نحن نعترف بمختبر الفحص المجهري / الطيفي المتقدم بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس ومركز التميز Leica Microsystems في معهد كاليفورنيا للأنظمة النانوية (RRID: SCR_022789) لتوفير مجهر ثنائي الفوتون. تم دعم AS من قبل ISF 604-21 من مؤسسة العلوم الإسرائيلية. تم دعم JH من قبل R03DE030205 و R01DE030471 من المعاهد الوطنية للصحة / NIDCR. كما تم دعم AS و JH من خلال 2021007 المنح من مؤسسة العلوم ثنائية القومية بين الولايات المتحدة وإسرائيل (BSF).

تم الحفاظ على جميع الفئران في مرافق حيوانية خالية من مسببات الأمراض في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (UCLA) أو الجامعة العبرية في القدس (HUJI). تم إجراء جميع التجارب التي شملت الفئران وفقا للوائح والبروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية المعنية لرعاية واستخدام (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) أو (MD-23-17184-3; هوجي). يظهر سير العمل العام للخطوات التجريبية في الشكل 2 أ. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع الأدوات والكواشف والمواد المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. إعداد الحلول والمواد الهلامية
<ol><li>وسط التشريح: قم بإعداد DMEM / F12 الطازج مع 0.5٪ جلوكوز واحتفظ به دافئا عند 37 درجة مئوية حتى الحاجة إليه في الخطوة 2.4. ملاحظة: نستخدم DMEM / F12 بدون الفينول الأحمر لتقليل التألق الذاتي أثناء التصوير الحي.</li>
	<li>1x وسط ثقافة: تحضير وسط طازج باستخدام 50٪ DMEM / F12 ، مصل الفئران 50٪ ، 1x بديل الجلوتامين ، 1x أحماض أمينية غير أساسية MEM ، 1٪ جلوكوز ، 0.1 مجم / مل حمض الأسكوربيك ، و 0.5٪ بنسلين ستربتومايسين. احتفظ بها دافئة عند 37 درجة مئوية حتى الحاجة إليها في الخطوة 5.5. تستخدم هذه الوسيلة لزراعة نباتات القواطع أثناء التصوير الحي. ملاحظة: يجب أن يكون مصل الفئران عالي الجودة ومعدا خصيصا لزراعة الأنسجة الكاملة من قبل الباحثين أو من مصدر تجاري. على وجه الخصوص ، يجب طرد الدم بالطرد المركزي (لمدة 5 دقائق عند 1200 × جم في درجة حرارة الغرفة) قبل أن يبدأ التخثر في التكون. بعد الطرد المركزي ، يجب ضغط جلطة الفيبرين الناتجة والتخلص منها33.</li>
	<li>جل الثقافة: الغرض من الجل هو شل حركة العينات أثناء التصوير ويتم تحضيرها طازجة.<ol><li>اصنع 2٪ جل في DMEM / F12 عن طريق إذابة 200 مجم من أغاروز نقطة الانصهار المنخفضة في 10 مل من DMEM / F12 باستخدام الميكروويف. احفظ الجل 2٪ عند 37 درجة مئوية.</li>
		<li>اصنع وسطا للاستزراع 2x (بدون DMEM / F12) عن طريق خلط 50٪ مصل الفئران ، 1x بديل الجلوتامين ، 1x أحماض أمينية غير أساسية MEM ، 1٪ جلوكوز ، 0.1 مجم / مل L-حمض الأسكوربيك ، و 0.5٪ بنسلين ستربتومايسين. قم بتسخين وسط الاستزراع 2x (بدون DMEM / F12) إلى 37 درجة مئوية.</li>
		<li>اصنع جل استزراع 1٪ عن طريق خلط كميات متساوية من 2٪ جل ووسط استزراع 2x (بدون DMEM / F12). احتفظ بجل المستنبتة 1٪ عند 37 درجة مئوية حتى الحاجة إليه في الخطوة 5.1. ملاحظة: تأكد من أن جميع المحاليل دافئة قبل الخلط لتجنب التبلور. وجدنا أن 1٪ جل مناسب لزراعة قاطعة الماوس البالغة. يجب تحديد نسبة الجل تجريبيا إذا كان سيتم زراعة الأنسجة الأخرى.</li>
	</ol></li>
</ol>2. استخراج الفك السفلي للفأر البالغ
<ol><li>القتل الرحيم للفئران في العمر المطلوب باستخدام الإجراءات القياسية المعتمدة من قبل IACUC. ملاحظة: هنا نستخدم اختناق CO2 متبوعا بخلع عنق الرحم. قد تختلف لوائح القتل الرحيم للحيوانات في مناطق مختلفة. يجب على الباحثين الحصول على الموافقة المؤسسية اللازمة قبل إجراء التجارب وضمان الامتثال للوائح رعاية المحلية.</li>
	<li>تطهير الماوس باستخدام 70 ٪ من الإيثانول.</li>
	<li>قطع رأس الماوس واستخراج الفك السفلي الأيسر والأيمن.<ol><li>ضع الماوس على بطنه ، ثم استخدم شفرة حلاقة صناعية أحادية الحافة # 9 لقطع منطقة الرقبة وفصل رأس الماوس عن بقية الجسم. ملاحظة: إذا كان سيتم جمع الأنسجة من البلعوم أو منطقة الرقبة أيضا ، فلا ينبغي إجراء قطع الرأس ، ويمكن للمرء المتابعة مباشرة إلى الخطوة 2.3.2.</li>
		<li>اقلب الماوس بحيث يكون جانبه البطني متجها لأعلى ويمكن الوصول إلى الفك السفلي بسهولة.</li>
