نشكر الدكتور شياو فان على المناقشات المفيدة أثناء إنشاء هذه الأساليب في Scripps Research. تم دعم B.B. من خلال زمالة أبحاث ما بعد الدكتوراه من مؤسسة هيويت للأبحاث الطبية. يتم دعم WC من قبل زمالة ما قبل الدكتوراه في مؤسسة العلوم الوطنية. يتم دعم D.E.P من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة (NIH) NS095892 إلى GCL تم دعم هذا المشروع أيضا من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة GM142196 و GM143805 و S10OD032467 إلى G.C.L.

طلاء شبكات TEM بطبقة أحادية من الجرافين

<ol>
	<li>Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+electron+dose+rate+on+electron+counting+images+recorded+with+the+K2+camera.">Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera.</a> Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 1-22 (2018).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoSPARC:+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy.">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li><li>Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+individual+atoms+of+protein+complex+by+cryo-electron+microscopy.">Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy.</a> Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).</li><li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM.">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).</li><li>Schultz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens.">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).</li><li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+blot-and-plunge+freezing+of+biological+specimens+for+single-particle+cryogenic+electron+microscopy.">Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).</li><li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins,+interfaces,+and+cryo-em+grids.">Proteins, interfaces, and cryo-em grids.</a> Current Opinion in Colloid &amp; Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).</li><li>Glaeser, R. M., Han, B. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opinion:+hazards+faced+by+macromolecules+when+confined+to+thin+aqueous+films.">Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films.</a> Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).</li><li>Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer-crystal+streptavidin+support+films+provide+an+internal+standard+of+cryo-EM+image+quality.">Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality.</a> Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography.">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, 1-42 (2018).</li><li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation.">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).</li><li>Liu, N., Wang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+cryo-EM+specimen+preparation:+how+to+deal+with+the+air-water+interface.">Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface.</a> Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926 (2022).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM.">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).</li><li>Palovcak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+robust+procedure+for+preparing+graphene-oxide+cryo-EM+grids.">A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).</li><li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids.">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+carbon+films+with+~500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device.">Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li><li>Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene+oxide:+A+substrate+for+optimizing+preparations+of+frozen-hydrated+samples.">Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples.</a> Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).</li><li>Pantelic, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene:+substrate+preparation+and+introduction.">Graphene: substrate preparation and introduction.</a> Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).</li><li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+an+optimal+specimen+support+for+electron+cryomicroscopy.">Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).</li><li>Passmore, L. A., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+preparation+for+high-resolution+cryo-EM.">Specimen preparation for high-resolution cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+monolayer+graphene+grids+for+near-atomic+resolution+cryoelectron+microscopy.">High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).</li><li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+ultraclean+atomically+thin+membranes+for+atomic-resolution+electron+microscopy.">Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 541 (2020).</li><li>Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Batch+production+of+high-quality+graphene+grids+for+cryo-EM:+cryo-EM+structure+of+Methylococcus+capsulatus+soluble+methane+monooxygenase+hydroxylase.">Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase.</a> bioRxiv. (Cvd), (2021).</li><li>Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy.">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li><li>Fan, H., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+graphene+grids+for+cryoelectron+microscopy.">Developing graphene grids for cryoelectron microscopy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253 (2022).</li><li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it.">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> eLife. 8, e42747 (2019).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+copper+step+beams+during+graphene+growth+by+CVD+method.">Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method.</a> Applied Surface Science. 610, 155518 (2023).</li><li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+thin+ice+on+ultraflat+graphene+for+high-resolution+cryo-EM.">Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM.</a> Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).</li><li>Fujita, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxidized+graphene+grid+for+highly+efficient+high-resolution+cryoEM+structural+analysis.">Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis.</a> Scientific Reports. 13, 2279 (2023).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalized+graphene+grids+with+various+charges+for+single-particle+cryo-EM.">Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM.</a> Nature Communications. 13, 6718 (2022).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

