تم دعم هذا العمل من خلال منح بحثية من المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة في الصين (81671006 ، 81300894) ، صندوق CAMS للابتكار للعلوم الطبية (2019-I2M-5-038) ، مشروع بناء الانضباط السريري الرئيسي الوطني (PKUSSNKP-202102) ، صندوق الابتكار لمرشحي الدكتوراه المتميزين في مركز العلوم الصحية بجامعة بكين (BMU2022BSS001).

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لكلية ومستشفى جامعة بكين. تم الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى. تم تحديد عينات الأنسجة المستخدمة في هذه الدراسة. مخطط الدراسة موضح في الشكل 1.
1. إعداد العينة
<ol><li>قطع أنسجة التليف تحت المخاطي الفموي المثبتة بالبارافين إلى أقسام مستمرة بسمك 3 ميكرومتر و 10 ميكرومتر على ميكروتوم.</li>
	<li>افتح الأقسام في الماء ثم اصطاد على الشرائح. قم بإصلاح أقسام 3 ميكرومتر و 10 ميكرومتر على شرائح مجهر الالتصاق (الشريحة أ) وشرائح غشاء القلم (الشريحة ب) ، على التوالي.</li>
	<li>ضع الشرائح على طبق ساخن عند 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.</li>
</ol>2. تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين
<ol><li>ضع الشريحتين A و B في الزيلين (تنبيه) لمدة 10 دقائق وكرر هذه الخطوة ثلاث مرات.</li>
	<li>هيدرات الشرائح A و B في محاليل الإيثانول المتدرجة في حدود 100٪ و 100٪ و 90٪ و 80٪ و 70٪ لمدة 1 دقيقة في كل تركيز.</li>
	<li>ضع الشريحتين A و B في ماء مقطر عالي النقاء لمدة 30 ثانية</li>
	<li>ضع الشريحتين A و B في محلول صبغة الهيماتوكسيلين هاريس لمدة 90 ثانية.</li>
	<li>ضع الشريحتين A و B في ماء مقطر عالي النقاء لمدة 30 ثانية وكرر هذه الخطوة ثلاث مرات.</li>
	<li>ضع الشرائح A و B في محلول div-hematoxylin (تنبيه) لمدة 2 ثانية.</li>
	<li>ضع الشريحتين A و B في ماء مقطر عالي النقاء لمدة 30 ثانية وكرر هذه الخطوة ثلاث مرات.</li>
	<li>ضع الشرائح في A و B في محلول إعادة اللون الأزرق بنسبة 1٪ لمدة 2 ثانية.</li>
	<li>ضع الشريحتين A و B في ماء مقطر عالي النقاء لمدة 30 ثانية وكرر هذه الخطوة ثلاث مرات.</li>
	<li>ضع الشرائح في محلول eosin لمدة 2 ثانية.</li>
	<li>ضع الشريحتين A و B في ماء مقطر عالي النقاء لمدة 30 ثانية وكرر هذه الخطوة ثلاث مرات.</li>
	<li>قم بتجفيف الشرائح في محاليل الإيثانول المتدرجة بترتيب 70٪ و 80٪ و 90٪ و 100٪ و 100٪ لمدة 2 ثانية في كل تركيز.</li>
	<li>ضع الشريحة A في الزيلين لمدة 3 دقائق وكرر هذه الخطوة مرتين.</li>
	<li>أضف قطرة من وسيط التثبيت (ALERT) إلى الشريحة A وقم بتغطيتها بغطاء زجاجي.</li>
</ol>3. مراقبة التشكل النسيجي والتشريح المجهري لالتقاط الليزر
<ol><li>بدء تشغيل نظام وبرامج التشريح المجهري بالليزر (الشكل 2).</li>
	<li>ضع الشريحة A على مرحلة الشريحة ولاحظ التشكل النسيجي لتحديد مجال الاهتمام بالتشريح المجهري بالليزر.</li>
	<li>قم بإزالة الشريحة A ووضع الشريحة B عكسيا على مرحلة الشريحة.</li>
	<li>انقر فوق الزر "تفريغ " (الشكل 2) لدفع جهاز التجميع للخارج. أدخل أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في جهاز التجميع وتأكد من تثبيت الأنبوب. انقر على OK زر (الشكل 3).</li>
	<li>حدد غطاء بالنقر فوق الدائرة الحمراء المقابلة التي تشير إلى جهاز التجميع: أغطية الأنبوب. ستتحول الدائرة المحددة إلى اللون الأخضر.</li>
	<li>انقر على رسم زر ورسم + قص زر واستخدم الماوس لرسم منطقة الاهتمام.</li>
	<li>انقر على ابدأ قص زر لالتقاط منطقة الاهتمام ؛ سيتم جمع العينة التي تم التقاطها بواسطة الغطاء (الشكل 4).</li>
	<li>انقر فوق الزر السفلي لضمان جمع العينة الملتقطة (الشكل 5).</li>
	<li>انقر فوق الزر عينة لالتقاط العينة التالية.</li>
	<li>انقر فوق الزر "تفريغ " لتفريغ أنبوب PCR بالعينة الملتقطة.</li>
</ol>

