تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الإسرائيلية (منحة 119/16) ومنحة IMoh (3-15656) إلى IKG. R.S. بدعم من زمالة كريتمان.

يتم توفير ملف .ast ، مع قالب Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) كمثال ، في ملف الترميز التكميلي 1.
1. إعداد وسائل الإعلام
<ol><li>تحضير مرق العصيات اللبنية MRS باتباع تعليمات الشركة المصنعة (55 جم في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات) وألواح أجار Lactobacilli MRS مع 1.5٪ (وزن / حجم) أجار (انظر جدول المواد). بعد تعقيم الأوتوكلاف ، يكون الوسيط جاهزا للاستخدام مباشرة أو يمكن تخزينه عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>تحضير 50٪ (15 جم في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات) مرق الصويا التربتيك (TSB) (انظر جدول المواد) ، TSB مكمل ب 1٪ (وزن / حجم) D- (+) - جلوكوز و 1٪ (وزن / حجم) D- (+) - رافينوز ، ثم الأوتوكلاف لتعقيم الوسط. يفضل تخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لتجنب التلوث.</li>
	<li>بالنسبة للوسط المخزن مع الجلوكوز، قم بإعداد TSB المكمل ب 1٪ (وزن / حجم) D- (+) - جلوكوز ، و 5 mM من فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة مع ثنائي القاعدة البوتاسيوم ، و 100 mM MOPS (3- (N-morpholino) حمض البروبان السلفونيك ، انظر جدول المواد) الرقم الهيدروجيني 7. ثم الأوتوكلاف لتعقيم الوسط.</li>
</ol>2. إعداد العينات
ملاحظة: تتضمن هذه الخطوة تقييم التجميع الخلوي استجابة للسكر القابل للتخمير أو غير القابل للتخمير من نظامنا الغذائي. يوضح الشكل 1 تمثيلا تخطيطيا لعملية تحضير العينة.
<ol><li>قم بخط سلالة Lactobacillaceae من مخزون الجلسرين المجمد (50٪ جلسرين) على طبق مرق Lactobacilli MRS (1.5٪ أجار). ملاحظة: في المثال التجريبي المقدم هنا ، تم استخدام سلالات بروبيوتيك Lactobacillus acidophilus (ATCC 4356) و Lacticaseibacillus casei (ATCC 393) و Lacticaseibacillus casei subsp. paracasei (ATCC BAA-52) و Lactiplantibacillus plantarum (ATCC 8014) و Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) (LGG). لتوسيع هذه المنهجية لتشمل أعضاء بروبيوتيك إضافيين من شعبة firmicutes ، تم اختيار Bacillus coagulans (ATCC 10545).</li>
	<li>تنمو الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في ظل ظروف ثابتة.</li>
	<li>تلقيح 5 مل من مرق MRS العصيات اللبنية بمستعمرة واحدة وزراعتها عند 37 درجة مئوية في ظل ظروف ثابتة طوال الليل.</li>
	<li>تمييع ثقافة الخلية من الخطوة السابقة (1: 100) في 3 مل من 50٪ مرق الصويا التربتي (TSB) ، TSB المكمل ب 1٪ (وزن / حجم) D- (+) - جلوكوز ، أو TSB مكمل ب 1٪ (وزن / حجم) D- (+) - رافينوز.</li>
	<li>احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في ظل ظروف ثابتة.</li>