يعد الحفاظ على العينات البيولوجية في طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي خطوة مهمة للغاية لتحديد بنية cryoEM عالية الدقة. ومع ذلك ، غالبا ما يواجه الباحثون مشاكل ناشئة عن التفاعلات مع AWI ، والتي تقدم الاتجاه المفضل ، والتفكيك المعقد ، والتمسخ ، والتجميع. علاوة على ذلك ، لا يمكن دائما تركيز العينات بشكل كاف لملء الجليد الرقيق المعلق عبر ثقوب فيلم محصن. طورت العديد من المجموعات البحثية طرقا لطلاء شبكات EM بطبقة أحادية من الجرافين للمساعدة في التغلب على بعض هذه القيود24،25،26،27،28،29،30 ، وقد تم استخدام شبكات الجرافين بنجاح كبير. هنا ، نقدم إرشادات خطوة بخطوة لإعداد دفعات شبكات الجرافين بشكل فعال داخل الشركة وفحص جودة شبكات الجرافين بواسطة TEM. ونشدد على أنه ينبغي توخي الحذر بشكل خاص خلال بعض الخطوات الحاسمة، التي نوجزها أدناه.
الجرافين لديه ميل قوي لجذب الملوثات المحمولة جوا. لذلك ، أثناء عملية تصنيع شبكة الجرافين ، من المهم التأكد من أن جميع الأدوات التي تتلامس مع ورقة الجرافين / النحاس أو الشبكات نظيفة وخالية من الغبار. يمكن تنظيف أغطية الزجاج المستخدمة لنقل الجرافين عن طريق الشطف بالإيثانول وماء DI أو باستخدام منفضة الهواء. ينصح أيضا بالعمل تحت غطاء دخان والحفاظ على صفائح وشبكات الجرافين مغطاة بورق أو لوحة زجاجية نظيفة في جميع الأوقات. قد يمنع الغبار أو الملوثات الموجودة على الشبكات الجرافين من الالتصاق التام بشبكات EM. عند التعامل مع الشبكات المطلية بالجرافين أو الجرافين ، من المهم أن تكون مؤرضة كهربائيا لمنع تلف فيلم الجرافين من التفريغ الساكن. يمكن تجنب التفريغ الساكن باستخدام حزام تأريض المعصم ، ولمس جسم معدني مؤرض في كل مرة يتم فيها التعامل مع شبكات الجرافين أو الجرافين ، و / أو عدم ارتداء قفاز على اليد التي تحمل الملقط24.
نظرا لأن الطبقة الأحادية من الجرافين رقيقة جدا (عرض ذرة الكربون) ، فمن المهم دعم الجرافين بطبقة عضوية مثل MMA أو poly-MMA (PMMA) أثناء نقل الجرافين إلى الشبكات. PMMA هي المادة الأكثر استخداما لنقل الجرافين. ومع ذلك ، فإن PMMA له تقارب قوي مع الجرافين ويمكن أن يؤدي في كثير من الأحيان إلى تلوث البوليمر على فيلم الجرافين. يستخدم MMA في هذا البروتوكول ، لأنه يترك تلوثا أقلمتبقيا 25. ومع ذلك ، فإن كلا من PMMA و MMA لهما عيب في تكوين التجاعيد والشقوق التي يمكن ملاحظتها في بعض مناطق فيلم الجرافين (الشكل 3 ب). قد يكون من الصعب تجنب هذه التجاعيد لأنها تحدث عادة أثناء نمو الجرافين بطريقة الأمراض القلبية الوعائية31. تم تطوير طريقة مؤخرا لزراعة الجرافين المسطح للغاية بدون تجاعيد ، حيث يتم استبدال رقائق النحاس برقاقة Cu (111) / الياقوت كركيزة نمو32.
بناء على تجربتنا ، من الأفضل شراء صفائح الجرافين / النحاس ودعم الجرافين باستخدام MMA داخليا بدلا من شراء صفائح الجرافين المغطاة بالبوليمر من الشركات المصنعة ، والتي تصبح هشة بعد النقش على النحاس ويصعب التعامل معها في الخطوات اللاحقة. يمكن بناء طلاء الدوران الذي استخدمناه لطلاء MMA بثمن بخس باستخدام أجزاء من متجر كمبيوتر / جهاز كمبيوتر محلي ، كما هو موضح سابقا25.
أثناء خطوة طلاء MMA ، من المهم تغطية كامل سطح الجرافين على لوح Cu-graphene باستخدام MMA. بعد حفر النحاس بعيدا ، سيصبح MMA-graphene شبه شفاف ، وستبدو المناطق التي تفتقر إلى تغطية MMA وكأنها ثقوب فارغة. لمنع طلاء MMA على الجانب النحاسي ، من المهم وضع قطعة صغيرة من الورق النشاف تحتها أثناء الطلاء بحيث تمتص أي MMA زائد ينبثق من فيلم CVD.
بعد النقش والشطف ، تكون ورقة MMA / الجرافين جاهزة للنقل إلى شبكات EM باستخدام نظام حوض تجاري أو محلي الصنع مع حقنة أو مضخة تمعجية للتحكم في مستوى الماء. قبل خطوة النقل ، من المهم شطف الشبكات جيدا في الحمامات المتتالية من الكلوروفورم والأسيتون و IPA. يساعد خبز الشبكات المطلية بالجرافين عند 65 درجة مئوية في الحفاظ على سلامة الجرافين ويعزز امتصاص الجرافين للشبكات. أخيرا ، لمنع تلوث MMA على الشبكات ، من المهم إزالة MMA تماما في حمام الأسيتون وتنظيف الشبكات في IPA. سيتم ملاحظة أي بقايا MMA غير مغسولة على شبكات EM وتقليل نسبة الإشارة إلى الضوضاء للصور (الشكل 3C). يمكن تكرار عملية غسيل الأسيتون-IPA لتنظيف أسطح الجرافين بشكل أكبر.
لجعل شبكات الجرافين محبة للماء ، قمنا بتعريض الشبكات للأشعة فوق البنفسجية / الأوزون. قد تتطلب النماذج المختلفة لمنظفات الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون تحسينا لتزويد طبقة الجرافين بالأكسجين بشكل كاف لإعداد عينة cryoEM دون إتلاف الجرافين. بغض النظر عن النظام ، من الأهمية بمكان استخدام هذه الشبكات لتطبيق عينة cryoEM مباشرة بعد معالجة الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون. تم وصف الطرق البديلة لجعل شبكات الجرافين محبة للماء في دراسات أخرى33،34.

المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryoEM) هو تقنية قابلة للتطبيق بشكل متزايد تستخدم للتحقيق في هياكل 3D للجزيئات الحيوية. مكنت التطورات التكنولوجية في بصريات المجهر الإلكتروني ، والكشف المباشر عن الإلكترون1 ، وخوارزميات الكمبيوتر2،3،4 على مدار العقد الماضي مستخدمي cryoEM من تحديد هياكل المعقدات الجزيئية الكبيرة المستقرة كيميائيا إلى الدقة شبه الذرية5،6،7،8. على الرغم من هذه التطورات ، لا تزال هناك حواجز ملحوظة أمام الحفاظ على عينات التصوير بالتبريد ، والتي تمنع حل غالبية العينات البيولوجية إلى مثل هذه الدقة العالية.
يتضمن تحضير العينة لتحليل cryoEM عالي الدقة محاصرة الجزيئات الكبيرة الموزعة بالتساوي في مجموعة واسعة من الاتجاهات داخل طبقة رقيقة من الجليد المزجج. طرق "اللطخة والغطس" للتجميد هي أكثر الطرق المستخدمة على نطاق واسع لتوليد أغشية رقيقة من العينات البيولوجية على الشبكات لدراسات cryoEM 9,10. تتضمن هذه الطرق تطبيق بضعة ميكرولترات من محلول العينة على شبكة EM تحتوي على فيلم مزخرف تم تصنيعه محبا للماء ثم مسح غالبية العينة بورق الترشيح قبل غمر الشبكة بسرعة في كريوجين من خليط الإيثان السائل أو خليط الإيثانوالبروبان 9.
في حين تم استخدام هذه الطريقة بنجاح لتحديد هياكل مجموعة واسعة من العينات البيولوجية ، فإن جميع طرق تحضير العينات cryoEM شائعة الاستخدام تعرض العينات لواجهة الهواء والماء الكارهة للماء (AWI) ، والتي غالبا ما تقدم مشكلات تحد من تحديد الهيكل عالي الدقة. ثبت أن العينات البيولوجية لديها ميل كبير للتشوه عند تعرضها ل AWI ، مما قد يؤدي إلى تجميع وتفكيك معقد11،12،13،14. علاوة على ذلك ، تتسبب البقع الكارهة للماء على أسطح العينات البيولوجية في تبني الجسيمات للاتجاهات المفضلة في الجليد12. في العديد من السيناريوهات ، تجبر منطقة واحدة كارهة للماء في العينة جميع الجسيمات على تبني اتجاه واحد في الجليد ، وبالتالي إلغاء القدرة على توليد إعادة بناء موثوقة. بالإضافة إلى المشكلات المتعلقة ب AWI ، قد تظهر العينات تقاربا لسطح الطبقة المحفوزة من الفيلم ، مما يحد من عدد الجسيمات المعلقة في الجليد داخل الثقوب15.
تم تطوير العديد من الحلول المنهجية والتكنولوجية لتقليل هذه القضايا الناشئة عن التفاعلات مع AWI أو الأفلام16،17. تتمثل إحدى الطرق الشائعة في طلاء الفيلم المزخرف لشبكات EM بطبقة رقيقة (عشرات النانومترات) من الكربون غير المتبلور. يوفر هذا الطلاء سطحا مستمرا عبر الثقوب التي يمكن للجزيئات أن تمتز لها ، مع الاستفادة من حماية العينة جزئيا من التفاعلات مع AWI15،18،19،20. ومع ذلك ، فإن طبقة الكربون الإضافية ترفع من كمية إشارة الخلفية في المناطق المصورة ، مما يؤدي إلى حدوث ضوضاء يمكن أن تؤثر على الدقة التي يمكن تحقيقها ، خاصة بالنسبة للعينات الصغيرة (<150 كيلو دالتون). في السنوات الأخيرة ، ثبت أن استخدام رقائق أكسيد الجرافين (GO) لإنتاج أغشية داعمة على شبكات cryoEM له مزايا على الكربون غير المتبلور التقليدي. يتم إنتاج رقائق GO من خلال أكسدة طبقات الجرافيت ، مما ينتج عنه صفائح بلورية زائفة من الجرافيت أحادي الطبقة محبة للماء بسبب محتواها الكبير من الأكسجين في شكل مجموعات كربوكسيل وهيدروكسيل وإيبوكسي على الأسطح والحواف. رقائق GO التجارية في المعلقات المائية غير مكلفة ، وهناك العديد من الطرق المنشورة لتطبيق رقائق GO على شبكات EM18,21. ومع ذلك ، غالبا ما تؤدي هذه الطرق إلى شبكات مغطاة جزئيا فقط برقائق GO ، بالإضافة إلى المناطق التي تحتوي على طبقات متعددة من رقائق GO. علاوة على ذلك ، تساهم رقائق GO بإشارة خلفية ملحوظة لصور cryoEM قريبة من تلك التي لوحظت مع الكربون غير المتبلورالرقيق 22,23.
الجرافين أحادي الطبقة البكر ، والذي يتكون من مجموعة بلورية 2D واحدة من ذرات الكربون ، يختلف عن GO في أنه لا ينتج تباين الطور في المجهر الإلكتروني. وبالتالي يمكن استخدام الجرافين أحادي الطبقة لتوليد طبقة دعم غير مرئية لتصوير العينات البيولوجية. الجرافين أحادي الطبقة أقوى أيضا من GO ويمكن تطبيقه كطبقة أحادية واحدة على شبكة EM ، وقد جعلت التطورات الحديثة في تصنيع شبكات EM المطلية بالجرافين من الممكن إعداد شبكات الجرافين أحادية الطبقة عالية التغطية في المنزل24،25،26،27،28،29،30. ومع ذلك ، على الرغم من فوائد استخدام الشبكات المطلية بالجرافين لتحديد هيكل cryoEM ، إلا أنها لا تستخدم على نطاق واسع بسبب النفقات الباهظة للخيارات التجارية وتعقيد الإنتاج الداخلي. هنا ، نصف دليلا تفصيليا لإنتاج شبكات EM بشكل فعال مغطاة بطبقة أحادية من الجرافين لتحديد بنية cryoEM للعينات البيولوجية (الشكل 1). باتباع هذا البروتوكول المفصل ، يمكن لباحثي cryoEM إعداد العشرات من شبكات دعم الجرافين عالية الجودة في يوم واحد. يمكن فحص جودة الشبكات المطلية بالجرافين بسهولة باستخدام مجهر إلكتروني منخفض النهاية (TEM) مزود بخيوط LaB6.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70% EtOH</td>
			<td>Pharmco (190 pf EtOH)</td>
			<td>241000190CSGL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650501-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>215589-500g</td>
			<td>Hazardous; use extreme caution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2432-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamping TEM Grid Holder Block for 45 Grids</td>
			<td>PELCO</td>
			<td>16830-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer fan</td>
			<td>Amazon (Noctua)</td>
			<td>B07CG2PGY6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>Bellco Glass</td>
			<td>1203J71</td>
			<td>Standard cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallizing dish</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>3140-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronics duster</td>
			<td>Falcon Safety Products</td>
			<td>75-37-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Dust-off Air Duster</td>
			<td>Staples</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip tweezer</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0508-L4-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4980-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fork</td>
			<td>Supermarket</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphene/Cu</td>
			<td>Graphenea</td>
			<td>N/A</td>
			<td>CVD monolayer graphene cu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Coating Trough</td>
			<td>Ladd Research Industries</td>
			<td>10840</td>
			<td>Fragile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton Tape</td>
			<td>Amazon (MYJOR)</td>
			<td>MY-RZY001</td>
			<td>Polyimide tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long twzeer</td>
			<td>Cole Parmer Essentials</td>
			<td>UX-07387-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal grid holder</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16820-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMA(8.5)MMA EL 6</td>
			<td>KAYAKU Advanced Materials</td>
			<td>M31006 0500L 1GL</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 10 Lab Oven</td>
			<td>Quincy Lab, Inc.</td>
			<td>FO19013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>3610-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner (Solarus 950)</td>
			<td>Gatan, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fiskars</td>
			<td>194813-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Analog Orbital Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltrAuFoil R1.2/1.3 - Au300</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Holey gold grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet Ozone Cleaning Systems</td>
			<td>UVOCS</td>
			<td>model T10X10/OES</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of monolayer graphene-coated grids for cryoelectron microscopy

