Ringraziamo l'UCLA Advanced Light Microscopy/Spectroscopy Laboratory e il Leica Microsystems Center of Excellence presso il California NanoSystems Institute (RRID:SCR_022789) per aver fornito la microscopia a due fotoni. L'AS è stato supportato dall'ISF 604-21 della Israel Science Foundation. JH è stato supportato da R03DE030205 e R01DE030471 del NIH/NIDCR. AS e JH sono stati anche sostenuti da 2021007 di sovvenzioni della United States-Israel Binational Science Foundation (BSF).

Tutti i topi sono stati mantenuti in strutture per animali prive di agenti patogeni presso l'Università della California di Los Angeles (UCLA) o l'Università Ebraica di Gerusalemme (HUJI). Tutti gli esperimenti che hanno coinvolto i topi sono stati eseguiti secondo le normative e i protocolli approvati dal rispettivo Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) o (MD-23-17184-3; HUJI). Un flusso di lavoro generale delle fasi sperimentali è mostrato nella Figura 2A. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti gli strumenti, i reagenti e i materiali utilizzati in questo protocollo.
1. Preparazione di soluzioni e gel
<ol><li>Terreno di dissezione: Preparare DMEM/F12 fresco con lo 0,5% di glucosio e tenerlo in caldo a 37 °C fino al momento del passaggio 2.4. NOTA: Utilizziamo DMEM/F12 senza rosso fenolo per ridurre l'autofluorescenza durante l'imaging dal vivo.</li>
	<li>1x terreno di coltura: preparare terreno fresco utilizzando il 50% di DMEM/F12, il 50% di siero di ratto, 1 sostituto della glutammina, 1 aminoacidi non essenziali MEM, 1% di glucosio, 0,1 mg/mL di acido L-ascorbico e 0,5% di penicillina-streptomicina. Tenerlo in caldo a 37 °C fino al momento 5.5. Questo terreno viene utilizzato per la coltura di espianti di incisivi durante l'imaging dal vivo. NOTA: Il siero di ratto deve essere di alta qualità e appositamente preparato per la coltura di tessuti interi da ricercatori o da una fonte commerciale. In particolare, il sangue deve essere centrifugato (per 5 minuti a 1.200 × g a temperatura ambiente) prima che inizi a formarsi la coagulazione. Dopo la centrifugazione, il coagulo di fibrina risultante deve essere spremuto e scartato33.</li>
	<li>Gel di coltura: lo scopo del gel è quello di immobilizzare i campioni durante l'imaging e viene preparato fresco.<ol><li>Preparare un gel al 2% in DMEM/F12 sciogliendo 200 mg di agarosio a basso punto di fusione in 10 mL di DMEM/F12 utilizzando un forno a microonde. Mantenere il gel al 2% a 37 °C.</li>
		<li>Preparare 2 terreni di coltura (senza DMEM/F12) mescolando il 50% di siero di ratto, 1 sostituto della glutammina, 1 aminoacidi non essenziali MEM, 1% di glucosio, 0,1 mg/mL di acido L-ascorbico e 0,5% di penicillina-streptomicina. Riscaldare il terreno di coltura 2x (senza DMEM/F12) a 37 °C.</li>
		<li>Preparare un gel di coltura all'1% mescolando volumi uguali di gel al 2% e 2 terreni di coltura (senza DMEM/F12). Mantenere il gel di coltura all'1% a 37 °C fino al momento del passaggio 5.1. NOTA: Assicurarsi che tutte le soluzioni siano calde prima di mescolarle per evitare che gelifichino. Abbiamo trovato che il gel all'1% è adatto per la coltura dell'incisivo di topo adulto. La percentuale di gel deve essere determinata empiricamente se devono essere coltivati altri tessuti.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Estrazione delle mandibole di topo adulto
<ol><li>Sopprimere i topi all'età desiderata utilizzando procedure standard approvate dalla IACUC. NOTA: Qui usiamo l'asfissia da CO2 seguita da lussazione cervicale. Le normative per l'eutanasia degli animali possono variare nelle diverse regioni. I ricercatori dovrebbero ottenere la necessaria approvazione istituzionale prima di eseguire esperimenti e garantire il rispetto delle normative locali sulla cura degli animali.</li>
	<li>Disinfettare il topo con etanolo al 70%.</li>