	<li>قم بإعداد العينة عن طريق خلط الخلايا بشكل موحد في الوسط ، ودوامة أنبوب زراعة الخلية برفق من الخطوة 2.5. اقلب أنبوب الاختبار برفق حتى يتم الخلط الكامل. نقل 200-300 ميكرولتر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل. ملاحظة: من الضروري عدم صوتنة العينة لتجنب كسر الركام. أثناء الحصول على البيانات من الخطوات 3.4 إلى 3.10 ، قد تكون هناك حالات تكون فيها العينات مركزة للغاية. إذا لوحظ أن العينة تعمل ببطء شديد أو لا تعمل على الإطلاق ، يمكن للمرء أن يخفف العينة باستخدام الوسط الطازج المناسب.</li>
</ol>3. الحصول على البيانات
<ol><li>قم بإعداد مقياس تدفق التصوير الخلوي وفقا للإرشادات المقدمة من الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).</li>
	<li>اضبط ليزر 785 نانومتر على 5 ميجاوات لقياس الحقل المظلم (أي ما يعادل التشتت الجانبي في قياس التدفق الخلوي التقليدي ، والمختصر باسم SSC). استخدم عدسة 60x بفتحة عدسة رقمية (N.A) تبلغ 0.9 ، وحدد حساسية عالية ، واضبط السرعة على منخفضة.</li>
	<li>قبل جمع أي بيانات ، تأكد من استقرار تدفق حبات المعايرة في قناة SSC. انقر فوق زر التشغيل في مربع "fluidics" وافحص جودة صور الخرزة. يجب أن تظهر صور الخرزة حادة ونقية.</li>
	<li>اضغط على زر التحميل وضع أنبوبا به عينة (من الخطوة 2.6) في الحامل.</li>
	<li>قم بإنشاء مخطط تشتت جديد في مربع "مساحة العمل". انقر فوق مخطط تشتت جديد وحدد المنطقة في قناة برايت فيلد المقابلة لشدة قناة SSC. استبعد حبات المعايرة التي تعمل في الجهاز مع العينة. ملاحظة: يمكن استبعاد الخرز عن طريق تحميل عينة مع المخزن المؤقت فقط وتحديد الخرز على المنطقة مقابل. مؤامرة SSC. ثم ارسم بوابة حول مجموعة الخرزات باستخدام زر إنشاء منطقة مضلعة .</li>
	<li>في مربع "إعدادات الاكتساب" ، أدخل اسم العينة ، وحدد موقع تخزين البيانات ، واختر المحتوى (جميع الخلايا بدون خرز) للتسجيل منه ، وقم بتعيين عدد الأحداث التي سيتم جمعها. عادة ما يكون 10,000-20,000 حدث كافيا.</li>
	<li>انقر فوق الزر "تسجيل " الموجود في مربع "الاستحواذ" ، وستنتهي عملية الاستحواذ تلقائيا بمجرد الوصول إلى العدد المحدد من الأحداث.</li>
	<li>انقر فوق الزر "رجوع " لتفريغ الأنبوب ، وقم بإزالة الأنبوب من الحامل عندما يطلب منك ذلك في نافذة صغيرة.</li>
	<li>كرر الخطوات من 3.5 إلى 3.9 لكل عينة.</li>
	<li>احفظ القالب للحفاظ على توحيد الحصول على البيانات للتكرارات اللاحقة.</li>
</ol>4. تحليل البيانات
<ol><li>قياس النسبة المئوية (٪) من التجميع التلقائي من السكان.<ol><li>تحليل البيانات التي تم الحصول عليها على مقياس تدفق التصوير الخلوي باستخدام برنامج IDEAS (انظر جدول المواد).</li>
		<li>قم بإنشاء ملف تحليل بيانات (.daf) من الملف الأولي (.rif) عن طريق تحميل الملف (.rif) في برنامج التحليل. انقر فوق الزر ملف وافتح الملف المطلوب (.rif). في النافذة المفتوحة ، انقر فوق استخدام تحليل الاستحواذ ثم انقر فوق موافق.</li>
		<li>قم بإنشاء مدرج تكراري لتدرج RMS (قياس تباين الصورة والتركيز) في قناة برايت فيلد لتحديد الأحداث المركزة. في منطقة التحليل، انقر فوق الزر مدرج تكراري جديد . في نافذة "الرسم البياني الجديد" ، اختر السكان من الاستحواذ لتحليله ، وفي "ميزة المحور x" ، حدد تدرج RMS لقناة برايتفيلد.<ol><li>ضع بوابة بالنقر فوق الزر إنشاء منطقة خط في منطقة التحليل لاستبعاد الأحداث غير المركزة (الشكل 2 أ). ملاحظة: عادة ، يجب أن تتضمن منطقة الخط "المركزة" 80٪ -90٪ من الأحداث ذات أعلى درجة RMS متدرجة ، ولكن يجب تحديد عتبات محددة للخلايا "في التركيز" لكل إعداد تجريبي.</li>