برز المجهر الإلكتروني المبرد (cryoEM) كتقنية قوية لفحص التركيب الذري للمجمعات الجزيئية الكبيرة. يتطلب تحضير العينة ل cryoEM حفظ العينات في طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي ، وعادة ما يتم تعليقها داخل فتحات فيلم دعم مزخرف. ومع ذلك ، فإن جميع طرق تحضير العينات شائعة الاستخدام لدراسات cryoEM تعرض العينة لواجهة الهواء والماء ، مما يؤدي إلى تأثير قوي كاره للماء على العينة التي غالبا ما تؤدي إلى تمسخ وتجميع وتفكك معقد. علاوة على ذلك ، تؤثر التفاعلات المفضلة الكارهة للماء بين مناطق العينة وواجهة الهواء والماء على الاتجاهات التي تعتمدها الجزيئات الكبيرة ، مما يؤدي إلى إعادة بناء 3D بدقة اتجاهية متباينة الخواص. 
وقد تبين أن امتزاز عينات cryoEM إلى طبقة أحادية من الجرافين يساعد في تخفيف التفاعلات مع واجهة الهواء والماء مع تقليل إدخال ضوضاء الخلفية. توفر دعامات الجرافين أيضا فائدة خفض التركيز المطلوب للبروتينات المطلوبة للتصوير بالتبريد. على الرغم من مزايا هذه الدعامات ، لا يتم استخدام الشبكات المطلية بالجرافين على نطاق واسع من قبل مجتمع cryoEM بسبب التكلفة الباهظة للخيارات التجارية والتحديات المرتبطة بالإنتاج الداخلي على نطاق واسع. تصف هذه الورقة طريقة فعالة لإعداد دفعات من شبكات cryoEM التي تتمتع بتغطية كاملة تقريبا من الجرافين أحادي الطبقة.

