a simple, more intuitive, as well as efficient manner.

איור 1 הוא תרשים זרימה המתאר כיצד להכין את התערובת של ג'ל מטריצה, תאי כלי דם, מדיום תרבית ומגיב. לאחר מכן התערובת הוזרקה באופן תת-עורי לחלק האחורי של עכברי Nu/Nu וחוממה באמצעות כרית חימום כדי להאיץ את הקרישה שלה כדי ליצור לבסוף תקע ג'ל.
איור 2A הוא ת...

Watch this Scientific Journal Video about Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies at JoVE.com

השיטה המוצגת כאן יכולה להעריך את ההשפעה של ריאגנטים על אנגיוגנזה או חדירות כלי הדם in vivo ללא כתמים. השיטה משתמשת בהזרקת דקסטרן-FITC דרך וריד הזנב כדי לדמיין ניאו-כלי דם או דליפת כלי דם.

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized ...

המחקר שלנו עוסק באנגיוגנזה, תהליך היווצרות כלי דם חדשים מכלי דם קיימים. הוא ממלא תפקיד קריטי בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון התפתחות עוברית או ריפוי טרשת עורקים, התפתחות גידולים וכו '. בניית מודל אמין להערכת היקף האנגיוגנזה היא קריטית למחקר שריר הלב או לגילוי תרופות למחלות תלויות אנגיוגנזה.עם זאת, רוב הדגמים הקיימים מורכבים, יקרים ודורשים ציוד מיוחד. כאן, אנו מציגים בדיקת תקע ג'ל מטריצה שונה שניתן להשתמש בה כדי לחקור אנגיוגנזה וחדירות כלי מבלי להכתים בצורה פשוטה, אינטואיטיבית יותר, כמו גם יעילה.

modified-in-vivo-matrix-gel-plug-assay-for-angiogenesis-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies

555 Views.  Pingyang Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University. המחקר שלנו עוסק באנגיוגנזה, תהליך היווצרות כלי דם חדשים מכלי דם קיימים. הוא ממלא תפקיד קריטי בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון התפתחות עוברית או ריפוי טרשת עורקים, התפתחות גידולים וכו '. בניית מודל אמין להערכת היקף האנגיוגנזה היא קריטית למחקר שריר הלב או לגילוי תר?...

Video: מחבר זרקור: חקירת אנגיוגנזה וחדירות כלי דם באמצעות בדיקת תקע ג'ל מטריצה שונה

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized equipment, or are hard to perform for subsequent quantitative analysis. Here we present a modified matrix gel plug assay to evaluate angiogenesis in vivo. In this protocol, vascular cells were mixed with matrix gel in the presence or absence of pro-angiogenic or anti-angiogenic reagents, and then subcutaneously injected into the back of recipient mice. After 7 days, phosphate buffer saline containing dextran-FITC is injected via the tail vein and circulated in vessels for 30 min. Matrix gel plugs are collected and embedded with tissue embedding gel, then 12 &#181;m sections are cut for fluorescence detection without staining. In this assay, dextran-FITC with high molecular weight (~150,000 Da) can be used to indicate functional vessels for detecting their length, while dextran-FITC with low molecular weight (~4,400 Da) can be used to indicate the permeability of neo-vessels. In conclusion, this protocol can provide a reliable and convenient method for the quantitative study of angiogenesis in vivo.

The method presented here can evaluate the effect of reagents on angiogenesis or vascular permeability in vivo without staining. The method uses dextran-FITC injection via the tail vein to visualize neo-vessels or vascular leakage.

Preparing Vascular Cells for In Vivo Matrix Gel Plug Assay

Begin by preparing the complete endothelial culture medium using 460 milliliters of endothelial cell medium, and adding into it, 50 milliliters of FBS, five milliliters of penicillin streptomycin, and five milliliters of endothelial cell growth supplement. The prepared media can be stored at four degrees celsius for a month. Next, in a 100 millimeter tissue culture dish containing 0.1 million vascular cells at eight milliliters of the prepared complete endothelial culture medium and culture the cells at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide until 70%co-fluency is achieved.Then, remove the culture medium from the dish and rinse the cells twice with PBS to eliminate unattached cells and debris. After removing the PBS, add three milliliters of 0.25%trypsin, containing 2.21 millimolar EDTA to the cells and incubate the dish at 37 degrees Celsius for one minute. Verify cell detachment under a light microscope at 40 times magnification.Neutralize the trypsin with seven milliliters of complete endothelial culture medium and gently rinse the cells off the culture dish. Centrifuge the cell suspension after collecting it in a 15 milliliter tube at 400G for 10 minutes. Re-suspend the cells in five milliliters of complete endothelial culture medium after removing the supernatant, then count the cells using a hemo-cytometer, and transfer a calculated volume of suspension containing 2 million cells to a sterile 1.5 milliliter tube.Pellet the cells by centrifuging the suspension at 400G for five minutes before removing the supernatant. The vascular cells are now ready for mixing with the matrix gel for matrix gel plug assay.