		<li>قم بتأمين رأس عن طريق إمساكه برفق بين الإبهام والسبابة.</li>
		<li>استخدم شفرة الحلاقة لعمل شق منتصف السهمي يقطع جلد الفك السفلي من الشفة السفلية باتجاه خط العنق. ملاحظة: يمكن أيضا استخدام شفرة جراحية # 15 لإجراء الشق والتشريح اللاحق (الخطوات 2.3.6-2.3.9).</li>
		<li>أثناء إجراء الشق ، انشر الجلد المقطوع باستخدام الإبهام والسبابة لكشف العضلات وعظم الفك تحتها.</li>
		<li>استخدم شفرة الحلاقة لقطع عضلات العضل على الجانب الشدقي من الفك السفلي ، بحيث يكون الجزء الخارجي من النصف الأيسر والأيمن خاليا الآن من ملحقات العضلات.</li>
		<li>قطع العضلات النخاعية اللامية على طول الجانب الداخلي من الفك السفلي لإزالة المرفقات العضلية هناك.</li>
		<li>قم بعمل شق آخر في ارتفاق الفك السفلي الذي يربط بين نصفي الدم. بمجرد القطع ، سيتم فصل الفك السفلي إلى النصفين الأيسر والأيمن.</li>
		<li>إسفين شفرة الحلاقة بين لقمة الفك السفلي ومفصل الفك السفلي الصدغي وتشريح بعناية من hemimandible من بقية الرأس. ملاحظة: وجدنا أنه من المفيد سحب القاطعة برفق في نفس الوقت أثناء القطع. يجب توخي الحذر لتجنب كسر الفك السفلي وإتلاف الأنسجة الرخوة بداخله.</li>
	</ol></li>
	<li>انقل الفك السفلي المقطعي على الفور إلى طبق بتري باستخدام وسائط التشريح الدافئة (الخطوة 1.1) وقم بإزالة الأنسجة العضلية المتبقية باستخدام شفرة جراحية # 15. ملاحظة: يؤدي الاحتفاظ بالعينات في الوسائط الباردة إلى إبطاء أنشطة الخلايا ، مما يؤدي إلى تأخير أو حتى فشل عمليات استرداد بعض أنشطة الخلايا ، مثل التكاثر أو حركة الخلايا ، أثناء التصوير الحي.</li>
</ol>3. عزل قواطع الماوس بأكملها
ملاحظة: يتم إجراء مزيد من العزل للقواطع تحت مجهر تشريح المجال الساطع.
<ol><li>حدد بصريا المنطقة البيضاوية من الفك السفلي التي تغطي مقبس القاطعة وتضم الجزء القمي من القاطعة.</li>
	<li>ضع الفك السفلي بحيث يكون السطح الداخلي (اللساني) متجها لأعلى.</li>
	<li>أثناء تثبيت الفك السفلي في مكانه باستخدام ملقط مسنن ، قم بإنشاء نافذة في المنطقة البيضاوية عن طريق حلق عظم الغشاء المغطي باستخدام شفرة جراحية # 15 ، في اتجاه من اللقمة نحو الأضراس. هذا يكشف الأنسجة الرخوة للقاطعة القمية على السطح الداخلي.</li>
	<li>اقلب الفك السفلي بحيث يكون السطح الخارجي (الشدق) متجها لأعلى.</li>
	<li>قم بإنشاء نافذة في المنطقة البيضاوية على الفك السفلي الخارجي كما هو موضح في الخطوة 3.3 واستخدم طرف المشرط لالتقاط أي شظايا عظمية متبقية عند الحافة. تأكد من أن الطرف القمي للسن مرئي من كلا الجانبين. ملاحظة: تجنب الضغط المفرط أثناء حلق العظام لمنع تلف الأنسجة الرخوة الأساسية.</li>
	<li>قطع العظام المحيطة بالقاطعة بشكل منهجي لعزل السن بأكمله.<ol><li>قم بعمل قطع نظيف في مستوى مجاور مباشرة للقاطعة القمية لإزالة عملية اللقمة أولا. ملاحظة: احرص على عدم قطع القاطعة.</li>
		<li>جعل قطع الثانية فقط الخلفي إلى الضرس 3 ، ولكن الظهرية إلى القاطعة دون الإضرار بالسن. هذا يزيل العظم الذي يتضمن عملية الإكليل.</li>
		<li>قطع متسلسل من طرف العملية الزاوية نحو القاطعة لإزالة الفك السفلي البطني تدريجيا بطريقة تدريجية. ملاحظة: غالبا ما تكون ظهارة الأسنان وأنسجة اللثة المرتبطة بها عالقة في العظم ويمكن اقتلاعها بسهولة إذا تم قطع جزء كبير من العظم البطني دفعة واحدة. لفصل العظم عن الأنسجة الرخوة القاطعة ، يمكن للمرء إدخال المشرط (أو زوج من الملقط الحاد غير المسنن) بين النسجين في الطرف القمي للقاطعة وتحريك الأداة بدقة للأمام.</li>
		<li>قطع العظم السنخي مع الأضراس وأي عظام متبقية لا تزال متصلة بالقاطعة.</li>
		<li>القاطعة بأكملها معزولة الآن. انقل القاطعة التي تم تشريحها بالكامل إلى طبق به وسائط تشريح دافئة ونظيفة (الخطوة 1.1).</li>
	</ol></li>
	<li>كرر الخطوات من 3.2 إلى 3.6 لعزل القواطع الإضافية حسب الحاجة. ملاحظة: تحافظ القواطع الفكية / العلوية للفأر أيضا على الخلايا الجذعية البالغة ويمكن استخدامها لدراسة تجديد الأسنان34. يركز باحثو طب الأسنان عادة على القواطع السفلية لأنها أكثر سهولة ويمكن تشريحها بسهولة أكبر من القواطع العلوية. لا يزال يتعين تحديد الاختلافات بين الخلايا السلفية القاطعة للفك السفلي والفك العلوي.</li>
