Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation der Provinz Zhejiang (LY22H020005) und der National Natural Science Foundation of China (81873466) finanziert.

Alle Verfahren mit tierischen Probanden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Wenzhou Medical University genehmigt (XMSQ2021-0057, 19. Juli 2021). Alle Reagenzien und Verbrauchsmaterialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Vorbereitung des Nährmediums
<ol><li>10x M199-Nährmedium: M199-Pulver mit 90 ml deionisiertem Wasser auf 10-fache Konzentration auflösen und 10 ml fötales Kälberserum (FBS) hinzufügen, dann durch einen 0,22-μm-Filter passieren. Lagern Sie das Medium bis zu 2 Monate bei 4 °C.</li>
	<li>Vollständiges Endothelkulturmedium: Fügen Sie 50 ml FBS, 5 ml Penicillin/Streptomycin und 5 ml Endothelzellwachstumsergänzung zu 460 ml Endothelzellmedium (ECM) hinzu. Lagern Sie das Medium bis zu 1 Monat bei 4 °C.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Gefäßzellen
<ol><li>Kultivierung von 1 x 105 Gefäßzellen (primär kultivierte endotheliale Vorläuferzellen14, Endothelzellen oder Endothelzelllinien) mit 8 ml vollständigem Endothelkulturmedium in einer 100-mm-Gewebekulturschale bei 37 °C und 5 % CO2 bis 70 % Konfluenz.</li>
	<li>Entfernen Sie das Kulturmedium und spülen Sie die Schale 2x mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aus, um nicht anhaftende Zellen und Ablagerungen zu entfernen. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 3 ml 0,25% Trypsin mit 2,21 mM EDTA hinzu und inkubieren Sie es 1 Minute lang bei 37 °C.</li>
	<li>Neutralisieren Sie das Trypsin mit 7 ml vollständigem endothelialem Kulturmedium und spülen Sie die Zellen vorsichtig von der Kulturschale ab. Bestätigen Sie die Zellablösung unter einem Lichtmikroskop (40-fache Vergrößerung).</li>
	<li>Zellsuspension in einem 15-ml-Röhrchen sammeln und 10 Minuten bei 400 x g zentrifugieren. Überstand entfernen und Zellen mit 5 ml vollständigem endothelialem Kulturmedium resuspendieren.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und geben Sie die Suspension mit 2 x 106 Zellen in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen. Jeder Stopfen enthält 1,5 x 106 Zellen, zusätzliche 25% Zellen werden im Falle von Abfall verwendet. Jede Gruppe enthält mindestens 3 Stecker. HINWEIS: Nach Versuchen wurde festgestellt, dass 1,5 x 106 Zellen in 300 μl Matrixgel zur ordnungsgemäßen Entwicklung der Angiogenese führten, und wurde daher für Experimente ausgewählt.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 x g für 5 Minuten, um die Zellen zu pelletieren, und entfernen Sie dann den Überstand.</li>
</ol>3. Matrix-Gel-Vorbereitung
<ol><li>Sterile 1,5-ml-Röhrchen mit Zellpellets in einem 4 °C-Wasserbad vorkühlen. 30 g 1 ml Insulinspritzen in einem 4 °C-Kühlschrank vorkühlen.</li>
	<li>Matrix-Gel in einem 4 °C warmen Wasserbad vollständig auftauen. Nicht mischen oder wirbeln. 10x M199 vorkühlen und Reagenz/Drug-of-Interest in einem 4 °C warmen Wasserbad testen.</li>
	<li>Mischen Sie vorgekühltes Matrixgel mit 10x M199 mit 10% FBS und dem zu testenden Reagenz bei einem Volumenverhältnis von 8,8:1:0,2, um ein Matrixgel und eine M199-Mischung mit 1% FBS und dem Reagenz zu erhalten.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen mit 400 μl der Matrixgelmischung und mischen Sie sie vorsichtig, um Blasenbildung zu vermeiden. Halten Sie das Röhrchen auf Eis, bis die Mäuse für die Injektion vorbereitet sind. Halten Sie die Matrix-Gel-Mischung die ganze Zeit auf Eis, um eine Gerinnung zu vermeiden. HINWEIS: Hier wurden 300 μl Matrixgelmischung mit 1,5 x 106 Zellen verwendet, um einen Gelpfropfen zu bilden. Bereiten Sie 25% zusätzliches Gel entsprechend 25% zusätzlichen Zellen in Schritt 2 vor.</li>