التقاط عينات أنسجة التليف تحت المخاطي عن طريق الفم لتحليل المكاني - أوميكس

<ol>
	<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+submucous+fibrosis:+A+clinicopathological+study+of+674+cases+in+China.">Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China.</a> Journal of Oral Pathology &amp; Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).</li><li>Cai, X., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathological+factors+associated+with+progression+of+oral+submucous+fibrosis:+A+population-based+retrospective+study.">Clinicopathological factors associated with progression of oral submucous fibrosis: A population-based retrospective study.</a> Oral Oncology. 130, 105949 (2022).</li><li>Ray, J. G., Chatterjee, R., Chaudhuri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+submucous+fibrosis:+A+global+challenge.+Rising+incidence,+risk+factors,+management,+and+research+priorities.">Oral submucous fibrosis: A global challenge. Rising incidence, risk factors, management, and research priorities.</a> Periodontology 2000. 80 (1), 200-212 (2019).</li><li>Shih, Y. H., Wang, T. H., Shieh, T. M., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+submucous+fibrosis:+A+Review+on+etiopathogenesis,+diagnosis,+and+therapy.">Oral submucous fibrosis: A Review on etiopathogenesis, diagnosis, and therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 2940 (2019).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preliminary+exploration+of+immune+microenvironment+in+oral+leukoplakia+concomitant+with+oral+submucosal+fibrosis:+A+comparative+immunohistochemical+study.">The preliminary exploration of immune microenvironment in oral leukoplakia concomitant with oral submucosal fibrosis: A comparative immunohistochemical study.</a> Journal of Oral Pathology &amp; Medicine. , (2023).</li><li>Warnakulasuriya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+potentially+malignant+disorders:+A+consensus+report+from+an+international+seminar+on+nomenclature+and+classification,+convened+by+the+WHO+Collaborating+Centre+for+Oral+Cancer.">Oral potentially malignant disorders: A consensus report from an international seminar on nomenclature and classification, convened by the WHO Collaborating Centre for Oral Cancer.</a> Oral Diseases. 27 (8), 1862-1880 (2021).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+nomogram+prediction+model+for+malignant+transformation+of+oral+potentially+malignant+disorders.">Development and validation of a nomogram prediction model for malignant transformation of oral potentially malignant disorders.</a> Oral Oncology. 123, 105619 (2021).</li><li>Murthy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+transformation+rate+of+oral+submucous+fibrosis:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Malignant transformation rate of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis.</a> Journal of Clinical Medicine. 11 (7), 1793 (2022).</li><li>Kujan, O., Mello, F. W., Warnakulasuriya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+transformation+of+oral+submucous+fibrosis:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Malignant transformation of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis.</a> Oral Diseases. 27 (8), 1936-1946 (2020).</li><li>Qin, X., Ning, Y., Zhou, L., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+submucous+fibrosis:+Etiological+mechanism,+malignant+transformation,+therapeutic+approaches+and+targets.">Oral submucous fibrosis: Etiological mechanism, malignant transformation, therapeutic approaches and targets.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (5), 4992 (2023).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+and+spatial+dissection+of+precancerous+lesions+underlying+the+initiation+process+of+oral+squamous+cell+carcinoma.">Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma.</a> Cell Discovery. 9 (1), 28 (2023).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineating+the+dynamic+evolution+from+preneoplasia+to+invasive+lung+adenocarcinoma+by+integrating+single-cell+RNA+sequencing+and+spatial+transcriptomics.">Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 54 (11), 2060-2076 (2022).</li><li>Ji, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+analysis+of+composition+and+spatial+architecture+in+human+squamous+cell+carcinoma.">Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma.</a> Cell. 182 (2), 497-514 (2020).