הכנת תאי כלי דם לבדיקת תקע ג'ל In Vivo Matrix

Preparing Matrix Gel with Vascular Cells for In Vivo Matrix Gel Plug Assay

To begin, prepare 10 times M199 culture medium by dissolving M199 powder to 10 times concentration in 90 milliliters of deionized water, followed by the addition of 10 milliliters of FBS. Filter the solution through a 0.22 micron filter. The filtered medium can be stored at four degrees Celsius for up to two months.For preparing the matrix gel with vascular cells, use about 2 million vascular cells. Cool the sterile 1.5 milliliter tube containing the appropriately prepared cell pellet in an ice bath. Thaw the matrix gel completely in an ice bath without mixing or vortexing it.Similarly, cool the prepared 10 times M199 culture media along with the test reagent or drug of interest to four degrees Celsius. Next, maintaining a volume ratio of 8.8 to 1 to 0.2, combine the pre-cooled matrix gel with the pre-cooled 10 times M199 media containing 10%FBS, and the pre-cooled test reagent to produce the matrix gel mixture. Finally, re-suspend the pre-cooled cells in 400 microliters of the prepared matrix gel mixture by mixing gently to avoid forming bubbles.Keep the tube containing the cells in matrix gel on ice until the mice are ready for the matrix gel injection.

הכנת ג'ל מטריקס עם תאי כלי דם לבדיקת תקע ג'ל In Vivo Matrix

Matrix Gel Mixture Injection into Mouse for Matrix Gel Plug Assay

To begin, place the 30 gauge one milliliter insulin syringes in a four degrees Celsius refrigerator for cooling. Keep the freshly prepared matrix gel mix containing vascular cells on ice until the mouse is ready for the injection. Next, place the properly anesthetized mouse on the operating board in a prone position and secure its limbs onto the board using tape.Load a pre cooled insulin syringe with 300 microliters of the matrix gel mixture, avoiding the formation of bubbles. Disinfect the skin on the back of the mouse using 75%alcohol pads, then subcutaneously inject 300 microliters of the matrix gel mixture in the syringe into one side of the animal's back. Gently remove the needle from the injection site to prevent any leakage of the gel mixture.Ensure the formation of a small hump at the injection site. Position the mouse on a heating pad for two minutes to allow the matrix gel mixture to coagulate and form a plug. Repeat the demonstrated steps to create a plug on the other side of the mouse's back.Mark the edges of the hump using a marker pen. House the animal in a specific pathogen free experimental animal laboratory at 20 to 24 degrees with 12 hour light and 12 hour dark cycles for seven days.

הזרקת תערובת ג'ל מטריקס לעכבר לבדיקת תקע ג'ל מטריקס

Dextran-FITC Injection and Matrix Gel Plug Collection from Mouse for Matrix Gel Plug Assay

To inject the mouse with Dextran, FITC seven days post the matrix gel injection, RESUSPEND 0.5 milligrams of Dextran, FITC in 500 microliters of double distilled water. Thoroughly vortex it to obtain a one microgram per microliter Dextran, FITC solution. Fill a 29 gauge syringe with 50 microliters of the Dextran FITC solution.Secure the mouse on the tail vein injection instrument, sanitize the tail with a 75%alcohol soaked cotton ball before carefully injecting 50 microliters of the Dextran FITC solution in the syringe into the tail vein. Apply pressure to the injection site with the cotton swab for one minute to staunch bleeding. Return the mouse to its cage and let it relax for 30 minutes before collecting the matrix gel plug.To collect the gel plug, cut the skin of the euthanized mouse along the marked border of the plug, using surgical scissors. And remove the skin above the matrix gel plug. Collect the plug and rinse it in a beaker with phosphate buffered saline to wash off any excess blood.Next, cover the bottom of the tissue embedding cassette with about 0.5 milliliters of tissue embedding gel. Then swiftly place the matrix gel plug on the tissue embedding gel in the planned orientation. Embed the plug with additional tissue embedding gel.Solidify the cassettes at minus 80 degrees Celsius for 12 hours. After removing the solidified plug block, cut 12 micron thick sections using a freezing microtome. Then mount the sections onto microscope slides.