		</ol></li>
		<li>قم بإنشاء مخطط مبعثر للمساحة (μm2) مقابل نسبة العرض إلى الارتفاع (العرض مقسوما على طول القطع الناقص الأكثر ملاءمة) لقناة brightfield. اضغط على زر مخطط التشتت الجديد في منطقة التحليل. في نافذة "مخطط تشتت جديد" ، اختر المحتوى المركز من الخطوة 4.1.3.<ol><li>حدد منطقة قناة برايت فيلد لميزة المحور السيني ونسبة العرض إلى الارتفاع لقناة برايت فيلد لميزة المحور ص. يسمح مخطط التشتت هذا ببوابات على السكان المركزين لتمييز الأحداث الفردية والركامية الصغيرة عن المجاميع والسلاسل الميكروبية الأكبر.</li>
		</ol></li>
		<li>في مخطط التشتت هذا ، ارسم بوابة باستخدام زر إنشاء منطقة مستطيل (أو إنشاء منطقة مضلع) بناء على قيمة المنطقة لمجتمع أحداث التجميع وبوابة أخرى لتعداد المجاميع الفردية والمجاميع الصغيرة (الشكل 2 ب). ملاحظة: في بعض الخلفيات، قد يكون فصل الركام الصغير عن المجاميع الفردية أمرا صعبا، بحيث يمكن دمجها في نفس البوابة. الأمر نفسه ينطبق على الركام والسلاسل الأكبر (الشكل 3).</li>
		<li>مراجعة وتقييم صور الأحداث يدويا داخل كل بوابة للتحقق من موثوقية استراتيجية البوابة. إذا لزم الأمر ، اضبط قيمة المنطقة للبوابة. نفذ ذلك عن طريق تحديد المحتوى الذي تمت مراجعته من القائمة المنسدلة "السكان". ملاحظة: لا تحتوي البوابة على قيمة مساحة محددة ، حيث يمكن أن تختلف اعتمادا على خصائص البكتيريا التي يتم تحليلها.</li>
		<li>احفظ تحليل البيانات كقالب. انقر فوق علامة التبويب ملف ، وحدد حفظ باسم Template.ast، وافتح نموذج الملف التالي (.rif) ضمن نفس القالب لإنشاء ملف تحليل البيانات (.daf) (دعم ملف .ast كمثال ل LGG).</li>
		<li>إنشاء جدول إحصائي لتعداد الأحداث الرئيسية لمزيد من التحليل. انقر فوق علامة التبويب التقارير ، ثم انقر فوق تحديد تقرير الإحصائيات.</li>
		<li>في النافذة الجديدة، انقر على إضافة أعمدة. أضف عدد المفردات / المجاميع والإحصاءات ٪ المسورة. ضمن "الإحصاءات"، اختر ٪gated/count، وضمن المحتوى المحدد، اختر المفردات/التجميعات. انقر فوق إضافة إحصائيات لإضافة الإحصائية إلى القائمة وحفظها كقالب.</li>
		<li>اضغط على إنشاء تقرير إحصائي واختر القالب الإحصائي وملفات (.daf) للتحليل.</li>
	</ol></li>
	<li>قياس توزيع حجم الركام.<ol><li>لتحليل متوسط حجم أحداث التجميع ، ارسم رسما بيانيا للمنطقة (μm2) لمجتمع أحداث التجميع من الخطوة 4.1.5 (الشكل 2C).</li>
		<li>احفظ تحليل البيانات كقالب. انقر فوق علامة التبويب ملف ، وحدد حفظ كقالب، وافتح نموذج الملف التالي (.rif) ضمن نفس القالب لملف تحليل البيانات (.daf).</li>
		<li>كرر الخطوات 4.1.7-4.19. بالنسبة إلى حجم المجاميع، اختر المتوسط ضمن الإحصائيات وحدد التجميعات ضمن المحتوى المحدد. ضمن الميزات، حدد منطقة قناة برايتفيلد. انقر فوق إضافة إحصائيات لإضافة الإحصائية إلى القائمة وحفظها كقالب.</li>
		<li>كرر الخطوة 4.1.9 لإنشاء تقرير إحصائي.</li>
	</ol></li>
</ol>

