Bu çalışma, Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (LY22H020005) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81873466) tarafından finanse edilmiştir.

Hayvan denekleri içeren tüm prosedürler, Wenzhou Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (XMSQ2021-0057, 19 Temmuz 2021). Tüm reaktifler ve sarf malzemeleri Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Kültür ortamının hazırlanması
<ol><li>10x M199 kültür ortamı: M199 tozunu 90 mL deiyonize su ile 10x konsantrasyona çözün ve 10 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin, ardından 0.22 μm'lik bir filtreden geçirin. Ortamı 4 °C'de 2 aya kadar saklayın.</li>
	<li>Tam endotel kültür ortamı: 460 mL endotel hücre ortamına (ECM) 50 mL FBS, 5 mL penisilin / streptomisin ve 5 mL endotel hücre büyüme takviyesi ekleyin. Ortamı 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.</li>
</ol>2. Vasküler hücre hazırlığı
<ol><li>Kültür 1 x 105 vasküler hücreler (primer kültürlenmiş endotelyal progenitör hücreler14, endotel hücreleri veya endotel hücre hatları) 37 ° C'de 100 mm doku kültürü kabında 8 mL tam endotel kültürü ortamı ve% 5 CO2 ila% 70 birleşme.</li>
	<li>Kültür ortamını çıkarın ve bağlanmamış hücreleri ve kalıntıları gidermek için kabı 2x 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın. PBS'yi çıkarın ve 2.21 mM EDTA içeren 3 mL% 0.25 tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 1 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Tripsini 7 mL tam endotel kültürü ortamı ile nötralize edin ve hücreleri kültür kabından nazikçe durulayın. Işık mikroskobu altında hücre ayrılmasını onaylayın (40x büyütme).</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 5 mL tam endotel kültürü ortamı ile yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve 2 x 106 hücre içeren süspansiyonu steril 1.5 mL'lik bir tüpe taşıyın. Her fiş 1,5 x 106 hücre içerir, atık durumunda ek% 25 hücre kullanılır. Her grup en az 3 fiş içerir. NOT: Denemelerden sonra, 300 μL matris jel içindeki 1.5 x 106 hücrenin anjiyogenezin uygun şekilde gelişmesine yol açtığı ve bu nedenle deney için seçildiği bulundu.</li>
	<li>Pelet hücrelerine 5 dakika boyunca 400 x g'da hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve ardından süpernatanı çıkarın.</li>
</ol>3. Matris jel hazırlama
<ol><li>Hücre peleti içeren steril 1,5 mL'lik tüpleri 4 °C'lik bir su banyosunda önceden soğutun. 30G 1 mL insülin şırıngalarını 4 °C buzdolabında önceden soğutun.</li>
	<li>Matriks jeli 4 °C su banyosunda tamamen çözdürün. Karıştırmayın veya girdap yapmayın. 10x M199'u önceden soğutun ve 4 °C'lik bir su banyosunda reaktifi/ilgilenilen ilacı test edin.</li>
	<li>Önceden soğutulmuş matris jeli, %10 FBS içeren 10x M199 ile ve test edilecek reaktifi 8.8:1:0.2 hacim oranında karıştırarak %1 FBS ve reaktif içeren bir matris jeli ve M199 karışımı elde edin.</li>