</ol>4. Vorbereitung der Maus
<ol><li>Betäuben Sie 6-8 Wochen alte männliche Nu/Nu-Maus (18-25 g) in der Kammer des Tieranästhesiegeräts mit Isofluran (3% Isofluran in 100% Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1 l/min). Nach erfolgreicher Anästhesie, bestätigt durch das Fehlen von Aufrichtreflex und Zehenklemmreflex, bewegen Sie die Maus aus der Kammer, bewegen Sie die Maus aus der Kammer und setzen Sie eine Anästhesiemaske auf die Maus und ändern Sie die Isoflurankonzentration auf 1,5% in 100% Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1 l/min. HINWEIS: Bieten Sie dem Tier während des gesamten Vorgangs thermische Unterstützung mit einem Heizkissen.</li>
	<li>Verwenden Sie Tierarztsalbe auf den Augen, um Trockenheit zu vermeiden. Kleben Sie die Gliedmaßen der Mäuse in Bauchlage auf die Operationsplatine.</li>
</ol>5. Injektion von Matrix-Gel-Gemischen
<ol><li>Laden Sie 300 μl der Matrixgelmischung in eine 1 ml Insulinspritze mit einer 30G-Nadel. Vermeiden Sie Blasenbildung. Laden Sie das Matrixgel schnell (innerhalb von 2 Minuten), um eine Verfestigung während dieser Zeit zu vermeiden. Legen Sie die mit Matrixgel beladene Insulinspritze sofort auf Eis.</li>
	<li>Reinigen Sie die Haut auf dem Rücken von Mäusen mit 75%igen Alkoholpads. Injizieren Sie subkutan 300 μl Matrixgelmischung in eine Seite des Rückens von Mäusen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Nadel vorsichtig von der Injektionsstelle, um ein Auslaufen der Matrixgelmischung zu verhindern. Achten Sie auf einen kleinen Buckel an der Injektionsstelle (Abbildung 1).</li>
	<li>Legen Sie die Maus 2 Minuten lang auf das Heizkissen, damit die Matrix-Gel-Mischung gerinnen und einen Stopfen bilden kann.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 5.2. bis 5.4. , um einen Stecker auf der anderen Seite der Rückseite der Maus zu erstellen. Markieren Sie die Kanten der Höcker mit einem Filzstift.</li>
	<li>Beobachten Sie die Maus, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die Brustbeinlage aufrechtzuerhalten. Legen Sie die Maus in einen separaten Käfig, bis sie vollständig wiederhergestellt ist. Halten Sie die Mäuse im Versuchstierlabor der SPF-Klasse bei 22 ± 2 °C mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus für 7 Tage.</li>
</ol>6. Dextran-FITC-Injektion durch die Schwanzvene
<ol><li>Nach 7 Tagen Matrixgel-Injektion werden 0,5 mg Dextran-FITC mit 500 μl doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) resuspendiert und dann heftig vortexen, um die Dextran-FITC-Lösung mit der Endkonzentration von 1 μg/μl zu erhalten. HINWEIS: Verwenden Sie Dextran-FITC mit einem Molekulargewicht von ~150 kDa für den Angiogenese-Assay und verwenden Sie Dextran-FITC mit einem Molekulargewicht von ~4 kDa für den Gefäßpermeabilitätstest.</li>
	<li>Laden Sie 50 μl Dextran-FITC-Lösung in die 29G-Spritzen.</li>
	<li>Befestigen Sie die Maus am Schwanzvenen-Injektionsinstrument. Reinigen Sie den Schwanz mit einem Wattebausch mit 75 % Alkohol und injizieren Sie vorsichtig 50 μl Dextran-FITC durch die Schwanzvene.</li>