التحليل الكمي للتجميع الذاتي الميكروبي باستخدام قياس التدفق الخلوي للتصوير

<ol>
	<li>Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+autoaggregation.">Bacterial autoaggregation.</a> AIMS Microbiology. 4 (1), 140-164 (2018).</li><li>Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtaA,+a+new+member+of+the+trimeric+autotransporter+adhesins+from+Acinetobacter+sp.+Tol+5+mediating+high+adhesiveness+to+various+abiotic+surfaces.">AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating high adhesiveness to various abiotic surfaces.</a> PLoS One. 7, e48830 (2012).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+low-molecular-weight+component+protein,+Flp,+in+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+fimbriae.">Molecular characterization of low-molecular-weight component protein, Flp, in Actinobacillus actinomycetemcomitans fimbriae.</a> Medical Microbiology and Immunology. 42 (4), 253-258 (1998).</li><li>Boddey, J. A., Flegg, C. P., Day, C. J., Beacham, I. R., Peak, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-regulated+microcolony+formation+by+Burkholderia+pseudomallei+requires+pilA+and+enhances+association+with+cultured+human+cells.">Temperature-regulated microcolony formation by Burkholderia pseudomallei requires pilA and enhances association with cultured human cells.</a> Infection and Immunity. 74 (9), 5374-5381 (2006).</li><li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-dependent+differences+in+the+functional+responses+of+Lactobacillaceae+strains+to+fermentable+sugars.">Context-dependent differences in the functional responses of Lactobacillaceae strains to fermentable sugars.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 949932 (2022).</li><li>Isenring, J., Geirnaert, A., Lacroix, C., Stevens, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistable+auto-aggregation+phenotype+in+Lactiplantibacillus+plantarum+emerges+after+cultivation+in+in+vitro+colonic+microbiota.">Bistable auto-aggregation phenotype in Lactiplantibacillus plantarum emerges after cultivation in in vitro colonic microbiota.</a> BMC Microbiology. 21, 268 (2021).</li><li>Kos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+and+aggregation+ability+of+probiotic+strain+Lactobacillus+acidophilus+M92.">Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92.</a> Journal of Applied Microbiology. 94 (6), 981-987 (2003).</li><li>Zommiti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assessment+of+the+probiotic+properties+and+bacteriocinogenic+potential+of+Pediococcus+pentosaceus+MZF16+isolated+from+artisanal+tunisian+meat+&amp;#34;Dried+Ossban&amp;#34;.">In vitro assessment of the probiotic properties and bacteriocinogenic potential of Pediococcus pentosaceus MZF16 isolated from artisanal tunisian meat &amp;#34;Dried Ossban&amp;#34;.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2607 (2018).</li><li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rewiring+of+the+probiotic+bacterium+rhamnosus&lt;/em&gt;+GG+contributes+to+cell-wall+remodeling+and+antimicrobials+production.">Metabolic rewiring of the probiotic bacterium rhamnosus&lt;/em&gt; GG contributes to cell-wall remodeling and antimicrobials production.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Connell, J. L., Kim, J., Shear, J. B., Bard, A. J., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+quorum+sensing+in+3D-printed+bacterial+aggregates+using+scanning+electrochemical+microscopy.">Real-time monitoring of quorum sensing in 3D-printed bacterial aggregates using scanning electrochemical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18255-18260 (2014).</li><li>Misawa, N., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+autoagglutination+activity+by+Campylobacter+jejuni.">Detection and characterization of autoagglutination activity by Campylobacter jejuni.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6168-6175 (2000).</li><li>Sherlock, O., Schembri, M. A., Reisner, A., Klemm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+roles+for+the+AIDA+adhesin+from+diarrheagenic+Escherichia+coli:+cell+aggregation+and+biofilm+formation.">Novel roles for the AIDA adhesin from diarrheagenic Escherichia coli: cell aggregation and biofilm formation.</a> Journal of Bacteriology. 186 (23), 8058-8065 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry.">Imaging flow cytometry.</a> Nature Reviews Methods Primers. 2, 87 (2022).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+characteristics+of+lactic+acid+bacteria+and+the+expanding+applications+in+food+industry.">Metabolism characteristics of lactic acid bacteria and the expanding applications in food industry.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 612285 (2021).</li><li>Turroni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dialogue+between+the+human+gut+microbiota+and+the+host:+a+Lactobacillus+and+Bifidobacterium+perspective.">Molecular dialogue between the human gut microbiota and the host: a Lactobacillus and Bifidobacterium perspective.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 183-203 (2014).</li><li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageStream+System:+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging.">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochemica et Cytobiologica. 45, 279-290 (2007).</li><li>Dashkova, V., Malashenkov, D., Poulton, N., Vorobjev, I., Barteneva, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+for+phytoplankton+analysis.">Imaging flow cytometry for phytoplankton analysis.</a> Methods. 112, 188-200 (2017).</li><li>Maan, H., Gilhar, O., Porat, Z., Kolodkin-Gal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+colonization+of+arabidopsis+thaliana+roots+induces+multiple+biosynthetic+clusters+for+antibiotic+production.">Bacillus subtilis colonization of arabidopsis thaliana roots induces multiple biosynthetic clusters for antibiotic production.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 722778 (2021).</li><li>Maan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+reveals+a+dual+role+for+exopolysaccharides+in+biofilms:+To+promote+self-adhesion+while+repelling+non-self-community+members.">Imaging flow cytometry reveals a dual role for exopolysaccharides in biofilms: To promote self-adhesion while repelling non-self-community members.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 15-25 (2022).</li><li>Konieczny, M., Rhein, P., Czaczyk, K., Bialas, W., Juzwa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+to+study+biofilm-associated+microbial+aggregates.">Imaging flow cytometry to study biofilm-associated microbial aggregates.</a> Molecules. 26 (23), 7096 (2021).</li><li>Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attached+biofilms+and+suspended+aggregates+are+distinct+microbial+lifestyles+emanating+from+differing+hydraulics.">Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics.</a> Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).</li></ol>

قياس التدفق الخلوي هو طريقة مستخدمة على نطاق واسع لتحديد شدة التألق في الخلايا حقيقية النواة ، ولكنها قد لا توفر قياسات دقيقة للخلايا البكتيرية بسبب حجمها الأكبر أو مجاميعها الصغيرة. يمكن أن تؤثر هذه العوامل بشكل كبير على القياس الكمي الدقيق للتجميع الذاتي والمستوى الأساسي لتشكيل الركام...