	<li>Hücreleri 400 μL matris jel karışımı ile yeniden süspanse edin, kabarcık oluşumunu önlemek için hafifçe karıştırın. Fareler enjeksiyon için hazırlanana kadar tüpü buz üzerinde tutun. Pıhtılaşmayı önlemek için matris jel karışımını her zaman buz üzerinde tutun. NOT: Burada, jel tıkacı oluşturmak için 1.5 x 106 hücre içeren 300 μL matris jel karışımı kullanılmıştır. 2. adımda% 25 ek hücrelere göre% 25 ekstra jel hazırlayın.</li>
</ol>4. Fare hazırlığı
<ol><li>6-8 haftalık erkek Nu / Nu faresini (18-25 g) hayvan anestezi cihazının haznesinde izofluran (1 L / dak akış hızında% 100 oksijende% 3 izofluran) ile uyuşturun. Başarılı bir anesteziden sonra, düzeltme refleksi ve ayak parmağı sıkıştırma refleksinin yokluğu ile onaylanan fareyi odadan çıkarın, fareyi odadan çıkarın ve fareye bir anestezi maskesi koyun ve izofluran konsantrasyonunu 1 L / dak akış hızında% 100 oksijende% 1.5'e değiştirin. NOT: Prosedür boyunca bir ısıtma yastığı kullanarak hayvana termal destek sağlayın.</li>
	<li>Kuruluğu önlemek için gözlerde veteriner merhemi kullanın. Farelerin uzuvlarını yüzüstü pozisyonda ameliyat panosuna bantlayın.</li>
</ol>5. Matris jel karışımı enjeksiyonu
<ol><li>300 μL matris jel karışımını 30G iğneli 1 mL'lik bir insülin şırıngasına yükleyin. Kabarcık oluşumundan kaçının. Bu süre zarfında katılaşmayı önlemek için matris jeli (2 dakika içinde) hızla yükleyin. Matriks jel yüklü insülin şırıngasını hemen buzun üzerine yerleştirin.</li>
	<li>%75 alkollü pedler kullanarak farelerin arkasındaki cildi temizleyin. Deri altından 300 μL matris jel karışımını farelerin sırtının bir tarafına enjekte edin.</li>
	<li>Matris jel karışımının sızmasını önlemek için iğneyi enjeksiyon bölgesinden yavaşça çıkarın. Enjeksiyon bölgesinde küçük bir kambur olup olmadığını kontrol edin (Şekil 1).</li>
	<li>Matris jel karışımının pıhtılaşmasını ve tıkaç oluşturmasını sağlamak için fareyi 2 dakika boyunca ısıtma yastığının üzerine yerleştirin.</li>
	<li>5.2 adımlarını tekrarlayın. 5.4'e kadar. oluşturmak için Farenin arkasının diğer tarafında fiş. Bir işaretleyici kalem kullanarak tümseklerin kenarlarını işaretleyin.</li>
	<li>Sternal yaslığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar fareyi gözlemleyin. Tamamen iyileşene kadar fareyi ayrı bir kafese koyun. Fareleri SPF sınıfı deney hayvanı laboratuvarında 22 ± 2 °C'de 7 gün boyunca 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsüyle barındırın.</li>
</ol>6. Kuyruk damarından Dextran-FITC enjeksiyonu
<ol><li>7 günlük matris jel enjeksiyonundan sonra, 0.5 mg dekstran-FITC'yi 500 μL çift damıtılmış su (ddH2O) ile yeniden süspanse edin ve ardından 1 μg / μL'lik son konsantrasyonda dekstran-FITC çözeltisini elde etmek için şiddetli bir şekilde girdap yapın. NOT: Anjiyogenez testi için ~ 150 kDa moleküler ağırlığa sahip dekstran-FITC kullanın ve vasküler geçirgenlik testi için ~ 4 kDa moleküler ağırlığa sahip dekstran-FITC kullanın.</li>
	<li>29G şırıngalara 50 μL dekstran-FITC solüsyonu yükleyin.</li>
	<li>Fareyi kuyruk damarı enjeksiyon aletine sabitleyin. Kuyruğu %75 alkollü pamuk topuyla temizleyin ve kuyruk damarından nazikçe 50 μL dekstran-FITC enjekte edin.</li>