	<li>Drücken Sie die Injektionsstelle 1 Minute lang mit einem Wattestäbchen zusammen, um die Blutung zu stillen, und setzen Sie die Mäuse dann für 30 Minuten wieder in den Käfig.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 6.3. und 6.4. bis alle Mäuse eine Dextran-FITC-Injektion erhalten haben.</li>
</ol>7. Matrix-Gel-Plug-Kollektion
<ol><li>Intraperitoneal injizieren Sie 1% Pentobarbital-Natrium in PBS (200 mg/kg Körpergewicht) und euthanasieren Sie die Mäuse mit einem von der IACUC zugelassenen Verfahren.</li>
	<li>Schneiden Sie die Haut entlang des markierten Randes des Plugs mit einer chirurgischen Schere ab und entfernen Sie die Haut über dem Matrix-Gel-Plug.</li>
	<li>Sammeln Sie den Stopfen und spülen Sie ihn in einem kleinen Becherglas mit 1x PBS aus, um überschüssiges Blut abzuwaschen (Abbildung 2A). Die Farbe des Pfropfens kann grob den Grad der Bluthäufigkeit und den Inhalt der Neogefäße beschreiben (Abbildung 3A).</li>
</ol>8. Einbettung des Matrix-Gel-Plugs und Schnittvorbereitung
<ol><li>Decken Sie den Knopf der Gewebeeinbettungskassette mit etwa 0,5 ml Gewebeeinbettungsgel ab und setzen Sie dann sofort den Matrix-Gel-Stopfen in der gewünschten Ausrichtung auf das Gewebeeinbettgel, wie in Abbildung 2B gezeigt. Betten Sie dann den Plug mit zusätzlichem Gewebeeinbettungsgel ein.</li>
	<li>Legen Sie die Kassetten für 12 h in einen -80 °C Gefrierschrank, damit sie fest werden.</li>
	<li>Für die Dickschliffpräparation nehmen Sie den erstarrten Pfropfenblock heraus und schneiden Sie mit dem Gefriermikrotom gemäß der Anleitung 12 μm dicke Schnitte und montieren Sie sie auf Objektträger.</li>
	<li>Schneiden Sie 5-10 Abschnitte von jedem Steckblock ab.</li>
</ol>9. Quantifizierung der Angiogenese (Abbildung 3)
<ol><li>Erfassen Sie Fluoreszenzbilder von 5 unabhängigen Feldern des Schnitts mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop bei 488 nm Wellenlänge unter 10-facher Vergrößerung.</li>
	<li>Öffnen Sie die Bilddatei mit der Image J-Software (https://imagej.en.softonic.com/) und klicken Sie auf die Schaltfläche Angiogenese-Analyse . Klicken Sie dann auf die Schaltfläche HUVEC-Phasenkontrast analysieren und wechseln Sie zur Tabelle der Statistikergebnisse , um Informationen zu sammeln. Messen Sie alle 5 aufgenommenen Fluoreszenzbilder für jeden Abschnitt.</li>
	<li>Analysieren Sie die Gesamtlänge der Neogefäße aus verschiedenen Gruppen, um den Unterschied in der Angiogenese zwischen diesen Gruppen statistisch zu bewerten. HINWEIS: Die Gesamtlänge der Mastersegmente gibt die Gesamtlänge von Neo-Schiffen an. Das Reagenz, das die Länge der Neogefäße erhöht, wird als pro-angiogen bezeichnet, während das Reagenz, das die Länge der Neogefäße verringert, anti-angiogen ist.</li>
</ol>10. Quantifizierung der Gefäßpermeabilität (Abbildung 4)
<ol><li>Erfassen Sie Fluoreszenzbilder aus 5 unabhängigen Feldern des Schnitts mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop bei 488 nm Wellenlänge unter 20-facher Vergrößerung.</li>
	<li>Öffnen Sie die Image-Datei mit der Image J-Software. Klicken Sie auf die Schaltfläche Freihandauswahl und kreisen Sie den Leckagebereich ein, klicken Sie dann auf das Menü Analysieren und wählen Sie die Option Messen , um die Flächeninformationen des Leckagebereichs zu erhalten. Verwenden Sie das Verhältnis von Leckagefläche und Bildbereich, um die Gefäßpermeabilität anzuzeigen.</li>
	<li>Analysieren Sie das Verhältnis von Leckagefläche und Bildfläche aus verschiedenen Gruppen, um den Unterschied in der Gefäßpermeabilität zwischen diesen Gruppen statistisch zu bewerten.</li>
</ol>