</ol>4. إزالة أنسجة اللثة لفضح حلقة عنق الرحم الظهارية القاطعة
<ol><li>مع وضع القاطعة بأكملها على جانبها اللساني وأثناء تثبيت السن في مكانه باستخدام ملقط مسنن ، استخدم زوجا من الملقط الناعم # 5 لبدء دس أنسجة اللثة التي تغطي القاطعة القمية ومنطقة حلقة عنق الرحم.</li>
	<li>انزع بعناية أنسجة اللثة من البرعم القمي ، بحيث يصبح الجانب الجانبي من حلقة عنق الرحم (أو مناطق أخرى ذات أهمية) مرئيا تحت النطاق. ملاحظة: يجب توخي الحذر لتجنب إتلاف ظهارة الأسنان أو فصلها عن اللحمة المتوسطة. إذا كان القواطع تحتوي على إشارات مضان في المنطقة محل الاهتمام ، وكان مجهر تشريح الفلورسنت متاحا ، فيمكن استخدام إشارات التألق للمساعدة في التمييز بين أنواع الأنسجة وتشريح المساعدة. من المهم تنفيذ الأقسام 2-4 بكفاءة حتى يمكن نقل العينات بسرعة إلى وسط الاستزراع وصيانتها بشكل كاف من خلال الاستزراع المزروع (انظر أدناه).</li>
</ol>5. تضمين الأنسجة لثقافة النبات
<ol><li>أضف 500 ميكرولتر من جل الاستزراع الدافئ غير الصلب إلى بئر في صفيحة مكونة من 24 بئرا وانقل القواطع الكاملة المشرحة بسرعة إلى البئر. قم بتدوير اللوحة عدة مرات لشطف القواطع.</li>
	<li>أضف 400 ميكرولتر من جل الثقافة الدافئ غير الصلب إلى طبق الاستزراع وانقل القواطع المغسولة إلى الطبق. ملاحظة: نستخدم طبق استزراع متوفر تجاريا ومتوافق مع إعداد التروية. راجع الخطوة 6.4 للحصول على خيارات بديلة.</li>
	<li>قم بتوجيه القاطعة لوضع منطقة حلقة عنق الرحم (أو مناطق أخرى ذات أهمية) في وسط الطبق (الشكل 2 أ ، ب) واضبط إمالة القاطعة القمية لمستوى التصوير المطلوب. ملاحظة: يجب أن يتم توجيه الأنسجة بسرعة قبل الهلام الكامل.</li>
	<li>بعد ضبط الجل ، استخدم زوجا من الملقط الدقيق لإزالة أي هلام أعلى المنطقة محل الاهتمام حتى لا يتم تغطيته بالهلام.</li>
	<li>أضف كمية كافية من وسائط الاستزراع الدافئة عن طريق سحبها ببطء على حافة الطبق لتغطية العينة فقط (~ 150 ميكرولتر).</li>
	<li>انقل مزرعة الزرع إلى حاضنة زراعة الخلايا 37 درجة مئوية للسماح باستقرار الأنسجة والتكيف مع حالة المزرعة لمدة 1 ساعة.</li>
</ol>6. الفحص المجهري الفاصل الزمني لمحطات القواطع
ملاحظة: في هذه التجربة ، استخدمنا مجهرا رأسيا مزودا بهدف غمس الماء 25x بفتحة عددية تبلغ 1. بشكل عام ، تعد عدسة غمس الماء ذات الفتحة العددية العالية هي الأنسب لتصوير الأنسجة العميقة.
<ol><li>قم بتشغيل المجهر والليزر ثنائي الفوتون.</li>
	<li>ثبت طبق الاستزراع بمحول المسرح وقم بتركيب حلقة محول التروية في الأعلى (الشكل 2 ج).</li>
	<li>قم بتوصيل محول المرحلة بجهاز التحكم في درجة الحرارة المحدد للحفاظ على الثقافة عند 37 درجة مئوية.</li>
	<li>قم بتوصيل مدخل ومخرج حلقة المحول بمضخة التروية الدقيقة وابدأ نضح وسط الاستزراع ، مع ضبط سرعة التروية على 20 على المضخة. وهذا يولد تدفقا بطيئا (~ 5 مل / ساعة) لوسط الاستزراع فوق الجزء العلوي من العينات (الشكل 2C). ملاحظة: انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول النظام للحفاظ على الأنسجة في بيئة يتم التحكم فيها بثبات. يمكن استخدام أنظمة أخرى أيضا. يمكن أيضا استخدام مزيج من صفيحة تسخين 37 درجة مئوية وطبق استزراع التروية محلي الصنع (الشكل التكميلي S1) مع مدخل ومخرج متصل بمضخات الحقن.</li>
	<li>ضع حلقة حاجز التحكم في الغلاف الجوي (ACBR) أعلى حلقة المحول وقم بخفض الهدف من خلال ACBR لمجرد الاتصال بوسط الاستزراع (الشكل 2D).</li>
	<li>اضبط الطول الموجي لليزر على 920 نانومتر لتصور كل من إشارات GFP والتألق الأحمر (على سبيل المثال ، tdTomato).</li>
	<li>حدد موقع العينات من خلال العدسات ثم على برنامج المجهر.</li>
	<li>قم بإعداد مكدسات Z والتصوير متعدد المواضع والفترات الزمنية باستخدام البرنامج. لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم حجم z-step يبلغ 4 ميكرومتر وفاصل زمني قدره 5 دقائق لمدة 14 ساعة. ملاحظة: وجدنا أن الفاصل الزمني الذي يزيد عن 5 دقائق غالبا ما يكون غير كاف لالتقاط حركات الخلايا الملساء والانقسامات.</li>
	<li>بدء التصوير بفاصل زمني. ملاحظة: قد يتغير موضع العينة خلال الساعة الأولى وقد يلزم إجراء مزيد من التعديلات.</li>
	<li>حفظ الملفات لمعالجة البيانات النهائية وتحليلها.</li>
</ol>