	<li>Kanamayı durdurmak için enjeksiyon bölgesini pamuklu çubukla 1 dakika sıkıştırın ve ardından fareleri 30 dakika boyunca kafese geri koyun.</li>
	<li>6.3 adımlarını tekrarlayın. ve 6.4. tüm fareler dekstran-FITC enjeksiyonu alana kadar.</li>
</ol>7. Matris jel tapa toplama
<ol><li>İntraperitoneal olarak PBS'de% 1 pentobarbital sodyum (200 mg / kg vücut ağırlığı) enjekte edin ve fareleri IACUC onaylı bir prosedürle ötenazi yapın.</li>
	<li>Cerrahi makas kullanarak cildi tıkacın işaretli kenarı boyunca kesin ve matris jel tapasının üzerindeki cildi çıkarın.</li>
	<li>Tapayı toplayın ve fazla kanı yıkamak için 1x PBS'li küçük bir beherde durulayın (Şekil 2A). Tıkaç rengi, kan bolluğunun derecesini ve neo-damarların içeriğini kabaca tanımlayabilir (Şekil 3A).</li>
</ol>8. Gömme matris jel tapası ve bölüm hazırlığı
<ol><li>Doku gömme kasetinin düğmesini yaklaşık 0.5 mL doku gömme jeli ile kapatın, ardından matris jel tapasını hemen Şekil 2B'de gösterildiği gibi istenen yönde doku gömme jelinin üzerine yerleştirin. Ardından, fişi ek doku gömme jeli ile gömün.</li>
	<li>Kasetleri katılaşması için -80 °C'lik bir dondurucuya 12 saat koyun.</li>
	<li>Kalın kesit hazırlığı için, katılaşmış tapa bloğunu çıkarın ve talimata göre dondurucu mikrotomu kullanarak 12 μm kalınlığındaki kesitleri kesin ve mikroskop lamlarına monte edin.</li>
	<li>Her fiş bloğundan 5-10 bölüm dilimleyin.</li>
</ol>9. Anjiyogenezin miktar tayini (Şekil 3)
<ol><li>10x büyütme altında 488 nm dalga boyunda ters çevrilmiş floresan mikroskobu ile kesitin 5 bağımsız alanından floresan görüntüler elde edin.</li>
	<li>Görüntü dosyasını Image J yazılımı (https://imagej.en.softonic.com/) ile açın ve Angiogenesis Analyze (Anjiyogenez Analizi ) düğmesine tıklayın. Ardından, HUVEC Faz Kontrastını Analiz Et düğmesine tıklayın ve bilgi toplamak için İstatistik Sonuçları Tablosuna geçin. Her bölüm için elde edilen 5 floresan görüntünün tümünü ölçün.</li>
	<li>Bu gruplar arasındaki anjiyogenez farkını istatistiksel olarak değerlendirmek için farklı gruplardan neo-damarların toplam uzunluğunu analiz edin. NOT: Toplam ana segment uzunluğu, neo-gemilerin toplam uzunluğunu gösterir. Neo-damarların uzunluğunu artıran reaktif pro-anjiyojenik olarak adlandırılırken, neo-damarların uzunluğunu azaltan reaktif anti-anjiyojeniktir.</li>
</ol>10. Vasküler geçirgenliğin ölçülmesi (Şekil 4)
<ol><li>20x büyütme altında 488 nm dalga boyunda ters çevrilmiş floresan mikroskobu ile kesitin 5 bağımsız alanından floresan görüntüler elde edin.</li>
	<li>Görüntü dosyasını Image J yazılımıyla açın. Serbest El Seçimi düğmesine tıklayın ve sızıntı alanını daire içine alın, ardından Analiz menüsüne tıklayın ve sızıntı alanının alan bilgilerini almak için Ölç seçeneğini seçin. Vasküler geçirgenliği belirtmek için sızıntı alanı ve görüntü alanı oranını kullanın.</li>
	<li>Bu gruplar arasındaki vasküler geçirgenlik farkını istatistiksel olarak değerlendirmek için farklı gruplardan sızıntı alanı ve görüntü alanı oranını analiz edin.</li>
</ol>