Single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) is an increasingly applicable technology used to investigate the 3D structures of biomacromolecules. Technological advances in electron microscope optics, direct electron detection1, and computer algorithms2,3,4 over the past decade have enabled cryoEM users to determine the structures of biochemically stable macromolecular complexes to near-atomic resolution5,6,7,8. Despite these advances, there remain notable barriers to preserving samples for cryoEM imaging, which prevent the majority of biological specimens from being resolved to such high resolutions.
Sample preparation for high-resolution cryoEM analysis involves trapping macromolecules that are evenly distributed in a wide range of orientations within a thin layer of vitrified ice. The &#34;blot and plunge&#34; methods of freezing are the most widely used methods employed to generate thin films of biological samples on grids for cryoEM studies9,10. These methods involve applying a few microliters of sample solution to an EM grid containing a fenestrated film that has been made hydrophilic and subsequently blotting away the majority of the sample with filter paper before rapidly plunging the grid into a cryogen of liquid ethane or ethane-propane mixture9.
While this method has successfully been used to determine structures of a wide range of biological specimens, all commonly used cryoEM specimen preparation methods expose specimens to the hydrophobic air-water interface (AWI), which often introduces&#160;issues that limit high-resolution structure determination. It is established that biological specimens have a high propensity to denature when exposed to the AWI, which can lead to complex aggregation and disassembly11,12,13,14. Furthermore, hydrophobic patches on the surfaces of biological specimens cause particles to adopt preferred orientations in the ice12. In many scenarios, a single hydrophobic region of the sample forces all particles to adopt a singular orientation in the ice, thereby abolishing the ability to generate a reliable reconstruction. In addition to issues with the AWI, specimens may demonstrate an affinity for the surface of the fenestrated layer of film, limiting the number of particles suspended in the ice within the holes15.
Several methodological and technological solutions have been developed to diminish these issues arising from interactions with the AWI or the films16,17. One popular approach is to coat the fenestrated film of the EM grids with a thin (tens of nanometers) layer of amorphous carbon. This coating provides a continuous surface across the holes to which particles can adsorb, with the benefit of partially shielding the sample from interactions with the AWI15,18,19,20. However, the additional carbon layer elevates the amount of background signal in the imaged regions, introducing noise that can compromise attainable resolution, particularly for small (&#60;150 kDa) specimens. In recent years, the use of graphene oxide (GO) flakes to produce supporting films on cryoEM grids has been shown to have advantages over traditional amorphous carbon. GO flakes are produced through the oxidation of graphite layers, resulting in pseudo-crystalline sheets of monolayer graphite that are hydrophilic due to their substantial oxygen content in the form of carboxyl, hydroxyl, and epoxy groups on the surfaces and edges. Commercial GO flakes in aqueous suspensions are inexpensive, and there are numerous published methods for applying GO flakes to EM grids18,21. However, these methods often result in grids that are only partially covered with GO flakes, as well as regions that contain multiple layers of GO flakes. Further, GO flakes contribute a noticeable background signal to cryoEM images that is close to that observed with thin amorphous carbon22,23.
Pristine monolayer graphene, which consists of a single 2D crystalline array of carbon atoms, is distinct from GO in that it does not produce phase contrast in the electron microscope. Monolayer graphene thus can be used to generate an invisible support layer for imaging biological samples. Monolayer graphene is also stronger than GO and can be applied as a single monolayer on an EM grid, and recent advancements in the fabrication of graphene-coated EM grids have made it possible to prepare high-coverage monolayer graphene grids in-house24,25,26,27,28,29,30. However, despite the benefits of using graphene-coated grids for cryoEM structure determination, they are not widely used due to the prohibitive expense of commercial options and the complexity of in-house production. Here, we describe a step-by-step guide to effectively producing EM grids covered with a monolayer of graphene for cryoEM structure determination of biological specimens (Figure 1). By following this detailed protocol, cryoEM researchers can reproducibly prepare dozens of high-quality graphene support grids in a single day. The quality of the graphene-coated grids can be readily examined using a low-end transmission electron microscope (TEM) equipped with a LaB6 filament.