التتبع المباشر لخلايا الأسنان عبر المجهر ثنائي الفوتون

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

يعد تصوير الأنسجة الحية تقنية مهمة تسمح لنا بدراسة العمليات والسلوكيات الديناميكية للخلايا عند الحفاظ عليها في بيئتها المتخصصة41. من الناحية المثالية ، يتم إجراء التصوير المباشر في الجسم الحي بدقة مكانية زمانية عالية. ومع ذلك ، يمكن أن يكون التصوير في الجسم الحي لأع...

على مدى العقدين الماضيين ، برزت قاطعة الماوس كمنصة لا تقدر بثمن للتحقيق في مبادئ تنظيم الخلايا الجذعية البالغة وتجديد الأسنان 1,2. تنمو قاطعة الفأر باستمرار وتجدد نفسها طوال حياة. يقوم بذلك عن طريق الحفاظ على كل من الخلايا الجذعية الظهارية والوسيطة ، والتي يمكن أن تتجدد ذاتيا وتتمايز إلى أنواع مختلفة من خلايا السن 1,2. في حين أن الخلايا الجذعية الظهارية السنية تؤدي إلى ظهور الأرومات المينائية ، التي تفرز مصفوفة المينا ، فإن الخلايا الجذعية الوسيطة السنية تؤدي إلى ظهور الأرومات السنية ، والأرومات الأسمنتية ، والخلايا الليفية ، والتي تشكل العاج ، والملاط ، والرباط اللثوي ، على التوالي3،4،5،6. يحافظ هذا الإمداد المستمر للخلايا الجديدة على توازن الأنسجة ويسمح باستبدال الخلايا القديمة المفقودة بسبب تآكل المضغ أو الإصابات 7,8. لذلك فإن توضيح الآليات الخلوية والجزيئية التي تنظم صيانة وتمايز الخلايا الجذعية السنية أمر أساسي لفهم تجديد الأسنان ، وهو مجال يحظى باهتمام متزايد.
تشريحيا ، يتم تغليف جزء كبير من قاطعة الفأر البالغة في عظم الفك. أثناء تعرض الحافة القاطعة للسن ، فإن الطرف القمي للقواطع يتناسب مع التجويف ويتم ربطه بقوة بالعظم المحيط من خلال أربطة اللثة والأنسجة الضامة (الشكل 1 أ ، ب). النهاية القمية للقواطع هي أيضا منطقة نمو السن وتحافظ على جذع الأسنان والخلايا السلفية في كل من الطبقة الظهارية ولب اللحمة المتوسطة9،10،11،12،13. على وجه التحديد ، يتم الحفاظ على الخلايا الجذعية الطلائية السنية في الطرف المنتفخ من الظهارة ، والمعروفة باسم البرعم القمي ، والتي يشار إليها أيضا باسم حلقة عنق الرحم الشفوية (الشكل 1C). على غرار ظهارة الأمعاء والبشرة ، يتم دعم التجديد الظهاري في القاطعة بشكل أساسي من خلال تدوير الخلايا الجذعية بنشاط وأحفادها الوسيطة التكاثرية للغاية ، والتي تسمى خلايا تضخيم العبور14،15،16،17 ، وكلاهما مقيم في الجزء الداخلي من حلقة عنق الرحم. ومع ذلك ، لا يزال يتعين تحديد ما إذا كانت ظهارة القواطع تحتوي على خلايا جذعية هادئة وتستخدمها أثناء التجديد. في المقابل ، تم تحديد كل من الخلايا الجذعية الوسيطة السنية النشطة والهادئة في اللب القمي ، وتعمل الخلايا الجذعية الهادئة كمجموعة احتياطية يتم تنشيطها أثناء إصلاح الإصابة13,18.
نتجت العديد من الاكتشافات حول بيولوجيا تجديد وتجديد قاطعة الفأر عن التحقيقات النسيجية ، حيث يتم الحصول على عينات في منعطفات زمنية متميزة ، وتثبيتها ، ومعالجتها ، ثم تقسيمها إلى شرائح رقيقة ميكرون على طول مستوى معين. من خلال التحليل التفصيلي للأقسام النسيجية من نماذج الفئران المختلفة التي تمكن من تتبع النسب أو الاضطرابات الجينية ، حدد العلماء سلالات الخلايا لمختلف مجموعات السلف ، بالإضافة إلى المسارات الجينية والإشارات التي تتحكم في توازن القواطع وإصلاح الإصابات19،20،21. ومع ذلك ، فإن الصور الثابتة ثنائية الأبعاد (2D) للخلايا غير الحيوية في الأقسام لا يمكنها التقاط مجموعة كاملة من السلوكيات الخلوية والمنظمات المكانية في الأنسجة الحية ، مثل تغيرات شكل الخلية والحركات والحركية الخلوية. يتطلب اكتشاف وقياس هذه التغيرات الخلوية السريعة ، والتي تحدث في نطاق زمني غير قابل للحل من خلال تقسيم الأنسجة ، استراتيجية مختلفة. علاوة على ذلك ، يعد الحصول على مثل هذه المعلومات أمرا بالغ الأهمية أيضا لفهم كيفية تفاعل خلايا الأسنان مع بعضها البعض ، والتفاعل مع محفزات الإشارات المختلفة ، والتنظيم الذاتي للحفاظ على هياكل الأنسجة ووظائفها.