Modifiye Matris Jel Tıkaç Testi ile Anjiyogenez Çalışmalarının Basitleştirilmesi

<ol>
	<li>Bikfalvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+and+conceptual+developments+in+vascular+biology+and+angiogenesis+research:+a+personal+view.">History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view.</a> Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+mechanisms+of+vessel+normalization+for+cancer+and+other+angiogenic+diseases.">Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases.</a> Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).</li><li>De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumour+angiogenesis.">Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis.</a> Nature reviews Cancer. 17 (8), 457-474 (2017).</li><li>Griffioen, A., Molema, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis:+potentials+for+pharmacologic+intervention+in+the+treatment+of+cancer,+cardiovascular+diseases,+and+chronic+inflammation.">Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation.</a> Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).</li><li>Viallard, C., Larriv&#233;e, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis+and+vascular+normalization:+alternative+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets.</a> Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).</li><li>Craig, M., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETS+transcription+factors+in+embryonic+vascular+development.">ETS transcription factors in embryonic vascular development.</a> Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).</li><li>Losordo, D., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+angiogenesis+and+vasculogenesis+for+ischemic+disease.+Part+I:+angiogenic+cytokines.">Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines.</a> Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-angiogenesis-new+concept+for+therapy+of+solid+tumors.">Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors.</a> Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer,+vascular,+rheumatoid+and+other+disease.">Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease.</a> Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opinion+-+Angiogenesis:+an+organizing+principle+for+drug+discovery.">Opinion - Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).</li><li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1&#946;+augments+the+angiogenesis+of+endothelial+progenitor+cells+in+an+NF-&#954;B/CXCR7-dependent+manner.">Interleukin-1&#946; augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-&#954;B/CXCR7-dependent manner.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).</li><li>Dai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+transcriptional+upregulation+of+IDH2+to+tune+mitochondrial+dynamics+and+rescue+angiogenic+function+of+diabetic+EPCs.">Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs.</a> Redox Biology. 56, 102449 (2022).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liraglutide+Improves+the+Angiogenic+Capability+of+EPC+and+Promotes+Ischemic+Angiogenesis+in+Mice+under+Diabetic+Conditions+through+an+Nrf2-Dependent+Mechanism.">Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism.</a> Cells. 11 (23), 3821 (2022).</li><li>Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three+dimensional+collagen+matrix+models+of+endothelial+lumen+formation+during+vasculogenesis+and+angiogenesis.">In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis.</a> Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).</li><li>Malinda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+matrigel+migration+and+angiogenesis+assay.">In vivo matrigel migration and angiogenesis assay.</a> Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays.">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li><li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF21+promotes+ischaemic+angiogenesis+and+endothelial+progenitor+cells+function+under+diabetic+conditions+in+an+AMPK/NAD+-dependent+manner.">FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).</li><li>Gavard, J., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+controls+endothelial-cell+permeability+by+promoting+the+beta-arrestin-dependent+endocytosis+of+VE-cadherin.">VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin.</a> Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).</li><li>Birdsey, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+transcription+factor+ERG+promotes+vascular+stability+and+growth+through+Wnt/&#946;-catenin+signaling.">The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/&#946;-catenin signaling.</a> Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+CXCR4+antagonist+enhances+angiogenesis+via+modifying+the+ischaemic+tissue+environment.">A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Anjiyogenezin kantitatif değerlendirmesi için in vivo boyamadan güvenilir ve kullanışlı bir yöntem sunuyoruz. Bu protokolde, vasküler hücreler pro-anjiyojenik veya anti-anjiyojenik reaktifler varlığında matriks jel ile karıştırıldı ve daha sonra jel tıkacı oluşturmak için Nu/Nu farelerin arkasına deri altına enjekte edildi (Şekil 1). 7 günlük jel tıkacı oluşumundan sonra, dekstran-FITC intravenöz olarak enjekte edildi ve 30 dakika boyunca sirküle edild...