يعتبر التجمع الذاتي البكتيري خطوة أساسية في تكوين الأغشية الحيوية. في هذه العملية (تسمى أحيانا التراص الذاتي أو التلبد) ، تشكل البكتيريا من نفس النوع كتلا متعددة الخلايا تستقر في النهاية في قاع أنابيب الاستزراع أو تلتصق بالأنسجة أو السطح المستهدف1.
التجميع الذاتي هو ظاهرة لوحظت على نطاق واسع وقد ثبت حتى الآن في مسببات الأمراض سالبة الجرام مثل العامل الممرض الانتهازي Acinetobacter baumannii2 ، ومسببات الأمراض السنية Aggregobacter actinomycetemcomitans3 ، والممرض الناشئ Burkholderia pseudomallei4. كما تم وصف التجميع الذاتي في العديد من سلالات البروبيوتيك إيجابية الجرام5،6،7،8. في Lactobacillus (L.) acidophilus ، تم التوسط في التجميع الذاتي جزئيا بواسطة بروتينات الطبقة S وارتبط بالالتصاق بزيلان7. وبالمثل ، وجدنا علاقة بين التجميع الذاتي المعتمد على الجلوكوز وتحريض الخصائص اللاصقة (كما تم الحكم عليها من خلال الالتصاق بالميوسين) لأنواع البروبيوتيك Lacticaseibacillus rhamnosus GG و Lacticaseibacillus casei و L. acidophilus و Lacticaseibacillus paracasei و Lactiplantibacillus plantarum5. يعكس التجميع الذاتي المتزايد على الأرجح التغيرات في التعبير عن الالتصاقات الخلوية استجابة للجلوكوز وتقويمه9. في حين أن الآليات الجزيئية للتجميع الذاتي لم يتم تحديدها بعد ، فقد ثبت أن هذه العملية تغير النمط الظاهري للبكتيريا المجمعة وتمنحها قدرة معززة على تحمل الضغوطات البيئية1 ، فضلا عن زيادة الحساسية لجزيئات استشعار النصاب10.
وقد استخدمت عدة نهج لقياس التجميع الذاتي؛ يتمثل أحد الأساليب التجريبية في السماح للثقافات بالوقوف بشكل ثابت في أنابيب الاستزراع الضيقة لفترة معينة. تظل ثقافات التحكم عكرة ، في حين أن ثقافات التجميع الذاتي ستستقر في قاع الأنبوب. يقيس نهج أكثر كمية التجميع الذاتي عن طريق الترسيب أو تسوية الفحص11.
كما تم استخدام قياس التدفق الخلوي بشكل متزايد في السنوات الأخيرة للتحقيق في التجميع الذاتي للبكتيريا. هذه الطريقة مناسبة لتحليل الجسيمات التي يتراوح حجمها بين 0.5 و 1000 ميكرومتر تقريبا. يتم تعليق البكتيريا المفردة أو الركام المشكل في سائل ، ويتم تغذيتها في تيار ، ويمكن اكتشافها واحدة تلو الأخرى11. يسمح تسجيل الضوء المتناثر الأمامي بقياس الحجم النسبي للخلية أو الركام. إنه سريع نسبيا ومباشر ولكن لا يمكنه اكتشاف العديد من المعلمات ، مثل الحجم الإجمالي أو متوسط عدد الخلايا في التجميعات. لذلك ، يمكن استكمال هذا النهج مجهريا ، مما يسمح بفحص المزيد من المعلمات12. ومع ذلك ، فإن الفحص المجهري التقليدي يستغرق وقتا طويلا وبالتالي يحد من عدد العينات المختبرة والقوة الإحصائية للتحليل. بشكل عام ، يوفر قياس التدفق الخلوي التصويري العديد من الميزات مقارنة بقياس التدفق الخلوي التقليدي ، مثل التحليل المتزامن لمورفولوجيا الخلية والنمط الظاهري ، وإجراء التحليل المستند إلى الصور ، واكتشاف الأحداث النادرة ، والتحقق من صحة بيانات قياس التدفقالخلوي 13. تعزز هذه المزايا قدرات قياس التدفق الخلوي وتسهل فحصا أكثر تفصيلا لمجموعات الخلايا.
توفر هذه الدراسة بروتوكولا قيما لقياس التدفق الخلوي للتصوير لمراقبة التجمع الذاتي في بكتيريا حمض اللاكتيك (LAB). هذه القضبان إيجابية الجرام هي لاهوائيات اختيارية وتنتمي إلى مجموعة LAB. تولد مخمرات الجلوكوز الفعالة حمض اللاكتيك كمنتج نهائي رئيسي لاستقلاب الكربوهيدرات14. هذه البكتيريا هي أعضاء أساسيون مفيدون في الميكروبيوم وتوجد بشكل طبيعي في الجهاز الهضمي (GIT) للإنسان ، وكذلك في الجهاز البولي التناسلي للإناث15. لذلك ، فإن التوصيف الدقيق لخصائص التجميع الذاتي الخاصة بهم له أهمية عالية في مجال التكنولوجيا الحيوية والسريرية.
أشارت النتائج السابقة التي توصلنا إليها إلى أن المستوى القاعدي للتجميع الذاتي يختلف بين سلالات البروبيوتيك المختلفة. يتأثر هذا التباين بالكربوهيدرات المختلفة المستخدمة كمصدر للكربون5. للتغلب على هذه الخاصية الأساسية للبكتيريا بروبيوتيك ، تم رصد آثار الكربوهيدرات من النظام الغذائي على التجميع الذاتي على مستوى الخلية الواحدة باستخدام IFC. يجمع هذا النهج القائم على مؤسسة التمويل الدولية بين قوة وسرعة مقاييس التدفق الخلوي التقليدية مع دقة المجهر. لذلك ، فإنه يسمح بالقياسات المورفومترية المعقدة عالية المعدل بطريقة محددة ظاهريا16,17. يمكن توسيع هذا النهج ليشمل بكتيريا البروبيوتيك والمسببة للأمراض الأخرى ، جنبا إلى جنب مع مراسلي الفلورسنت لمراقبة التعبير الجيني ، والسلالات الموسومة بالفلورسنت لمراقبة وجود ووفرة أنواع بكتيرية معينة في المجاميع غير المتجانسة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Typtic Soy Broth</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83400-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Lactobacilli MRS broth</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>288130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)</td>
			<td>FL medical</td>
			<td>23053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEAS Software</td>
			<td>Amnis/EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&#38;bd=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageStream X Mark II</td>
			<td>Amnis/EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific, 174.18 g/mol</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma, 136.09 g/mol</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging flow cytometry to study microbial autoaggregation