إن ظهور التصوير العميق للأنسجة رباعي الأبعاد (4D) باستخدام المجهر ثنائي الفوتون22 ، وهي تقنية تدمج ثلاثة أبعاد مكانية مع الدقة الزمنية ، يتغلب على القيود المتأصلة في التحليل النسيجي من خلال تمكين الفحص الزماني المكاني لنباتات الأنسجة المستزرعة أو المواد العضوية أو حتى الأنسجة في الموقع23،24،25،26. على سبيل المثال ، كشف التصوير الحي 4D لظهارة الأسنان النامية النقاب عن الأنماط الزمانية المكانية لانقسامات الخلايا والهجرات التي تنسق نمو الأنسجة ، وتشكيل مركز الإشارات ، وتشكل ظهارة الأسنان27،28،29،30،31،32. في قاطعة الفئران البالغة ، تم تكييف التصوير 4D مؤخرا لدراسة السلوكيات الخلوية أثناء إصلاح إصابة الأسنان الظهارية. كشف التصوير الحي أن الخلايا البينية للطبقة في الطبقة فوق القاعدية يمكن تحويلها مباشرة إلى أرومات المينائية في الطبقة القاعدية لتجديد الظهارة التالفة ، مما يتحدى النموذج التقليدي لإصلاح الإصابات الظهارية15.
هنا ، نصف تشريح وزراعة وتصوير قاطعة الفئران البالغة ، مع التركيز على الخلايا الظهارية في حلقة عنق الرحم الشفوية (الشكل 1). تحافظ هذه التقنية على حيوية خلايا الأسنان لأكثر من 12 ساعة وتسمح بالتتبع المباشر للخلايا ذات العلامات الفلورية بدقة خلية واحدة. يسمح هذا النهج بالتحقيق في حركة الخلية وهجرتها بالإضافة إلى التغيرات الديناميكية في شكل الخلية واتجاه الانقسام في ظل ظروف الثقافة العادية ، أو في الاستجابات للاضطرابات الجينية والفيزيائية والكيميائية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well, flat bottom tissue culture plate</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>25-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x HC IRAPO motCORR water dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11507704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid (Vitamin C)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>352685000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose bioxtra&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delta T system&#160;</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>0420-4</td>
			<td>Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope- LEICA S9E</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LED300 SLI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11039047</td>
			<td>Basal media without phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather surgical blade (#15)</td>
			<td>Feather</td>
			<td>72044-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-melting agarose</td>
			<td>NuSieve</td>
			<td>50080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-essential amino acids (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>90 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>AS3061SC</td>
			<td>Processed for live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade #9</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>37133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serrated forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11000-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spring scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ex vivo live imaging to investigate cell divisions and movements during mouse dental renewal