Vereinfachung von Angiogenese-Studien mit einem modifizierten Matrix-Gel-Plug-Assay

<ol>
	<li>Bikfalvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+and+conceptual+developments+in+vascular+biology+and+angiogenesis+research:+a+personal+view.">History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view.</a> Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+mechanisms+of+vessel+normalization+for+cancer+and+other+angiogenic+diseases.">Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases.</a> Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).</li><li>De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumour+angiogenesis.">Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis.</a> Nature reviews Cancer. 17 (8), 457-474 (2017).</li><li>Griffioen, A., Molema, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis:+potentials+for+pharmacologic+intervention+in+the+treatment+of+cancer,+cardiovascular+diseases,+and+chronic+inflammation.">Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation.</a> Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).</li><li>Viallard, C., Larriv&#233;e, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis+and+vascular+normalization:+alternative+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets.</a> Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).</li><li>Craig, M., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETS+transcription+factors+in+embryonic+vascular+development.">ETS transcription factors in embryonic vascular development.</a> Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).</li><li>Losordo, D., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+angiogenesis+and+vasculogenesis+for+ischemic+disease.+Part+I:+angiogenic+cytokines.">Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines.</a> Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-angiogenesis-new+concept+for+therapy+of+solid+tumors.">Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors.</a> Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer,+vascular,+rheumatoid+and+other+disease.">Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease.</a> Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opinion+-+Angiogenesis:+an+organizing+principle+for+drug+discovery.">Opinion - Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).</li><li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1&#946;+augments+the+angiogenesis+of+endothelial+progenitor+cells+in+an+NF-&#954;B/CXCR7-dependent+manner.">Interleukin-1&#946; augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-&#954;B/CXCR7-dependent manner.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).</li><li>Dai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+transcriptional+upregulation+of+IDH2+to+tune+mitochondrial+dynamics+and+rescue+angiogenic+function+of+diabetic+EPCs.">Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs.</a> Redox Biology. 56, 102449 (2022).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liraglutide+Improves+the+Angiogenic+Capability+of+EPC+and+Promotes+Ischemic+Angiogenesis+in+Mice+under+Diabetic+Conditions+through+an+Nrf2-Dependent+Mechanism.">Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism.</a> Cells. 11 (23), 3821 (2022).</li><li>Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three+dimensional+collagen+matrix+models+of+endothelial+lumen+formation+during+vasculogenesis+and+angiogenesis.">In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis.</a> Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).</li><li>Malinda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+matrigel+migration+and+angiogenesis+assay.">In vivo matrigel migration and angiogenesis assay.</a> Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays.">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li><li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF21+promotes+ischaemic+angiogenesis+and+endothelial+progenitor+cells+function+under+diabetic+conditions+in+an+AMPK/NAD+-dependent+manner.">FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).</li><li>Gavard, J., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+controls+endothelial-cell+permeability+by+promoting+the+beta-arrestin-dependent+endocytosis+of+VE-cadherin.">VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin.</a> Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).</li><li>Birdsey, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+transcription+factor+ERG+promotes+vascular+stability+and+growth+through+Wnt/&#946;-catenin+signaling.">The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/&#946;-catenin signaling.</a> Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+CXCR4+antagonist+enhances+angiogenesis+via+modifying+the+ischaemic+tissue+environment.">A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Wir präsentieren eine zuverlässige und komfortable Methode zur quantitativen Bewertung der Angiogenese in vivo ohne Färbung. In diesem Protokoll wurden Gefäßzellen in Gegenwart von pro-angiogenen oder anti-angiogenen Reagenzien mit Matrixgel gemischt und dann subkutan in den Rücken von Nu/Nu-Mäusen injiziert, um einen Gelpfropfen zu bilden (Abbildung 1). Nach 7 Tagen Gelpfropfenbildung wurde Dextran-FITC intravenös injiziert und 30 Minuten lang zirkuliert. Der Gelpfropfen wu...