</li><li>Van den Bossche, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-driven+intratumoral+heterogeneity+in+head+and+neck+cancers:+clinical+challenges+and+opportunities+for+precision+medicine.">Microenvironment-driven intratumoral heterogeneity in head and neck cancers: clinical challenges and opportunities for precision medicine.</a> Drug Resistance Updates. 60, 100806 (2022).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+in+the+risk+assessment+of+oral+leukoplakia+through+morphology-related+copy+number+analysis.">Improvement in the risk assessment of oral leukoplakia through morphology-related copy number analysis.</a> Science China. Life sciences. 64 (9), 1379-1391 (2021).</li><li>Watkins, T. B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+chromosomal+instability+and+karyotype+order+in+tumour+evolution.">Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution.</a> Nature. 587 (7832), 126-132 (2020).</li><li>Odell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+and+loss+of+heterozygosity+as+risk+markers+for+malignant+transformation+in+oral+mucosa.">Aneuploidy and loss of heterozygosity as risk markers for malignant transformation in oral mucosa.</a> Oral Diseases. 27 (8), 1993-2007 (2021).</li><li>Wood, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+road+to+invasion-examining+the+similarities+and+differences+in+the+genomes+of+associated+oral+pre-cancer+and+cancer+samples.">The genomic road to invasion-examining the similarities and differences in the genomes of associated oral pre-cancer and cancer samples.</a> Genome Medicine. 9 (1), 53 (2017).</li><li>Venugopal, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+proteomics+based+on+2D+gel+electrophoresis+and+mass+spectrometry+with+validations:+Identification+of+a+biomarker+compendium+for+oral+submucous+fibrosis-An+indian+study.">Integrated proteomics based on 2D gel electrophoresis and mass spectrometry with validations: Identification of a biomarker compendium for oral submucous fibrosis-An indian study.</a> Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 208 (2022).</li><li>Kundu, P., Pant, I., Jain, R., Rao, S. G., Kondaiah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+DNA+methylation+changes+in+oral+submucous+fibrosis.">Genome-wide DNA methylation changes in oral submucous fibrosis.</a> Oral Diseases. 28 (4), 1094-1103 (2022).</li><li>Cai, X., Zhang, H., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-target+pharmacological+mechanisms+of+Salvia+miltiorrhiza+against+oral+submucous+fibrosis:+A+network+pharmacology+approach.">Multi-target pharmacological mechanisms of Salvia miltiorrhiza against oral submucous fibrosis: A network pharmacology approach.</a> Archives of Oral Biology. 126, 105131 (2021).</li><li>Xiao, X., Hu, Y., Li, C., Shi, L., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+content+abnormality+in+oral+submucous+fibrosis+concomitant+leukoplakia:+A+preliminary+evaluation+of+the+diagnostic+and+clinical+implications.">DNA content abnormality in oral submucous fibrosis concomitant leukoplakia: A preliminary evaluation of the diagnostic and clinical implications.</a> Diagnostic Cytopathology. 48 (11), 1111-1114 (2020).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+expression+profile+associated+with+malignant+progression+of+oral+submucous+fibrosis.">Long non-coding RNA expression profile associated with malignant progression of oral submucous fibrosis.</a> Journal of Oncology. 2019, 6835176 (2019).</li><li>Lunde, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+chromosomal+changes+in+potentially+malignant+and+malignant+oral+mucosal+lesions+from+South+and+Southeast+Asia+using+array-comparative+genomic+hybridization.">Profiling of chromosomal changes in potentially malignant and malignant oral mucosal lesions from South and Southeast Asia using array-comparative genomic hybridization.</a> Cancer Genomics &amp; Proteomics. 11 (3), 127-140 (2014).</li><li>Sun, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+resolved+metabolomics+to+discover+tumor-associated+metabolic+alterations.">Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (1), 52-57 (2019).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+alteration+profiling+facilitates+differential+diagnosis+between+ossifying+fibroma+and+fibrous+dysplasia+of+the+jaws.">Copy number alteration profiling facilitates differential diagnosis between ossifying fibroma and fibrous dysplasia of the jaws.</a> International Journal of Oral Science. 13 (1), 21 (2021).</li></ol>