تظهر قاطعة الفأر المتنامية باستمرار كنظام نموذجي قابل للتتبع للغاية للتحقيق في تنظيم الخلايا الجذعية الظهارية والوسيطة البالغة وتجديد الأسنان. تنقسم هذه المجموعات السلفية وتتحرك وتتمايز بنشاط للحفاظ على توازن الأنسجة وتجديد الخلايا المفقودة بطريقة سريعة الاستجابة. ومع ذلك ، فإن التحليلات التقليدية باستخدام أقسام الأنسجة الثابتة لا يمكن أن تلتقط العمليات الديناميكية للحركات والتفاعلات الخلوية ، مما يحد من قدرتنا على دراسة لوائحها. تصف هذه الورقة بروتوكولا للحفاظ على قواطع الفئران الكاملة في نظام زراعة النباتات والخلايا الظهارية السنية الحية باستخدام المجهر متعدد الفوتونات. تضيف هذه التقنية إلى مجموعة أدواتنا الحالية لأبحاث الأسنان وتسمح للمحققين بالحصول على معلومات زمانية مكانية حول سلوكيات الخلايا ومنظماتها في الأنسجة الحية. نتوقع أن تساعد هذه المنهجية الباحثين على استكشاف الآليات التي تتحكم في العمليات الخلوية الديناميكية التي تحدث أثناء تجديد الأسنان وتجديدها.

Over the past two decades, the mouse incisor has emerged as an invaluable platform for investigating the principles of adult stem cell regulation and tooth regeneration1,2. The mouse incisor grows continuously and renews itself throughout the animal&#39;s life. It does so by maintaining both epithelial and mesenchymal stem cells, which can self-renew and differentiate into different cell types of the tooth1,2. While dental epithelial stem cells give rise to ameloblasts, which secrete the enamel matrix, dental mesenchymal stem cells give rise to odontoblasts, cementoblasts, and fibroblasts, which form dentin, cementum, and periodontal ligament, respectively3,4,5,6. This constant supply of new cells maintains tissue homeostasis and allows the replacement of old cells that are lost due to masticatory wear or injuries7,8. Elucidating the cellular and molecular mechanisms that regulate the maintenance and differentiation of dental stem cells is therefore central to understanding dental regeneration, an area of growing interest.
Anatomically, a large portion of the adult mouse incisor is encased in the jawbone. While the incisal edge of the tooth is exposed, the apical end of the incisor fits within a socket and is firmly attached to the surrounding bone through periodontal ligaments and connective tissues (Figure 1A,B). The incisor&#39;s apical end is also the growth region of the tooth and maintains dental stem and progenitor cells in both the epithelial layer and the mesenchymal pulp9,10,11,12,13. Specifically, dental epithelial stem cells are maintained at the bulbous end of the epithelium, known as the apical bud, also referred to as the labial cervical loop (Figure 1C). Similar to the intestinal epithelium and the epidermis, epithelial renewal in the incisor is primarily supported by actively cycling stem cells and their highly proliferative intermediate descendants, called transit-amplifying cells14,15,16,17, both residing in the inner part of the cervical loop. However, whether the incisor epithelium contains and utilizes quiescent stem cells during regeneration remains to be determined. In contrast, both active and quiescent dental mesenchymal stem cells have been identified in the apical pulp, and the quiescent stem cells function as a reserve population that becomes activated during injury repair13,18.
Many of the discoveries on the biology of the mouse incisor renewal and regeneration have resulted from histological investigations, in which samples are obtained at distinct temporal junctures, fixed, processed, and then sectioned into micron-thin slices along a particular plane. Through detailed analysis of histological sections from different mouse models that enable lineage tracing or genetic perturbations, scientists have identified the cell lineages of different progenitor populations, as well as the genetic and signaling pathways that control incisor homeostasis and injury repair19,20,21. However, the static two-dimensional (2D) images of non-vital cells in sections cannot capture the full spectrum of cellular behaviors and spatial organizations in living tissue, such as cell shape changes, movements, and cellular kinetics. Detecting and measuring these rapid cellular changes, which occur at a timescale that is unresolvable through tissue sectioning, require a different strategy. Moreover, acquiring such information is also critical for understanding how dental cells interact with each other, react to different signaling stimuli, and self-organize to maintain tissue structures and functions.
The advent of four-dimensional (4D) deep tissue imaging using two-photon microscopy22, a technology that integrates three spatial dimensions with temporal resolution, overcomes the inherent limitations of histological analysis by enabling spatiotemporal examination of cultured tissue explants, organoids, or even tissues in situ23,24,25,26. For instance, 4D live imaging of the developing tooth epithelium has unveiled the spatiotemporal patterns of cell divisions and migrations that coordinate tissue growth, signaling center formation, and dental epithelial morphogenesis27,28,29,30,31,32. In the adult mouse incisor, 4D imaging has been recently adapted to study cellular behaviors during dental epithelial injury repair. Live imaging revealed that stratum intermedium cells in the suprabasal layer can be directly converted into ameloblasts in the basal layer to regenerate the damaged epithelium, challenging the traditional paradigm of epithelial injury repair15.
Here, we describe the dissection, culturing, and imaging of the adult mouse incisor, focusing on epithelial cells in the labial cervical loop (Figure 1). This technique preserves dental cell vitality for more than 12 h and permits live tracking of fluorescently labeled cells at single-cell resolution. This approach allows investigation of cell motion and migration as well as dynamic changes in cell shape and division orientation under normal culture conditions, or in responses to genetic, physical, and chemical perturbations.