Önceden var olan damarlardan neo-damarların oluşum süreci olan anjiyogenez, embriyonik gelişim, yara iyileşmesi, ateroskleroz, tümör gelişimi vb. gibi birçok fizyolojik ve patolojik süreçte kritik bir rol oynar.1,2,3,4,5. Bu dinamik süreç, matrisin bozulması, vasküler hücre proliferasyonu, boru şeklindeki yapılar oluşturmak için göç ve kendi kendine örgütlenme ve neo-damarların stabilizasyonu dahil olmak üzere birkaç adımı içerir6. Anjiyogenezin teşvik edilmesinin miyokard enfarktüsü, inme ve diğer iskemik hastalıklarıntedavisinde kritik olduğu gösterilmiştir 7 anjiyogenezin inhibe edilmesi, kanserlerin8 ve romatizmal hastalıklarıntedavisinde umut verici bir strateji olarak kabul edilmiştir 9. Anjiyogenez, ilaç keşfi için düzenleyici bir ilke olarak kabul edilmiştir10. Bu nedenle, anjiyogenezin derecesini değerlendirmek için güvenilir ve uygun bir yöntemin oluşturulması, anjiyogeneze bağlı hastalıklarda mekanik araştırma veya ilaç keşfi için kritik öneme sahiptir.
Anjiyogenezi değerlendirmek için çeşitli in vitro ve in vivo modeller geliştirilmiştir11. Bunlar arasında, matris jel tüp oluşum deneyi12 gibi iki boyutlu (2-D) modeller, fonksiyonel boru şeklinde yapılar oluşturamaz. Arka bacak iskemi modeli13,14 gibi hayvan modelleri, anjiyogenez sürecini yeniden üretebilir, ancak karmaşıktır ve bir lazer benek kan akışı görüntüleme sistemi gerektirir. Matris jel tıkaç testi gibi vasküler morfogenezin 3D modelleri, in vivo15 anjiyogenez sürecini taklit edebilen basit bir platform sağlar, ancak anjiyogenezin saptanması, değişken ve kötü görselleştirilmiş immünohistokimya veya immünofloresan boyama 16,17,18 gerektirir.
Burada, vasküler hücrelerin matriks jel ile karıştırıldığı ve bir tıkaç oluşturmak için farelerin arkasına deri altına enjekte edildiği modifiye edilmiş bir matris jel tıkacı testi için bir protokol açıklıyoruz. Tıkaçta, vasküler hücrelerin matrisi bozması, çoğalması, göç etmesi ve nihayet iç ortamda kan akışı olan fonksiyonel damarlar oluşturmak için kendi kendini organize etmesi gerekir. Daha sonra, floresan etiketli dekstran, tıkaçtan akmak için kuyruk damarı yoluyla enjekte edilir ve etiket, neo-damarları belirtmek için görselleştirilir. Anjiyogenez içeriği, damarların uzunluğu ile kantitatif olarak değerlendirilebilir. Bu yöntem, 2 boyutlu anjiyogenez modellerinde12 üretilemeyen fonksiyonel damarlar oluşturabilir ve sıradan matris jel tıkaç testinde11 olduğu gibi karmaşık boyama işlemine ihtiyaç duymaz. Ayrıca arka ekstremite iskemisi model13,14,19'da lazer benek kan akışı görüntüleme sistemi gibi pahalı özel aletler gerektirmez. Bu yöntem çok yönlü, düşük maliyetli, ölçülebilir ve gerçekleştirilmesi kolaydır ve ilaçların pro- veya anti-anjiyojenik kapasitesini belirlemek için kullanılabilir veya anjiyogenezde yer alan mekanik araştırmalarda kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>188105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia System</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R640-S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoslicer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CryoStar NX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans-FITC-150kDa</td>
			<td>WEIHUA BIO</td>
			<td>WH007N07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans-FITC-4kDa</td>
			<td>WEIHUA BIO</td>
			<td>WH007N0705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Cassettes</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>80203-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Medium</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>35809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Supplements</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10100147C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor 1</td>
			<td>AtaGenix</td>
			<td>9043p-082318-A01</td>
			<td>FGF1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>Boruida</td>
			<td>30-50-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>300841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory&#160;Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>BSA124S-CW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td>Matrix gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31100-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound</td>
			<td>SUKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue embedding gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitate Acid</td>
			<td>KunChuang</td>
			<td>KC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Liquid</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments</td>
			<td>RWD</td>
			<td>RWD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tail Vein Injection Instrument</td>
			<td>KEW BASIS</td>
			<td>KW-XXY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T1320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Temperature Freezer</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>U410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Endothelial Growth Factor</td>
			<td>CHAMOT</td>
			<td>CM058-5HP</td>
			<td>VEGF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified in vivo matrix gel plug assay for angiogenesis studies