تسليط الضوء على المؤلف: تحسين دقة CryoEM باستخدام الشبكات المطلية بالجرافين 

تصنيع شبكات أحادية الطبقة مطلية بالجرافين للمجهر الإلكتروني بالتبريد

Currently optimally preserving biological samples is a major challenge in obtaining high resolution CryoEM structures. During the sample preparation process, specimens are exposed to hydrophobic air-water interface, which has denaturing effects on the samples and can cause stable samples to adopt a preferential orientation in the ice, which prevents high resolution structure determination. Coating CryoEM grids with a thin layer of carbon of like soft graphene oxide, has been commonly used to address issues related to interactions with air-water interface.However, this layers often increase background noise in our images, which compromise the resolutions of our structure. Coating the grid with a monolayer of graphene accomplishes similar protection without introducing significant background noise. Using graphene-coated CryoEM grids can help overcome issues related to interactions with air-water interface, however, commercial graphene grids are expensive and many labs consider graphene grids to be too complicated to prepare in-house.Researchers in the CryoEM field can now use this step-by-step protocol to reproduce fully produced dozens of high quality graphenes in one day.

سيؤدي التنفيذ الناجح لبروتوكول تصنيع شبكة الجرافين الموصوف هنا إلى شبكات EM مغلفة بالكامل بطبقة أحادية واحدة من الجرافين. يمكن التحقق من تغطية الجرافين للشبكات باستخدام أي TEM. نظرا لأن الطبقة الأحادية من الجرافين النظيف غير مرئية تقريبا في TEM ، يجب على المرء فحصها باستخدام وضع الحيود للمجهر ومراقبة بقع Bragg المقابلة للتنظيم السداسي لذرات الكربون التي تشكل الجرافين (الشكل 3A). من الطبيعي أن نلاحظ أحيانا بعض تجاعيد الجرافين أحادي الطبقة ، والتي يتم إدخالها أثناء طلاء MMA (الشكل 3 ب). يمكن للمرء أيضا التحقق من مستوى التلوث الموجود على الجرافين من خلال الحصول على صورة تكبير عالية في وسط أحد الثقوب المغطاة بالجرافين (الشكل 3C). إذا تم الحصول عليها باستخدام كاشف عالي الدقة ، فيجب أن يحتوي تحويل فورييه لهذه الصورة على بقع براغ المقابلة لتباعد الكربون والكربون عند 2.14 Å (الشكل 4C). لا تنتج الطبقة الأحادية من ذرات الكربون تشتتا إلكترونيا كافيا لتوليد تباين الطور ، وبالتالي فإن صورة الجرافين النظيف لن تقدم حلقات Thon المرتبطة بوظيفة نقل التباين في تحويل فورييه للصورة. ومع ذلك ، من الصعب جدا منع تلوث شبكات الجرافين بعد إنتاجها ، كما أن الغسيل غير الكافي لشبكات EM أو إزالة MMA بعد طلاء الجرافين سيؤدي إلى ملوثات ملحوظة على الشبكات التي يمكن رؤيتها في صور الفضاء الحقيقي (الشكل 3C). كما هو موضح في الشكل 4 ، فإن شبكات الجرافين لها تأثير مركز على العينة ، كما لوحظ عند مقارنة 0.5 مجم / مل من الأبوفيريتين يتم تطبيقه على شبكات الذهب الهولي مع (الشكل 4 أ) وبدون دعم الجرافين (الشكل 4 ب). تم وصف بروتوكولات تصنيع الجرافين المماثلة سابقا لحل هياكل cryoEM للبروتينات مثل apoferritin بدقةعالية 25,27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig01.jpg"> الشكل 1: رسم تخطيطي لتحضير شبكات cryoEM المطلية بالجرافين. يتم توضيح الخطوات الرئيسية في عملية تصنيع شبكة الجرافين. الاختصارات: cryoEM = المجهر الإلكتروني المبرد. MMA = ميثيل ميثاكريلات. APS = بيرسلفات الأمونيوم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig02.jpg"> الشكل 2: المواد المطلوبة لصنع شبكات الجرافين . (أ) يتم تمييز المواد اللازمة لطلاء شبكات cryo-EM وفقا لذلك. ( ب) منظر عن قرب للطلاء مع ورقة من الجرافين / النحاس مثبتة على ورق نشاف على شريحة زجاجية. يمكن تجميع طلاء الدوران عن طريق شراء قطع غيار من متجر كمبيوتر / جهاز كمبيوتر محلي. (ج) منظر عن قرب لحوض طلاء الشبكة المتصل بحقنة يمكن استخدامها للتحكم في مستوى الماء. يتم وضع الشبكات فوق ورقة نشاف على شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ. يساعد الورق النشاف في مناورة موقع الشبكات بحيث يمكن مطابقة ورقة الجرافين معها. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig03.jpg"> الشكل 3: صورة نمط حيود تمثيلي وصور حقل ساطع لشبكة جرافين تظهر التجاعيد أو تلوث MMA . (أ) ستظهر شبكات EM المغطاة بطبقة أحادية من الجرافين قمم براغ المقابلة للشبكة السداسية للجرافين عند تصويرها في TEM في وضع الحيود. قمة Bragg المقابلة لتباعد الكربون والكربون 2.14 Å محاطة بدائرة ويشار إليها بسهم. (ب) صورة المجال الساطع لشبكة جرافين أحادية الطبقة بها بعض التجاعيد (يشار إليها بسهم) في طبقة الجرافين الأحادية. (ج) صورة حقل ساطع للجرافين أحادي الطبقة مع تلوث MMA (يشار إليه بسهم). أشرطة المقياس = 100 نانومتر (B ، C). الاختصارات: EM = المجهر الإلكتروني. MMA = ميثيل ميثاكريلات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig04.jpg"> الشكل 4: أبوفيريتين على شبكات الذهب المغطاة بالجرافين: (أ) صورة مجهرية بالتبريد EM ل 0.5 ملغم / مل أبوفيريتين على شبكات الذهب المغطاة بالجرافين. (ب) يكون الأبوفيريتين المصور بنفس التركيز مرئيا بتركيز أقل بكثير عند تحضيره باستخدام شبكات ذهبية هولية بدون جرافين. (C) FFT للصورة المجهرية cryoEM من 0.5 ملغ / مل من الأبوفيريتين على شبكات الذهب المغطاة بالجرافين ، مع قمم Bragg المقابلة لشبكة الجرافين السداسية المشار إليها. أشرطة المقياس = 100 نانومتر (أ ، ب). الاختصارات: cryoEM = المجهر الإلكتروني المبرد. FFT = تحويل فورييه السريع. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Enhancing CryoEM Resolution Using Graphene-Coated Grids at JoVE.com