تسليط الضوء على المؤلف: فهم السلوكيات الخلوية الديناميكية في تجديد وإصلاح أنسجة الأسنان للفأر البالغ 

استخدام التصوير الحي خارج الجسم الحي للتحقيق في انقسامات الخلايا وحركاتها أثناء تجديد أسنان الفأر

To maintain the correct cellular organization during organ renewal, tissue approaching the cells move and dividing specific orientations and patterns. It is therefore important to understand the rules and regulations of these dynamic cellular events. The mouse incisor is an emerging model for adult stem cell research, and many genetic tools are available in the system to study gene functions, and to label cells for lineage tracing.Most studies to date use adult dental samples collected and fixed its specific time points, and this prevents us from examining life cell behavior. In this protocol, we describe a method to track lifestyles in the adult mouse incisor, and this technique will enable future studies that aim to understand how dynamic cell behaviors contribute to the renewal and repairment of dental tissues.

يتم تغليف المنطقة القمية لقواطع الفأر البالغة داخل الفك السفلي (الشكل 1) ، وبالتالي ، لا يمكن الوصول إليها مباشرة لتصور الخلايا السلفية المقيمة داخل منطقة النمو وتتبعها مباشرة. لذلك ، قمنا بتطوير طريقة لاستخراج القاطعة بأكملها من عظم الفك والحفاظ عليها في نظام استزراع نبا?...

Watch this Scientific Journal Video about Understanding Dynamic Cellular Behaviors in Adult Mouse Dental Tissue Renewal and Repairment at JoVE.com

التصوير الحي خارج الجسم الحي هو تقنية قوية لدراسة العمليات الديناميكية للحركات الخلوية والتفاعلات في الأنسجة الحية. هنا ، نقدم بروتوكولا ينفذ الفحص المجهري ثنائي الفوتون لتتبع الخلايا الظهارية السنية الحية في قواطع الفئران البالغة المستزرعة.

The continuously growing mouse incisor is emerging as a highly tractable model system to investigate the regulation of adult epithelial and mesenchymal ...

للحفاظ على التنظيم الخلوي الصحيح أثناء تجديد الأعضاء ، تتحرك الأنسجة التي تقترب من الخلايا وتقسم اتجاهات وأنماط محددة. لذلك من المهم فهم قواعد وأنظمة هذه الأحداث الخلوية الديناميكية. قاطعة الفأر هي نموذج ناشئ لأبحاث الخلايا الجذعية البالغة ، وتتوفر العديد من الأدوات الجينية في النظام لدراسة وظائف الجينات ، وتسمية الخلايا لتتبع السلالة.تستخدم معظم الدراسات حتى الآن عينات أسنان البالغين التي تم جمعها وتحديد نقاطها الزمنية المحددة ، وهذا يمنعنا من فحص سلوك خلايا الحياة. في هذا البروتوكول ، نصف طريقة لتتبع أنماط الحياة في قاطعة الفئران البالغة ، وستمكن هذه التقنية الدراسات المستقبلية التي تهدف إلى فهم كيفية مساهمة سلوكيات الخلايا الديناميكية في تجديد وإصلاح أنسجة الأسنان.

using-ex-vivo-live-imaging-to-investigate-cell-divisions-movements

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal

887 Views.  University of California Los Angeles. للحفاظ على التنظيم الخلوي الصحيح أثناء تجديد الأعضاء ، تتحرك الأنسجة التي تقترب من الخلايا وتقسم اتجاهات وأنماط محددة. لذلك من المهم فهم قواعد وأنظمة هذه الأحداث الخلوية الديناميكية. قاطعة الفأر هي نموذج ناشئ لأبحاث الخلايا الجذعية البالغة ، وتتوفر العديد من الأدوات الجي...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: فهم السلوكيات الخلوية الديناميكية في تجديد وإصلاح أنسجة الأسنان للفأر البالغ 

The continuously growing mouse incisor is emerging as a highly tractable model system to investigate the regulation of adult epithelial and mesenchymal stem cells and tooth regeneration. These progenitor populations actively divide, move, and differentiate to maintain tissue homeostasis and regenerate lost cells in a responsive manner. However, traditional analyses using fixed tissue sections could not capture the dynamic processes of cellular movements and interactions, limiting our ability to study their regulations. This paper describes a protocol to maintain whole mouse incisors in an explant culture system and live-track dental epithelial cells using multiphoton timelapse microscopy. This technique adds to our existing toolbox for dental research and allows investigators to acquire spatiotemporal information on cell behaviors and organizations in a living tissue. We anticipate that this methodology will help researchers further explore mechanisms that control the dynamic cellular processes taking place during both dental renewal and regeneration.