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

أبلغ هذا البروتوكول عن خط أنابيب لالتقاط عينات أنسجة OSF مع المعلومات المورفولوجية والمكانية لمزيد من التحليلات المكانية من خلال التشريح المجهري بالليزر. من النتائج التمثيلية ، حددنا أنماط CNA المختلفة بين العينات المختلفة المتعلقة بالمورفولوجيا.
OSF ، وهو نوع من OPMD ، هو حالة ...

التليف تحت المخاطي للفم (OSF) هو مرض مزمن خبيث يتطور بشكل رئيسي في الغشاء المخاطي الشدقي ويؤدي إلى تقييد فتح الفم1. في حين أن OSF هو مرض متعدد العوامل ، فإن مضغ جوز الأريكا أو جوز التنبول هو السبب الرئيسي ل OSF 2,3. بسبب هذه العادة المحددة جغرافيا ، يتركز OSF في الغالب في السكان في جنوب شرق وجنوب آسيا3. تشمل السمات النسيجية الشائعة ل OSF ترسب الكولاجين غير الطبيعي في النسيج الضام تحت ظهارة الغشاء المخاطي للفم ، وتضيق الأوعية الدموية ، والانسداد1. يمكن أن يظهر النسيج الظهاري OSF مع مظاهر ضمور أو تضخم وحتى خلل التنسج عندما يصاحب ذلك الطلاوةالفموية 4,5.
تعرف منظمة الصحة العالمية OSF بأنه اضطراب شائع يحتمل أن يكون خبيثا عن طريق الفم (OPMD) يظهر إمكانية التقدم إلى سرطان الخلايا الحرشفية الفموي بمعدل تحول خبيث يبلغ 4٪ -6٪ 6،7،8،9. الآلية الكامنة وراء التحول الخبيث ل OSF معقدة10. النمو غير الطبيعي للظهارة ، بما في ذلك خلل التنسج والضمور ، يزيد من احتمال التسرطن ، وقد تشارك الخلايا الليفية الهرمة في السدى في التطور الخبيث ل OSF عن طريق إحداث الانتقال الظهاري الوسيطة (EMT) من خلال أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) والجزيئات الأخرى10.
ولدت تقنيات التحليلات المكانية الأوميك بيانات متعددة الأوميك مع المعلومات المورفولوجية والمكانية التي قدمت نظرة ثاقبة لآليات السرطان11،12،13. هنا ، نقدم بروتوكولا لالتقاط مجموعات الخلايا المرتبطة بالتشكل من أنسجة OSF المضمنة بالبارافين المثبتة بالفورمالين عن طريق التشريح المجهري بالليزر. يمكن للتحليلات متعددة الأوميك لهذه العينات التغلب على التحديات المتعلقة بعدم التجانس داخل الأنسجة وزيادة فهم علم الأمراض الجزيئي وآليات التحول الخبيث في OSF14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesion microscope slides</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>REF.188105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Div-haematoxylin</td>
			<td>YiLi</td>
			<td>20230326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin solution</td>
			<td>BASO</td>
			<td>BA4098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>PEKING REAGENT</td>
			<td>No.32061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris hematoxylin dye solution</td>
			<td>YiLi</td>
			<td>20230326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>HI1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser capture microdissection system</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>LMD7</td>
			<td>Machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser microdissection microsystem</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>8.2.3.7603</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromount mounting medium</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>REF.3801731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>REF.10212450C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>16421959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN-membrane slides</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>No.11505158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Re-blue solution</td>
			<td>YiLi</td>
			<td>20230326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>REF.10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>PEKING REAGENT</td>
			<td>No.33535</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cells with morphological and spatial information from oral submucous fibrosis samples by laser capture microdissection