هنا ، نصف بروتوكولا لتطبيق طبقة أحادية واحدة من الجرافين على شبكات المجهر الإلكتروني وكيفية تحضيرها للاستخدام في تحديد بنية cryoEM.

Cryogenic electron microscopy (cryoEM) has emerged as a powerful technique for probing the atomic structure of macromolecular complexes. Sample ...

يمثل الحفاظ على العينات البيولوجية حاليا على النحو الأمثل تحديا كبيرا في الحصول على هياكل CryoEM عالية الدقة. أثناء عملية تحضير العينات ، تتعرض العينات لواجهة الهواء والماء الكارهة للماء ، والتي لها تأثيرات تغيير طبيعة على العينات ويمكن أن تتسبب في اعتماد عينات مستقرة لاتجاه تفضيلي في الجليد ، مما يمنع تحديد هيكل عالي الدقة. تم استخدام طلاء شبكات CryoEM بطبقة رقيقة من الكربون مثل أكسيد الجرافين الناعم ، بشكل شائع لمعالجة المشكلات المتعلقة بالتفاعلات مع واجهة الهواء والماء.ومع ذلك ، غالبا ما تزيد هذه الطبقات من ضوضاء الخلفية في صورنا ، مما يضر بقرارات هيكلنا. يوفر طلاء الشبكة بطبقة أحادية من الجرافين حماية مماثلة دون إحداث ضوضاء كبيرة في الخلفية. يمكن أن يساعد استخدام شبكات CryoEM المطلية بالجرافين في التغلب على المشكلات المتعلقة بالتفاعلات مع واجهة الهواء والماء ، ومع ذلك ، فإن شبكات الجرافين التجارية باهظة الثمن وتعتبر العديد من المختبرات شبكات الجرافين معقدة للغاية بحيث لا يمكن تحضيرها داخليا.يمكن للباحثين في مجال CryoEM الآن استخدام هذا البروتوكول خطوة بخطوة لإعادة إنتاج العشرات من الجرافين عالي الجودة المنتج بالكامل في يوم واحد.

fabrication-monolayer-graphene-coated-grids-for-cryoelectron

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy

1.9K Views.  Scripps Research. يمثل الحفاظ على العينات البيولوجية حاليا على النحو الأمثل تحديا كبيرا في الحصول على هياكل CryoEM عالية الدقة. أثناء عملية تحضير العينات ، تتعرض العينات لواجهة الهواء والماء الكارهة للماء ، والتي لها تأثيرات تغيير طبيعة على العينات ويمكن أن تتسبب في اعتماد عينات مستقرة لاتجا?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تحسين دقة CryoEM باستخدام الشبكات المطلية بالجرافين 

Cryogenic electron microscopy (cryoEM) has emerged as a powerful technique for probing the atomic structure of macromolecular complexes. Sample preparation for cryoEM requires preserving specimens in a thin layer of vitreous ice, typically suspended within the holes of a fenestrated support film. However, all commonly used sample preparation approaches for cryoEM studies expose the specimen to the air-water interface, introducing a strong hydrophobic effect on the specimen that often results in denaturation, aggregation, and complex dissociation. Further, preferred hydrophobic interactions between regions of the specimen and the air-water interface impact the orientations adopted by the macromolecules, resulting in 3D reconstructions with anisotropic directional resolution. 
Adsorption of cryoEM specimens to a monolayer of graphene has been shown to help mitigate interactions with the air-water interface while minimizing the introduction of background noise. Graphene supports also offer the benefit of substantially lowering the required concentration of proteins required for cryoEM imaging. Despite the advantages of these supports, graphene-coated grids are not widely used by the cryoEM community due to the prohibitive expense of commercial options and the challenges associated with large-scale in-house production. This paper describes an efficient method for preparing batches of cryoEM grids that have nearly full coverage of monolayer graphene.