Die Angiogenese, der Prozess der Bildung von Neogefäßen aus bereits bestehenden Gefäßen, spielt eine entscheidende Rolle bei vielen physiologischen und pathologischen Prozessen wie Embryonalentwicklung, Wundheilung, Arteriosklerose, Tumorentwicklung usw.1,2,3,4,5. Dieser dynamische Prozess umfasst mehrere Schritte, darunter den Abbau der Matrix, die Proliferation von Gefäßzellen, die Migration und Selbstorganisation zu röhrenförmigen Strukturen sowie die Stabilisierung der Neogefäße6. Die Förderung der Angiogenese hat sich bei der Behandlung von Myokardinfarkt, Schlaganfall und anderen Arten von ischämischen Erkrankungen als entscheidend erwiesen7, während die Hemmung der Angiogenese als vielversprechende Strategie bei der Behandlung von Krebs8 und rheumatoiden Erkrankungen9 angesehen wurde. Die Angiogenese wurde als Organisationsprinzip für die Arzneimittelforschung angesehen10. Daher ist die Konstruktion einer zuverlässigen und bequemen Methode zur Beurteilung des Ausmaßes der Angiogenese für die mechanische Forschung oder die Arzneimittelforschung bei Angiogenese-abhängigen Erkrankungen von entscheidender Bedeutung.
Es wurden mehrere In-vitro- und In-vivo-Modelle entwickelt, um die Angiogenesezu bewerten 11. Unter diesen können zweidimensionale (2-D) Modelle, wie der Matrix-Gel-Röhrchenbildungsassay12, keine funktionellen röhrenförmigen Strukturen bilden. Die Tiermodelle, wie z. B. das Ischämie-Modellder Hintergliedmaßen 13,14, können den Angiogeneseprozess reproduzieren, sind jedoch komplex und erfordern ein Laser-Speckle-Blutfluss-Bildgebungssystem. 3D-Modelle der vaskulären Morphogenese, wie der Matrix-Gel-Plug-Assay, bieten eine einfache Plattform, die den Prozess der Angiogenese in vivo nachahmen kann 15, aber der Nachweis der Angiogenese erfordert Immunhistochemie oder Immunfluoreszenzfärbung 16,17,18, die variabel und schlecht visualisiert sind.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für einen modifizierten Matrix-Gel-Plug-Assay, bei dem Gefäßzellen mit Matrixgel gemischt und subkutan in den Rücken von Mäusen injiziert wurden, um einen Plug zu bilden. Im Pfropfen müssen Gefäßzellen die Matrix abbauen, sich vermehren, migrieren und sich selbst organisieren, um schließlich funktionsfähige Gefäße mit Blutfluss in der inneren Umgebung zu bilden. Danach wird fluoreszenzmarkiertes Dextran über die Schwanzvene injiziert, um durch den Pfropfen zu fließen, und die Markierung wird visualisiert, um Neogefäße anzuzeigen. Der Gehalt an Angiogenese kann quantitativ anhand der Länge der Gefäße bewertet werden. Diese Methode kann funktionelle Gefäße bilden, die in 2-D-Angiogenesemodellen12 nicht hergestellt werden können, und erfordert keinen komplexen Färbeprozess wie bei gewöhnlichem Matrix-Gel-Plug-Assay11. Es erfordert auch keine teuren spezifischen Instrumente wie das Laser-Speckle-Blutfluss-Bildgebungssystem bei der Ischämie der HintergliedmaßenModell 13,14,19. Diese Methode ist vielseitig, kostengünstig, quantifizierbar und einfach durchzuführen und kann zur Bestimmung der pro- oder antiangiogenen Fähigkeit von Arzneimitteln oder in der mechanischen Forschung zur Angiogenese verwendet werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>188105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia System</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R640-S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoslicer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CryoStar NX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans-FITC-150kDa</td>
			<td>WEIHUA BIO</td>
			<td>WH007N07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans-FITC-4kDa</td>
			<td>WEIHUA BIO</td>
			<td>WH007N0705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Cassettes</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>80203-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Medium</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>35809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Supplements</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10100147C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor 1</td>
			<td>AtaGenix</td>
			<td>9043p-082318-A01</td>
			<td>FGF1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>Boruida</td>
			<td>30-50-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>300841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory&#160;Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>BSA124S-CW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td>Matrix gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31100-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound</td>
			<td>SUKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue embedding gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitate Acid</td>
			<td>KunChuang</td>
			<td>KC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Liquid</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments</td>
			<td>RWD</td>
			<td>RWD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tail Vein Injection Instrument</td>
			<td>KEW BASIS</td>
			<td>KW-XXY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T1320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Temperature Freezer</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>U410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Endothelial Growth Factor</td>
			<td>CHAMOT</td>
			<td>CM058-5HP</td>
			<td>VEGF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified in vivo matrix gel plug assay for angiogenesis studies