التليف تحت المخاطي الفموي (OSF) هو نوع شائع من الاضطرابات الخبيثة المحتملة في تجويف الفم. غالبا ما يتم العثور على ضمور الظهارة والتليف في الصفيحة المخصوصة وتحت المخاطية على الشرائح النسيجية. تم اقتراح خلل التنسج الظهاري ، وضمور الظهارة ، والخلايا الليفية الهرمة لتكون مرتبطة بالتحول الخبيث ل OSF. ومع ذلك ، بسبب عدم تجانس اضطرابات الفم الخبيثة المحتملة وسرطان الخلايا الحرشفية الفموية ، من الصعب تحديد الآليات الجزيئية المحددة للتحول الخبيث في OSF. هنا ، نقدم طريقة للحصول على عدد صغير من الخلايا الظهارية أو الوسيطة التي تحمل البيانات المورفولوجية والمعلومات المكانية عن طريق التشريح المجهري لالتقاط الليزر على شرائح الأنسجة المضمنة في البارافين المثبتة بالفورمالين. باستخدام المجهر ، يمكننا التقاط الأنسجة الظهارية المخمورية أو الضامرة بدقة (~ 500 خلية) والأنسجة تحت الظهارية الليفية. يمكن تقييم الخلايا المستخرجة عن طريق تسلسل الجينوم أو النسخ للحصول على البيانات الجينومية والنسخ مع المعلومات المورفولوجية والمكانية. يزيل هذا النهج عدم تجانس تسلسل أنسجة OSF السائبة والتداخل الناجم عن الخلايا في المناطق غير المصابة ، مما يسمح بإجراء تحليل مكاني دقيق لأنسجة OSF.

Oral submucous fibrosis (OSF) is a chronic, insidious disease that develops mainly in the buccal mucosa and results in restricted mouth opening1. While OSF is a multifactorial disease, areca nut or betel nut chewing is the main cause of OSF2,3. Because of this geographically specific habit, OSF is predominantly concentrated in populations in Southeast and South Asia3. The common histological features of OSF include abnormal collagen deposition in the connective tissue beneath the oral mucosal epithelium, vascular stenosis, and occlusion1. OSF epithelial tissue can present with manifestations of atrophy or hyperplasia and even dysplasia when concomitant with oral leukoplakia4,5.
OSF is defined by the World Health Organization as a common oral potentially malignant disorder (OPMD) that exhibits the potential to progress to oral squamous cell carcinoma with a malignant transformation rate of 4%-6%6,7,8,9. The mechanism underlying the malignant transformation of OSF is complex10. Abnormal growth of the epithelium, including both dysplasia and atrophy, increases the potential for carcinogenesis, and senescent fibroblasts in the stroma may be involved in the malignant progression of OSF by inducing epithelial-mesenchymal transition (EMT) through reactive oxygen species (ROS) and other molecules10.
Technologies for spatial-omic analyses generated multi-omic data with morphological and spatial information that have provided insights into cancer mechanisms11,12,13. Here, we present a protocol to capture morphology-related cell populations from formalin-fixed paraffin-embedded OSF tissue by laser microdissection. Multi-omic analyses of these samples can overcome challenges with intratissue heterogeneity and increase understanding of the molecular pathology and mechanisms of malignant transformation in OSF14.