تلعب البكتيريا المفيدة والبروبيوتيك أدوارا أساسية في مضيفيها ، حيث توفر فوائد صحية مختلفة ، بما في ذلك المناعة ضد الأمراض المعدية. تتكون عائلة Lactobacillaceae من بكتيريا إيجابية الجرام ذات خصائص بروبيوتيك مؤكدة. تستخدم هذه الدراسة أنواع Lactobacillaceae كنموذج لإثبات فعالية تحليل الإنتاجية العالية أحادية الخلية في دراسة التجميع الخلوي. ينصب التركيز على تحليل استجابة هذه الأنواع المفيدة للكربوهيدرات البسيطة من النظام الغذائي.
تعرض الدراسة كيف يمكن لقياس التدفق الخلوي التصويري (IFC) التغلب على الاختلافات الأساسية في تجميع بكتيريا البروبيوتيك في وجود وغياب الكربوهيدرات. يجمع IFC بين قوة وسرعة قياس التدفق الخلوي التقليدي والدقة المكانية للفحص المجهري ، مما يتيح قياسات مورفومترية معقدة عالية المعدل بطريقة محددة ظاهريا عبر مكتبة من السلالات والظروف البكتيرية المفيدة. يوفر هذا البروتوكول نظرة ثاقبة حول التجميع الذاتي لأنواع Lactobacillaceae ويلقي الضوء على استجابتها للكربوهيدرات الغذائية ، مما يساهم في فهم الآليات الكامنة وراء الآثار المفيدة لهذه البكتيريا بروبيوتيك.