	<li>Decapita il topo ed estrai le mandibole sinistra e destra.<ol><li>Appoggia il mouse sulla pancia, quindi usa una lama di rasoio industriale a filo singolo #9 per tagliare la regione del collo e separare la testa del mouse dal resto del corpo. NOTA: Se devono essere prelevati anche tessuti della faringe o della regione del collo, la decapitazione non deve essere eseguita e si può procedere direttamente al passaggio 2.3.2.</li>
		<li>Capovolgi il mouse in modo che il suo lato ventrale sia rivolto verso l'alto e le mandibole siano facilmente accessibili.</li>
		<li>Fissa la testa dell'animale tenendola delicatamente tra il pollice e l'indice.</li>
		<li>Usa la lama del rasoio per praticare un'incisione sagittale a metà che taglia la pelle della mascella inferiore dal labbro inferiore verso la scollatura. NOTA: Una lama chirurgica #15 può essere utilizzata anche per eseguire l'incisione e le successive dissezioni (passaggi 2.3.6-2.3.9).</li>
		<li>Mentre viene praticata l'incisione, aprire la pelle tagliata usando il pollice e l'indice per esporre i muscoli e l'osso mascellare sottostante.</li>
		<li>Usa la lama del rasoio per recidere i muscoli massetere sul lato vestibolare della mascella inferiore, in modo tale che l'esterno degli emimandiboli sinistro e destro sia ora libero da attacchi muscolari.</li>
		<li>Recidere i muscoli miloioidei lungo il lato interno della mandibola per rimuovere gli attacchi muscolari lì.</li>
		<li>Praticare un'altra incisione sulla sinfisi mandibolare che collega le due emimandibili. Una volta tagliata, la mandibola verrà separata nelle metà sinistra e destra.</li>
		<li>Incuneare la lama del rasoio tra il condilo mandibolare e l'articolazione mandibolare temporale e sezionare con cura l'emimandibile dal resto della testa. NOTA: Abbiamo trovato utile tirare delicatamente contemporaneamente l'incisivo durante il taglio. Bisogna fare attenzione per evitare di rompere la mandibola e danneggiare i tessuti molli all'interno.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasferire immediatamente le mandibole sezionate in una capsula di Petri con il terreno di dissezione preriscaldato (passaggio 1.1) e rimuovere i tessuti muscolari rimanenti utilizzando una lama chirurgica #15. NOTA: La conservazione dei campioni in terreni freddi rallenta l'attività cellulare, con conseguente ritardo o addirittura mancato recupero di alcune attività cellulari, come la proliferazione o il movimento cellulare, durante l'imaging dal vivo.</li>
</ol>3. Isolamento dell'intero incisivo del topo
NOTA: L'ulteriore isolamento dell'incisivo viene eseguito al microscopio a dissezione in campo chiaro.
<ol><li>Identifica visivamente la regione ovale della mandibola che copre l'incavo dell'incisivo e ospita la porzione apicale dell'incisivo.</li>
	<li>Posizionare la mandibola in modo che la superficie interna (linguale) sia rivolta verso l'alto.</li>
	<li>Tenendo la mandibola in posizione con un paio di pinze seghettate, generare una finestra nella regione ovale radendo l'osso della membrana sovrastante utilizzando una lama chirurgica #15, in una direzione che va dal condilo verso i molari. Questo espone il tessuto molle dell'incisivo apicale sulla superficie interna.</li>
	<li>Capovolgi la mandibola in modo che la superficie esterna (buccale) sia rivolta verso l'alto.</li>
	<li>Generare una finestra nella regione ovale della mandibola esterna come descritto nel passaggio 3.3 e utilizzare la punta del bisturi per rimuovere eventuali frammenti ossei rimanenti sul bordo. Assicurarsi che l'estremità apicale del dente sia visibile da entrambi i lati. NOTA: Evitare una pressione eccessiva durante la rasatura delle ossa per evitare danni ai tessuti molli sottostanti.</li>
	<li>Tagliare sistematicamente le ossa che circondano l'incisivo per isolare l'intero dente.<ol><li>Eseguire un taglio netto su un piano immediatamente adiacente all'incisivo apicale per rimuovere prima il processo condilare. NOTA: Fare attenzione a non tagliare l'incisivo.</li>