تسليط الضوء على المؤلف: فتح أسرار الأورام الخبيثة المحتملة عن طريق الفم 

عزل الخلايا بالمعلومات المورفولوجية والمكانية من عينات التليف تحت المخاطي للفم عن طريق التشريح المجهري لالتقاط الليزر

Our main research interests are the mechanisms of malignant transformation under the development of predictive models of oral, potentially malignant disorders such as oral leukoplakia and oral submucous fibrosis. Genomic transcriptomic, proteomic, and other multi-omic sequencing analysis under deep learning artificial intelligence models are used to study the progression from oral, potentially malignant disorders to oral cancer. Current sequencing and multi-omics analysis are mostly based on frozen samples, but oral, potentially malignant disorders are mostly formally fixed paraffin embedded tissue, often by biopsy, and they the need to develop experimental techniques based on paraffin samples.Paraffin tissue samples from oral, potentially malignant disorders, and the squamous cell carcinoma are available in large numbers and from a variety of sources, making them a very valuable resource for study. All protocol can help fully use these resources to better understand the mechanisms of disease development and malignant transformation.

من خلال إجراء التشريح المجهري بالليزر لأنسجة OSF ، التقطنا عينات من ظهارة خلل التنسج ، وسدى تحت ظهارة خلل التنسج ، وظهارة ضامرة ، وسدى تحت الأنسجة الظهارية الضامرة (الشكل 1). من خلال استخراج الحمض النووي وتسلسل الجينوم الكامل منخفض العمق ، تمكنا من تحليل تعديلات رقم النسخ الم...

Watch this Scientific Journal Video about Unlocking the Mysteries of Oral Potential Malignancies at JoVE.com

يسمح التشريح المجهري لالتقاط الليزر لأنسجة التليف تحت المخاطي عن طريق الفم بالاستخراج الدقيق للخلايا من المناطق النسيجية ذات الأهمية لتحليل البيانات متعددة الأوميكس بالمعلومات المورفولوجية والمكانية.

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina ...

اهتماماتنا البحثية الرئيسية هي آليات التحول الخبيث في ظل تطوير نماذج تنبؤية للاضطرابات الفموية الخبيثة المحتملة مثل الطلاوة الفموية والتليف تحت المخاطي الفموي. يتم استخدام تحليل النسخ الجينومي والبروتيني وغيره من تحليل التسلسل متعدد الأوميك في إطار نماذج الذكاء الاصطناعي للتعلم العميق لدراسة التقدم من الاضطرابات الفموية الخبيثة المحتملة إلى سرطان الفم. يعتمد التسلسل الحالي والتحليل متعدد الأوميكس في الغالب على العينات المجمدة ، ولكن الاضطرابات الفموية التي يحتمل أن تكون خبيثة هي في الغالب أنسجة مدمجة في البارافين ثابتة رسميا ، غالبا عن طريق الخزعة ، وهي بحاجة إلى تطوير تقنيات تجريبية تعتمد على عينات البارافين.تتوفر عينات أنسجة البارافين من الاضطرابات الفموية والخبيثة المحتملة وسرطان الخلايا الحرشفية بأعداد كبيرة ومن مجموعة متنوعة من المصادر ، مما يجعلها موردا قيما للغاية للدراسة. يمكن أن تساعد جميع البروتوكولات في استخدام هذه الموارد بشكل كامل لفهم آليات تطور المرض والتحول الخبيث بشكل أفضل.

isolation-cells-with-morphological-spatial-information-from-oral

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Cells with Morphological and Spatial Information from Oral Submucous Fibrosis Samples by Laser Capture Microdissection

765 Views.  Peking University School and Hospital of Stomatology & National Center of Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & National Engineering Research Center of Oral Biomaterials and Digital Medical Devices. اهتماماتنا البحثية الرئيسية هي آليات التحول الخبيث في ظل تطوير نماذج تنبؤية للاضطرابات الفموية الخبيثة المحتملة مثل الطلاوة الفموية والتليف تحت المخاطي الفموي. يتم استخدام تحليل النسخ الجينومي والبروتيني وغيره من تحليل التسلسل متعدد الأوميك في إطار نماذج الذكاء الاصطن?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: فتح أسرار الأورام الخبيثة المحتملة عن طريق الفم 