İn vivo anjiyogenezi araştırmak için çeşitli modeller geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu modellerin çoğu karmaşık ve pahalıdır, özel ekipman gerektirir veya sonraki nicel analizler için gerçekleştirilmesi zordur. Burada, in vivo anjiyogenezi değerlendirmek için modifiye edilmiş bir matris jel tıkaç testi sunuyoruz. Bu protokolde, vasküler hücreler pro-anjiyojenik veya anti-anjiyojenik reaktiflerin varlığında veya yokluğunda matriks jel ile karıştırıldı ve daha sonra deri altından alıcı farelerin arkasına enjekte edildi. 7 gün sonra, dekstran-FITC içeren fosfat tampon salin kuyruk damarı yoluyla enjekte edilir ve 30 dakika boyunca damarlarda dolaştırılır. Matris jel tıkaçları toplanır ve doku gömme jel ile gömülür, daha sonra lekelenmeden floresan tespiti için 12 μm'lik bölümler kesilir. Bu tahlilde, yüksek moleküler ağırlığa (~ 150.000 Da) sahip dekstran-FITC, uzunluklarını tespit etmek için fonksiyonel damarları belirtmek için kullanılabilirken, düşük moleküler ağırlığa (~ 4.400 Da) sahip dekstran-FITC, neo-damarların geçirgenliğini belirtmek için kullanılabilir. Sonuç olarak, bu protokol in vivo anjiyogenezin kantitatif çalışması için güvenilir ve uygun bir yöntem sağlayabilir.

Angiogenesis, the process of formation of neo-vessels from pre-existing vessels, plays a critical role in many physiological and pathological processes, such as embryonic development, wound healing, atherosclerosis, tumor development, etc.1,2,3,4,5. This dynamic process involves several steps, including the degradation of the matrix, vascular cell proliferation, migration and self-organization to form tubular structures and the stabilization of the neo-vessels6. Promoting angiogenesis has been demonstrated to be critical in the treatment of myocardial infarction, stroke and other kinds of ischemic diseases7 while inhibiting angiogenesis has been considered a promising strategy in the treatment of cancers8 and rheumatoid diseases9. Angiogenesis has been considered an organizing principle for drug discovery10. Thus, the construction of a reliable and convenient method to assess the extent of angiogenesis is critical for mechanical research or drug discovery in angiogenesis-dependent diseases.
Several in vitro and in vivo models have been developed to evaluate angiogenesis11. Among these, two-dimensional (2-D) models, like matrix gel tube formation assay12, cannot form functional tubular structures. The animal models, such as the hind limb ischemia model13,14, can reproduce the angiogenesis process but are complex and require a laser speckle blood flow imaging system. 3D models of vascular morphogenesis, like matrix gel plug assay, provide a simple platform that can mimic the process of angiogenesis in vivo15, but the detection of angiogenesis requires immunohistochemistry or immunofluorescence staining16,17,18, which are variable and poorly visualized.
Here, we describe a protocol for a modified matrix gel plug assay where vascular cells were mixed with matrix gel and subcutaneously injected into the back of mice to form a plug. In the plug, vascular cells need to degrade the matrix, proliferate, migrate, and self-organize to finally form functional vessels with blood flow in the internal environment. Thereafter, fluorescent-labeled dextran is injected via the tail vein, to flow through the plug, and the label is visualized to indicate neo-vessels. The content of angiogenesis can be quantitatively evaluated by the length of the vessels. This method can form functional vessels that cannot be produced in 2-D angiogenesis models12, and does not need complex stain process as in ordinary matrix gel plug assay11. It also does not require expensive specific instruments like laser speckle blood flow imaging system in hind limb ischemia model13,14,19. This method is versatile, low-cost, quantifiable, and easy to perform, and can be used to determine the pro- or anti-angiogenic capability of drugs or be used in mechanical research involved in angiogenesis.