Bacterial autoaggregation is considered a primary step in biofilm formation. In this process (sometimes also called autoagglutination or flocculation), bacteria of the same type form multicellular clumps that eventually settle at the bottom of culture tubes or attach to their target tissue or surface1.
Autoaggregation is a widely observed phenomenon and has been shown so far in Gram-negative pathogens such as the opportunistic pathogen Acinetobacter baumannii2, the dental pathogen Aggregobacter actinomycetemcomitans3, and the emerging pathogen Burkholderia pseudomallei4. Autoaggregation has also been described in several probiotic Gram-positive strains5,6,7,8. In Lactobacillus (L.) acidophilus, autoaggregation was partially mediated by S-layer proteins and correlated with an adhesion to xylan7. Similarly, we found a correlation between glucose-dependent autoaggregation and induction of the adhesive properties (as judged by adhesion to mucin) of the probiotic species Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei, and Lactiplantibacillus plantarum5. The increased autoaggregation most likely reflected changes in the expression of cellular adhesins in response to glucose and its catabolites9. While the molecular mechanisms of autoaggregation remain to be determined, it has been shown that this process alters the phenotype of the aggregated bacteria and grants them enhanced tolerance to environmental stressors1, as well as increased sensitivity to quorum sensing molecules10.
Several approaches have been used to measure autoaggregation; one experimental approach is to let cultures stand statically in narrow culture tubes for a given time. Control cultures remain turbid, whereas autoaggregation cultures will settle at the bottom of the tube. A more quantitative approach measures autoaggregation by sedimentation or settling assay11.
Flow cytometry has also been increasingly employed in recent years to investigate bacterial autoaggregation. This method is appropriate for analyzing particles between approximately 0.5 and 1000 &#181;m in size. The single bacterium or formed aggregates are suspended in fluid, fed into a stream, and can be detected one by one11. Recording forward scattered light allows measuring the relative size of the cell or aggregate. It is relatively fast and straightforward but cannot detect several parameters, such as aggregate size or the average number of cells in aggregates. Therefore, this approach can be complemented microscopically, allowing more parameters to be checked12. However, traditional microscopy is time-consuming and thereby limits the number of tested samples and the statistical power of the analysis. In general, imaging flow cytometry provides several features compared to traditional flow cytometry, such as simultaneous analysis of cell morphology and phenotype, conducting image-based analysis, detecting rare events, and validating flow cytometry data13. These advantages enhance the capabilities of flow cytometry and facilitate a more detailed examination of cell populations.
This study provides a valuable protocol for imaging flow cytometry to monitor autoaggregation in lactic acid bacteria (LAB). These Gram-positive rods are facultative anaerobes and belong to the LAB group. These efficient glucose fermenters generate lactic acid as their main end-product of carbohydrate metabolism14. These bacteria are beneficial core members of the microbiome and are naturally found in the gastrointestinal tract (GIT) of humans and animals, as well as in the urogenital tract of females15. Therefore, the exact characterization of their autoaggregation properties is of high biotechnological and clinical interest.
Our previous findings indicated that the basal level of autoaggregation differs between different probiotic strains. This heterogeneity is affected by the different carbohydrates used as a carbon source5. To overcome this fundamental property of probiotic bacteria, the effects of carbohydrates from the diet were monitored on autoaggregation on the single-cell level using IFC. This IFC-based approach combines the power and speed of traditional flow cytometers with the microscope&#39;s resolution. Therefore, it allows high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined way16,17. This approach can be extended to other probiotic and pathogenic bacteria, combined with fluorescent reporters to monitor gene expression, and fluorescently labeled strains to monitor the presence and abundance of specific bacterial species in heterogeneous aggregates.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير البحث في التجميع الذاتي الميكروبي باستخدام قياس التدفق الخلوي للتصوير

قياس التدفق الخلوي التصويري لدراسة التجميع الذاتي الميكروبي

This study utilized Lactobacillus species as a model to demonstrate the effectiveness of imaging flow cytometry analysis in studying microbial autoaggregation. The focus is on analyzing the response of autoaggregation of Lactobacillus species to simple carbohydrates from the diet. The most used methods for measuring autoaggregation are spectral photometry, which measures microbial suspensions, turbidity, or optical density, and traditional microscopy techniques, such as bright field, phase contrast, and fluorescent microscopy.When talking about hight-throughput imaging, one major experimental challenge is single event segmentation. In this protocol, it is a single aggregate. Imaging flow cytometry addresses this challenge elegantly and give researchers a powerful tool for studying autoaggregation.

توضح النتائج أن هذه الطريقة يمكن بسهولة قياس الاختلافات في التجميع الذاتي استجابة للسكريات الغذائية في بكتيريا LAB. من خلال فصل الأفراد عن المجاميع ، تسمح الطريقة بحساب النسبة المئوية لسكان أحداث التجميع من جميع الأحداث استجابة للسكريات القابلة للتخمير أو غير القابلة للتخمير من النظام ال...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Research in Microbial Auto Aggregation Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

يصف هذا البروتوكول نهجا كميا لقياس التجميع الذاتي الميكروبي باستخدام قياس التدفق الخلوي للتصوير.

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...

استخدمت هذه الدراسة أنواع Lactobacillus كنموذج لإثبات فعالية تحليل قياس التدفق الخلوي التصويري في دراسة التجميع الذاتي الميكروبي. ينصب التركيز على تحليل استجابة التجميع الذاتي لأنواع Lactobacillus للكربوهيدرات البسيطة من النظام الغذائي. الطرق الأكثر استخداما لقياس التجميع الذاتي هي القياس الضوئي الطيفي ، الذي يقيس المعلقات الميكروبية أو التعكر أو الكثافة الضوئية ، وتقنيات الفحص المجهري التقليدية ، مثل المجال الساطع وتباين الطور والمجهر الفلوري.عند الحديث عن التصوير عالي الإنتاجية ، فإن أحد التحديات التجريبية الرئيسية هو تجزئة حدث واحد. في هذا البروتوكول ، هو تجميع واحد. يعالج قياس التدفق الخلوي التصويري هذا التحدي بأناقة ويمنح الباحثين أداة قوية لدراسة التجميع الذاتي.