Es wurden mehrere Modelle entwickelt, um die Angiogenese in vivo zu untersuchen. Die meisten dieser Modelle sind jedoch komplex und teuer, erfordern spezielle Geräte oder sind für die anschließende quantitative Analyse schwer durchzuführen. Hier präsentieren wir einen modifizierten Matrix-Gel-Plug-Assay zur Bewertung der Angiogenese in vivo. In diesem Protokoll wurden Gefäßzellen in Gegenwart oder Abwesenheit von pro-angiogenen oder anti-angiogenen Reagenzien mit Matrixgel gemischt und dann subkutan in den Rücken der Empfängermäuse injiziert. Nach 7 Tagen wird Phosphatpuffer-Kochsalzlösung, die Dextran-FITC enthält, über die Schwanzvene injiziert und 30 Minuten lang in den Gefäßen zirkuliert. Matrix-Gel-Plugs werden gesammelt und mit Gewebeeinbettungsgel eingebettet, dann werden 12-μm-Abschnitte für die Fluoreszenzdetektion ohne Färbung geschnitten. In diesem Assay kann Dextran-FITC mit hohem Molekulargewicht (~150.000 Da) verwendet werden, um funktionelle Gefäße zum Nachweis ihrer Länge anzuzeigen, während Dextran-FITC mit niedrigem Molekulargewicht (~4.400 Da) verwendet werden kann, um die Permeabilität von Neogefäßen anzuzeigen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll eine zuverlässige und bequeme Methode für die quantitative Untersuchung der Angiogenese in vivo bieten kann.

Angiogenesis, the process of formation of neo-vessels from pre-existing vessels, plays a critical role in many physiological and pathological processes, such as embryonic development, wound healing, atherosclerosis, tumor development, etc.1,2,3,4,5. This dynamic process involves several steps, including the degradation of the matrix, vascular cell proliferation, migration and self-organization to form tubular structures and the stabilization of the neo-vessels6. Promoting angiogenesis has been demonstrated to be critical in the treatment of myocardial infarction, stroke and other kinds of ischemic diseases7 while inhibiting angiogenesis has been considered a promising strategy in the treatment of cancers8 and rheumatoid diseases9. Angiogenesis has been considered an organizing principle for drug discovery10. Thus, the construction of a reliable and convenient method to assess the extent of angiogenesis is critical for mechanical research or drug discovery in angiogenesis-dependent diseases.
Several in vitro and in vivo models have been developed to evaluate angiogenesis11. Among these, two-dimensional (2-D) models, like matrix gel tube formation assay12, cannot form functional tubular structures. The animal models, such as the hind limb ischemia model13,14, can reproduce the angiogenesis process but are complex and require a laser speckle blood flow imaging system. 3D models of vascular morphogenesis, like matrix gel plug assay, provide a simple platform that can mimic the process of angiogenesis in vivo15, but the detection of angiogenesis requires immunohistochemistry or immunofluorescence staining16,17,18, which are variable and poorly visualized.
Here, we describe a protocol for a modified matrix gel plug assay where vascular cells were mixed with matrix gel and subcutaneously injected into the back of mice to form a plug. In the plug, vascular cells need to degrade the matrix, proliferate, migrate, and self-organize to finally form functional vessels with blood flow in the internal environment. Thereafter, fluorescent-labeled dextran is injected via the tail vein, to flow through the plug, and the label is visualized to indicate neo-vessels. The content of angiogenesis can be quantitatively evaluated by the length of the vessels. This method can form functional vessels that cannot be produced in 2-D angiogenesis models12, and does not need complex stain process as in ordinary matrix gel plug assay11. It also does not require expensive specific instruments like laser speckle blood flow imaging system in hind limb ischemia model13,14,19. This method is versatile, low-cost, quantifiable, and easy to perform, and can be used to determine the pro- or anti-angiogenic capability of drugs or be used in mechanical research involved in angiogenesis.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der Angiogenese und Gefäßpermeabilität durch einen modifizierten Matrix-Gel-Plug-Assay