Yazar Spot Işığı: Modifiye Matris Jel Tıkaç Testi ile Anjiyogenez ve Damar Geçirgenliğinin Araştırılması

Anjiyogenez Çalışmaları için Modifiye In Vivo Matrix Jel Plug Testi

Şekil 1 , matris jeli, vasküler hücreler, kültür ortamı ve reaktif karışımının nasıl hazırlanacağını gösteren akış şemasıdır. Karışım daha sonra deri altından Nu / Nu farelerinin arkasına enjekte edildi ve sonunda jel tıkacı oluşturmak için pıhtılaşmasını hızlandırmak için bir ısıtma yastığı kullanılarak ısıtıldı.
Şekil 2A , floresan etiketli dekstran içeren kapları gösteren akış ...

Watch this Scientific Journal Video about Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies at JoVE.com

Burada sunulan yöntem, reaktiflerin anjiyogenez veya vasküler geçirgenlik üzerindeki etkisini in vivo boyamadan değerlendirebilir. Yöntem, neo-damarları veya vasküler sızıntıyı görselleştirmek için kuyruk damarı yoluyla dekstran-FITC enjeksiyonunu kullanır.

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized ...

Araştırmamız, önceden var olan damarlardan yeni damarların oluşum süreci olan anjiyogenez ile ilgilidir. Embriyonik gelişim veya aterosklerozun iyileştirilmesi, tümör gelişimi vb. gibi birçok fizyolojik ve patolojik süreçte kritik bir rol oynar. Anjiyogenezin derecesini değerlendirmek için güvenilir bir modelin oluşturulması, miyokard araştırmaları veya anjiyogeneze bağlı hastalıklar için ilaçların keşfi için kritik öneme sahiptir.Bununla birlikte, mevcut modellerin çoğu karmaşık, pahalıdır ve özel ekipman gerektirir. Burada, basit, daha sezgisel ve verimli bir şekilde boyama olmadan anjiyogenez ve damar geçirgenliğini araştırmak için kullanılabilecek modifiye edilmiş bir matris jel tıkaç testi sunuyoruz.

modified-in-vivo-matrix-gel-plug-assay-for-angiogenesis-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies

584 Görüntüleme.  Pingyang Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University. Araştırmamız, önceden var olan damarlardan yeni damarların oluşum süreci olan anjiyogenez ile ilgilidir. Embriyonik gelişim veya aterosklerozun iyileştirilmesi, tümör gelişimi vb. gibi birçok fizyolojik ve patolojik süreçte kritik bir rol oynar. Anjiyogenezin derecesini değerlendirmek için güvenilir bir modelin oluşturulması, miyokard araştırmaları veya anjiyogeneze bağlı hastalıklar için ilaçların keşfi için kritik öneme sahiptir.Bununla birlikte, mevcu...

Video: Yazar Spot Işığı: Modifiye Matris Jel Tıkaç Testi ile Anjiyogenez ve Damar Geçirgenliğinin Araştırılması

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized equipment, or are hard to perform for subsequent quantitative analysis. Here we present a modified matrix gel plug assay to evaluate angiogenesis in vivo. In this protocol, vascular cells were mixed with matrix gel in the presence or absence of pro-angiogenic or anti-angiogenic reagents, and then subcutaneously injected into the back of recipient mice. After 7 days, phosphate buffer saline containing dextran-FITC is injected via the tail vein and circulated in vessels for 30 min. Matrix gel plugs are collected and embedded with tissue embedding gel, then 12 &#181;m sections are cut for fluorescence detection without staining. In this assay, dextran-FITC with high molecular weight (~150,000 Da) can be used to indicate functional vessels for detecting their length, while dextran-FITC with low molecular weight (~4,400 Da) can be used to indicate the permeability of neo-vessels. In conclusion, this protocol can provide a reliable and convenient method for the quantitative study of angiogenesis in vivo.

The method presented here can evaluate the effect of reagents on angiogenesis or vascular permeability in vivo without staining. The method uses dextran-FITC injection via the tail vein to visualize neo-vessels or vascular leakage.