imaging-flow-cytometry-to-study-microbial-autoaggregation

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

503 Views.  Ben-Gurion University of the Negev. استخدمت هذه الدراسة أنواع Lactobacillus كنموذج لإثبات فعالية تحليل قياس التدفق الخلوي التصويري في دراسة التجميع الذاتي الميكروبي. ينصب التركيز على تحليل استجابة التجميع الذاتي لأنواع Lactobacillus للكربوهيدرات البسيطة من النظام الغذائي. الطرق الأكثر استخداما لقياس التجميع الذاتي ه?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تطوير البحث في التجميع الذاتي الميكروبي باستخدام قياس التدفق الخلوي للتصوير

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The Lactobacillaceae family consists of Gram-positive bacteria with confirmed probiotic properties. This study utilizes Lactobacillaceae species as a model to demonstrate the effectiveness of single-cell high throughput analysis in studying cellular aggregation. The focus is on analyzing the response of these beneficial species to simple carbohydrates from the diet.
The study showcases how Imaging Flow Cytometry (IFC) can overcome the fundamental differences in the assembly of probiotic bacteria in the presence and absence of carbohydrates. IFC combines the power and speed of conventional flow cytometry with the spatial resolution of microscopy, enabling high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined manner across a library of beneficial bacterial strains and conditions. This protocol provides insights into the autoaggregation of Lactobacillaceae species and sheds light on their response to dietary carbohydrates, contributing to understanding the mechanisms behind the beneficial effects of these probiotic bacteria.

This protocol describes a quantitative approach to measure microbial autoaggregation using imaging flow cytometry.

Lactobacillaceae Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

Start by inoculating five milliliters of lactobacilli MRS broth with a single colony of the lactobacilli strain, incubated at 37 degrees Celsius under static conditions overnight. Dilute the cell culture in a one-to-100 ratio in three milliliters of 50%supplemented tryptic soy broth, vortex the culture, and incubate it. Then invert the tube to mix the cells in the medium before transferring 200 to 300 microliters of the sample into a 1.5 milliliter micro centrifuge tube.

الملبنة تحضير العينة لتحليل التدفق الخلوي

Flow Cytometric Data Acquisition of Microbial Aggregates

To begin the flow cytometric analysis, first set the 785-nanometer laser to a power of five milliwatts for dark field measurements. Use a 60X lens with a numerical aperture of 0.9. Then select the high-sensitivity setting and set the speed to low.To ensure calibration bead stability, press the Play button in the fluidics box and examine the bead images, which should appear sharp and clear. Generate a new scatterplot in the workspace box by selecting New Scatterplot. Then select the area in the Brightfield channel that corresponds to the SSC channel intensity and exclude the calibration beads that are running concurrently within the sample.Next, press the Load button and position a tube containing the Lactobacilli sample in the holder. In the Acquisition Settings box, enter the sample name and specify the location for data storage. Set the number of events to be collected, typically within the range of 10, 000 to 20, 000 events.Now, begin the acquisition process by clicking the Record button located in the Acquisition box. The process will halt after reaching the specified volume of events. Press the Return button to unload the tube and remove it from the holder as prompted in the popup window.After repeating the process for all samples, save the template to maintain data acquisition uniformity. For data analysis, to load the raw file into the analysis software, click on File and open the rif file. In the opened window, select Use Acquisition Analysis and then click OK.Next, to create a histogram of the gradient root mean square, click the New Histogram button and choose the population from the acquisition to analyze.Under the X Axis feature, select Gradient RMS of the Brightfield channel. Next, place a gate to exclude non-focused events by clicking the Create Line Region button in the analysis area. Create a scatterplot of the area versus the aspect ratio by clicking the New Scatterplot button in the analysis area.Select the focused population in the New Scatterplot window. Then select the area of the Brightfield channel for the X-Axis feature. Choose the aspect ratio for the Y-Axis feature.Draw a gate on the scatterplot using the Create Rectangle button based on the area value for the aggregate events population. Similarly, draw another gate for the singles and small aggregates population. Save your data analysis as a template by clicking the File tab, choosing Save As Template ast, and then open the next sample file under the same template to create the data analysis file.To measure the aggregate size distribution, start by plotting a histogram of the area of the aggregation events population. Save the data analysis by clicking on the file and selecting the Save As Template option. After saving, open the next sample file under the same template for the data analysis file.Single cells, small aggregates, large aggregates, and chains were observed in LGG and L.paracasei but it was not possible to distinguish between chains and larger aggregates. Significant variations in the aggregation characteristics of different LAB strains were observed in response to fermentable or non-fermentable sugars.