Modifizierter In-vivo-Matrix-Gel-Plug-Assay für Angiogenese-Studien

Abbildung 1 zeigt das Flussdiagramm, wie die Mischung aus Matrixgel, Gefäßzellen, Kulturmedium und Reagenz hergestellt wird. Die Mischung wurde dann subkutan in den Rücken von Nu/Nu-Mäusen injiziert und mit einem Heizkissen erhitzt, um die Gerinnung zu beschleunigen und schließlich einen Gelpfropfen zu bilden.
Abbildung 2A ist das Flussdiagramm zur Anzeige von Gefäßen mit fluoreszenzmarkiertem Dextran. Fluoreszenzmarkiertes Dex...

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Die hier vorgestellte Methode kann die Wirkung von Reagenzien auf die Angiogenese oder die Gefäßpermeabilität in vivo ohne Färbung bewerten. Die Methode verwendet die Dextran-FITC-Injektion über die Schwanzvene, um Neogefäße oder Gefäßleckagen sichtbar zu machen.

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized ...

Unsere Forschung befasst sich mit der Angiogenese, dem Prozess der Bildung neuer Gefäße aus bereits bestehenden Gefäßen. Es spielt eine entscheidende Rolle bei vielen physiologischen und pathologischen Prozessen, wie z. B. der Embryonalentwicklung oder der Heilung von Arteriosklerose, Tumorentwicklung usw. Die Konstruktion eines zuverlässigen Modells zur Bewertung des Ausmaßes der Angiogenese ist entscheidend für die Myokardforschung oder die Entdeckung von Medikamenten für angiogeneseabhängige Krankheiten.Die meisten der vorhandenen Modelle sind jedoch komplex, teuer und erfordern spezielle Ausrüstung. Hier stellen wir einen modifizierten Matrix-Gel-Plug-Assay vor, mit dem Angiogenese und Gefäßpermeabilität ohne Färbung auf einfache, intuitivere und effizientere Weise untersucht werden können.

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Research

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Biology

Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies

583 Aufrufe.  Pingyang Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University. Unsere Forschung befasst sich mit der Angiogenese, dem Prozess der Bildung neuer Gefäße aus bereits bestehenden Gefäßen. Es spielt eine entscheidende Rolle bei vielen physiologischen und pathologischen Prozessen, wie z. B. der Embryonalentwicklung oder der Heilung von Arteriosklerose, Tumorentwicklung usw. Die Konstruktion eines zuverlässigen Modells zur Bewertung des Ausmaßes der Angiogenese ist entscheidend für die Myokardforschung oder die Entdeckung von Medikamenten für angiogenes...

Serie: Autor im Rampenlicht: Untersuchung der Angiogenese und Gefäßpermeabilität durch einen modifizierten Matrix-Gel-Plug-Assay

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized equipment, or are hard to perform for subsequent quantitative analysis. Here we present a modified matrix gel plug assay to evaluate angiogenesis in vivo. In this protocol, vascular cells were mixed with matrix gel in the presence or absence of pro-angiogenic or anti-angiogenic reagents, and then subcutaneously injected into the back of recipient mice. After 7 days, phosphate buffer saline containing dextran-FITC is injected via the tail vein and circulated in vessels for 30 min. Matrix gel plugs are collected and embedded with tissue embedding gel, then 12 &#181;m sections are cut for fluorescence detection without staining. In this assay, dextran-FITC with high molecular weight (~150,000 Da) can be used to indicate functional vessels for detecting their length, while dextran-FITC with low molecular weight (~4,400 Da) can be used to indicate the permeability of neo-vessels. In conclusion, this protocol can provide a reliable and convenient method for the quantitative study of angiogenesis in vivo.

The method presented here can evaluate the effect of reagents on angiogenesis or vascular permeability in vivo without staining. The method uses dextran-FITC injection via the tail vein to visualize neo-vessels or vascular leakage.