Ex vivo live imaging is a powerful technique for studying the dynamic processes of cellular movements and interactions in living tissues. Here, we present a protocol that implements two-photon microscopy to live track dental epithelial cells in cultured whole adult mouse incisors.

Dissection and Isolation of Mouse Mandibular Incisors and Associated Periodontal Tissues to Expose the Incisor Epithelial Cervical Loop

To begin, turn the euthanized mouse over so its ventral side faces up and the mandibles are easily accessible. Secure the mouse's head gently between the thumb and the index finger. Using a razor blade, starting from the lower lip toward the neckline, make a mid-sagittal incision on the lower jaw skin.During the incision, use the thumb and index finger to open the cut skin, exposing the underneath muscles and jawbone. Next, sever the masseter muscles on the buccal side of the lower jaw. Sever the mylohyoid muscles along the inner side of the mandible and remove muscle attachments.Make another incision at the mandibular synthesis, connecting the two hemi-mandibles, separating them into the left and right halves. Wedge the razor blade between the mandibular condyle and the temporal mandibular joint to carefully dissect out the hemi mandible from the rest of the head. Immediately transfer the dissected mandibles to a Petri dish containing pre-warmed dissection medium.Next, under a brightfield dissection microscope, use a number 15 surgical blade to remove muscle tissues. Identify the oval region of the mandible that covers the incisor socket and houses the apical portion of the incisor. Position the mandibles such that the inner or lingual surface is facing upward.While holding the mandible with a pair of serrated forceps, using a number 15 surgical blade, shave off the overlying membrane bone from the condyle towards the molars to generate a window at the oval. This exposes the soft tissue of the apical incisor on the inner surface. Next, turn the mandible so the outer or buccal surface faces upwards.As demonstrated for the inner mandible, generate a window at the oval region on the outer mandible. Using a pair of forceps, pick away the remaining bone fragments at the edge, ensuring that the apical end of the tooth is visible from both sides. To isolate the entire tooth, make a clean cut at a plane immediately adjacent to the apical incisor to remove the condylar process.Then make a second cut just posterior to the third molar, but dorsal to the incisor, without damaging the tooth, to remove the coronary process. Serially cut from the tip of the angular process towards the incisor to gradually remove the ventral mandible. Next, cut away the alveolar bone with molars and any remaining bones that are still attached to the incisor.Transfer the fully dissected incisor to a dish containing warm dissection media. Turn on the fluorescent microscope and use the fluorescent signal from tissues to guide the removal of periodontium. Position the inner incisor on its lingual side, and using serrated forceps hold the tooth in place.Then using a pair of number five fine forceps, start tugging on the periodontal tissues, covering the apical incisor, and the cervical loop region. Carefully peel off periodontal tissues from the apical bud, such that the lateral side of the cervical loop is visible.

تشريح وعزل قواطع الفك السفلي للفأر وأنسجة اللثة المرتبطة بها لكشف حلقة عنق الرحم الظهارية القاطعة

Periodontal Tissue Embedding and Timelapse Microscopy of Mouse Incisor Explant Cultures

To begin, add 500 microliters of warm culture gel to a well in a 24-well plate. Quickly transfer the dissected whole incisors isolated from the mouse to the well. Swirl the plate a few times to rinse the incisors.Add 400 microliters of warm culture gel to a culture dish and to transfer the rinsed incisors to the dish. Orient the incisor to position the cervical loop region at the center of the dish and adjust the tilt of the apical incisor for the desired imaging plane. Once the gel is set, using a pair of fine forceps, remove any gel on top of the region of interest.Add approximately 150 microliters of warm culture media against the edge of the dish to cover the sample. Place the explant culture at 37 degrees Celsius to allow the tissue to settle. After one hour, turn on the microscope and the two-photon laser.Secure the culture dish to the stage adapter and place the profusion adapter ring on top. Connect the stage adapter to a temperature controller to maintain the culture at 37 degrees Celsius. Connect the inlet and the outlet of the adapter ring to a microprofusion pump.Set the profusion speed to 20 and initiate the profusion of the medium over the sample. Place an ACBR on top of the adapter ring and raise the stage so the objective fits through the ACBR to make contact with the culture medium. Turn the laser wavelength to 920 nanometers to visualize GFP.After locating the sample through an eyepiece, visualize it with a microscope software, then set up Z-step size of four micrometers and a time interval of five minutes for 14 hours. Initiate the time-lapse imaging and save the subsequent files for downstream data analysis. In time-lapse microscopy of the K14-Cre;R26-rtTA;tetO-H2B-GFP cervical loop, the H2B-GFP signals were predominantly observed in the trans-amplifying region of the cervical loop, indicating active cell divisions.Further, the condensation and alignment of chromosomes at the metaphase plate in mitotic cells followed by their segregation during anaphase and into two daughter cells was observed. Most cell divisions were perpendicular or at an oblique angle relative to the basement membrane with fewer horizontal divisions parallel to the basement membrane. Cell division events were also apparent in K14-Cre;R26-mT/mG cervical loops where all epithelial cell membranes were labeled green.Mitotic cells were identified by their cell rounding and subsequent cytokinesis. In K14-Cre;R26-mT/mG cervical loops, both horizontal and vertical cell divisions were also observed.