Here, we describe a protocol for applying a single monolayer of graphene to electron microscopy grids and how to prepare them for use in cryoEM structure determination.

Coating Single-Layer Graphene-Copper Sheet with MMA and Cleaning the Grids

To begin, inside a fume hood, place a cover slip with the taped graphene sheet on a homemade spin coater. Wearing safety goggles, use a glass pipette to add two drops of methyl methacrylate, or MMA, onto the graphene sheet, and immediately start spinning at maximum speed. While spinning, add two more drops in the center and spin for one minute.After cleaning and drying three crystallizing dishes, pour 200 milliliters of chloroform, acetone, and isopropyl alcohol into each dish. Place the base of the clamping TEM grid holder block at the bottom of the first dish containing 200 milliliters of chloroform. Ensuring the fenestrated film side is facing up, transfer each grid individually from the grid box to a well in the grid holder block.Cover the dish with aluminum foil and place it on an orbital shaker to gently shake for 30 minutes. Next, place the metal lid on the grid holder block to secure the grids for transfer to the next crystallizing dish. Using a bent fork and a long tweezer, carefully lift the grid holder block out of the dish and place it at the bottom of the second dish containing 200 milliliters of acetone.Remove the lid from the grid holder block and gently shake it on an orbital shaker. After 30 minutes, place the lid on the grid holder block and transfer it to a dish containing 200 milliliters of isopropyl alcohol to remove acetone residue. Remove the lid from the grid holder block and gently shake it for 20 minutes.Individually transfer the grids with the fenestrated film side up from the grid holder block to a glass Petri dish covered with blotting paper.

طلاء ورقة الجرافين والنحاس أحادية الطبقة مع MMA وتنظيف الشبكات

Transferring Grids to a Perforated Tray Under DI Water, Transferring Graphene to the Grids, Removing MMA, and Cleaning the Grids

Transfer the cleaned grids with the fenestrated film side facing up onto the wet blotting paper. Submerge the hydrophobic grids vertically into the water to prevent bending due to water tension. Arrange the submerged grids in a square array, keeping them close but not overlapping.Fill the grid coating trough with more deionized water, ensuring the water surface is at least five millimeters above the grids. To scoop out the MMA graphene film from the dish, slowly lower the cover slip into the dish at an angle, some distance away from the graphene film. Position the cover slip underneath the graphene MMA sheet and align its edges parallelly with the sheet.Then, lift the cover slip vertically from the water, bringing the MMA graphene film with it. Transfer the MMA graphene film to the trough by lowering the cover slip into the water at a 45-degree angle so that the film detaches from the cover slip and floats on the water surface. Position the MMA graphene film above the grids before the water level decreases.Using a Pasteur pipette whose tip has been melted closed, carefully manipulate the MMA graphene film's position. Using a syringe, slowly lower the water level such that the MMA graphene film perfectly lands on the grids and completely covers their surfaces. Using a pair of clean, dry tweezers, lift the blotting paper holding the grids to a clean, dust-free Petri dish.Place the base of the clamping TEM grid holder block at the bottom of the first crystallizing dish containing 200 milliliters of fresh acetone. Individually, transfer each grid with the MMA side facing up from the blotting paper to a well in the grid holder block. Cover the dish with foil, and gently shake on an orbital shaker for 30 minutes.Secure the grids by placing the metal lid on the grid holder block. Then, using a bent fork or long tweezers, carefully lift the block out of the dish and place it at the bottom of the second dish containing 200 milliliters of fresh acetone. After removing the lid from the block, gently shake it on an orbital shaker for 30 minutes.Place the lid back on the grid holder block and transfer it to the dish containing 200 milliliters of isopropyl alcohol. Remove the lid before gently shaking for 20 minutes. Transfer the grids to a small glass Petri dish covered with blotting paper and air dry the grids for 10 minutes.In TEM diffraction modes, EM grids covered with a monolayer of graphene show Bragg peaks corresponding to the hexagonal lattice of the graphene. Graphene grids have a concentrating effect on a sample as observed when comparing apoferritin applied to holy gold grids with and without the graphene support. A fast Fourier transform of the cryoEM micrograph of apoferritin on graphene-covered gold grids also showed Bragg peaks corresponding to the hexagonal graphene lattice.