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina propria and the submucosa are often found on histopathological slides. Epithelial dysplasia, epithelial atrophy, and senescent fibroblasts have been proposed to be associated with the malignant transformation of OSF. However, because of the heterogeneity of potentially malignant oral disorders and oral squamous cell carcinoma, it is difficult to identify the specific molecular mechanisms of malignant transformation in OSF. Here, we present a method to obtain a small number of epithelial or mesenchymal cells carrying morphological data and spatial information by laser capture microdissection on formalin-fixed paraffin-embedded tissue slides. Using a microscope, we can precisely capture microscale (~500 cells) dysplastic or atrophic epithelial tissue and fibrotic subepithelial tissue. The extracted cells can be evaluated by genome or transcriptome sequencing to acquire genomic and transcriptomic data with morphological and spatial information. This approach removes the heterogeneity of bulk OSF tissue sequencing and the interference caused by cells in non-lesioned areas, allowing for precise spatial-omics analysis of OSF tissue.

Laser capture microdissection of oral submucous fibrosis tissues allows for precise extraction of cells from histological regions of interest for the analysis of multi-omics data with morphological and spatial information.

Oral Submucous Fibrosis Tissue Sample Preparation for Hematoxylin-Eosin Staining

To begin, using a microtome, cut the formalin fixed paraffin embedded oral submucous fibrosis tissues into continuous sections of three in 10 micrometers thickness, then unfold the sections in water. Place three micron sections on the adhesion microscope slide or slide A, and 10 microns on pen membrane slide or slide B.Place both slides on a hot plate at 60 degrees Celsius. After two hours, place slides A and B in xylene for 10 minutes, then hydrate the slides in graded ethanol concentrations for one minute in each concentration.Next, place the slides in ultrapure distilled water for 30 seconds. Soak slides in Harris hematoxylin dye solution for 90 seconds. Again wash the slides thrice in ultrapure distilled water for 30 seconds each.After that, submerge the slides in div-hematoxylin solution for two seconds. Return slides into ultrapure distilled water for 30 seconds, repeating three times. Next, immerse slides A and B in 1%re-blue solution for two seconds.After washing the slides with distilled water, place them in an eosin solution for two seconds. Again immerse slides in ultrapure distilled water for 30 seconds before dehydrating and increasing ethanol concentrations, then immerse slide A in xylene for three minutes. Finally, apply a drop of the mounting medium to slide A, and cover it with a glass cover.

تحضير عينة نسيج التليف تحت المخاطي عن طريق الفم لتلطيخ الهيماتوكسيلين-إيوسين

Laser Capture Microdissection of Oral Submucous Fibrosis Tissues for Morphology and Spatial Information Analysis

To begin, turn on the Laser Microdissection system and software. Place slide A containing stained three-micron sections of oral submucous fibrosis tissues on the slide stage. Observe the histological morphology to identify the area of interest for laser microdissection.Remove slide A and place slide B with the tissue side facing down on the slide stage. Next, click the Unload button to push out the collection device. Insert a PCR tube into the collection device and ensure the tube is fixed.Then click the Okay button. Select a cap by clicking the corresponding red circle, marking the collector device to tube caps, and wait until the selected circle turns green. Then click the Draw button and Draw plus Cut button and use the mouse to sketch the area of interest.Click on Start Cut to capture the area of interest, which will be collected by the cap. Then press the lower button to ensure the captured sample is collected. Click the specimen button to capture the next sample.Finally, click Unload to unload the PCR tube with the captured sample. In this study, using laser microdissection of oral submucous fibrosis, tissues of epithelium and stroma with different patterns are captured. Copy number alternations were present in epithelial samples but not in stroma samples.The copy number alternations pattern in the dysplastic epithelium was observed in chromosomes three and eight, while copy number alternations were detected at a lower frequency in chromosome eight in the atrophic epithelium.