		<li>Eseguire un secondo taglio appena posteriore al 3° molare, ma dorsale all'incisivo senza danneggiare il dente. Questo rimuove l'osso che include il processo coronoideo.</li>
		<li>Tagliare in serie dalla punta del processo angolare verso l'incisivo per rimuovere gradualmente la mandibola ventrale in modo graduale. NOTA: L'epitelio dentale e i tessuti parodontali associati sono spesso attaccati all'osso e facilmente strappati se un'ampia porzione dell'osso ventrale viene tagliata contemporaneamente. Per separare l'osso dal tessuto molle dell'incisivo, si può inserire il bisturi (o un paio di pinze affilate non seghettate) tra i due tessuti all'estremità apicale dell'incisivo e far scorrere delicatamente lo strumento in avanti.</li>
		<li>Tagliare l'osso alveolare con i molari e le eventuali ossa rimanenti che sono ancora attaccate all'incisivo.</li>
		<li>L'intero incisivo è ora isolato. Trasferire l'incisivo completamente sezionato in un piatto con terreno di dissezione caldo e pulito (passaggio 1.1).</li>
	</ol></li>
	<li>Ripetere i passaggi 3.2-3.6 per isolare altri incisivi come richiesto. NOTA: Gli incisivi mascellari/superiori del topo mantengono anche le cellule staminali adulte e possono essere utilizzati per studiare la rigenerazione dei denti34. I ricercatori dentali in genere si concentrano sugli incisivi inferiori perché sono più accessibili e possono essere sezionati più facilmente rispetto agli incisivi superiori. Le differenze tra le cellule progenitrici degli incisivi mandibolari e mascellari rimangono da determinare.</li>
</ol>4. Rimozione dei tessuti parodontali per esporre l'ansa cervicale epiteliale incisiva
<ol><li>Con l'intero incisivo sdraiato sul lato linguale e tenendo il dente in posizione con un paio di pinze seghettate, utilizzare un paio di pinze sottili #5 per iniziare a rimboccare i tessuti parodontali che coprono l'incisivo apicale e la regione dell'ansa cervicale.</li>
	<li>Staccare con cautela il tessuto parodontale dalla gemma apicale, in modo tale che il lato laterale dell'ansa cervicale (o altre regioni di interesse) diventi visibile sotto l'endoscopio. NOTA: Prestare attenzione per evitare di danneggiare l'epitelio dentale o di staccarlo dal mesenchima. Se l'incisivo ha segnali di fluorescenza nella regione di interesse ed è disponibile un microscopio di dissezione fluorescente, i segnali di fluorescenza possono essere utilizzati per aiutare a distinguere tra i tipi di tessuto e aiutare le dissezioni. È importante eseguire in modo efficiente le sezioni 2-4 in modo che i campioni possano essere trasferiti rapidamente nei terreni di coltura e mantenuti adeguatamente attraverso la coltura dell'espianto (vedi sotto).</li>
</ol>5. Inclusione di tessuti per coltura di espianto
<ol><li>Aggiungere 500 μL di gel di coltura caldo e non solidificato in un pozzetto in una piastra da 24 pozzetti e trasferire rapidamente gli incisivi interi sezionati nel pozzetto. Agitare la piastra un paio di volte per sciacquare gli incisivi.</li>
	<li>Aggiungere 400 μL di gel di coltura caldo e non solidificato in una piastra di coltura e trasferire gli incisivi sciacquati nella capsa. NOTA: Utilizziamo una piastra di coltura disponibile in commercio compatibile con la configurazione di perfusione. Vedere il passaggio 6.4 per le opzioni alternative.</li>
	<li>Orientare l'incisivo per posizionare la regione dell'ansa cervicale (o altre regioni di interesse) al centro della placca (Figura 2A,B) e regolare l'inclinazione dell'incisivo apicale per il piano di imaging desiderato. NOTA: L'orientamento del tessuto deve essere eseguito rapidamente prima della completa gelificazione.</li>
	<li>Dopo che il gel è stato fissato, utilizzare un paio di pinze sottili per rimuovere il gel sopra la regione di interesse in modo che non sia coperto dal gel.</li>
	<li>Aggiungere un volume sufficiente di terreno di coltura caldo pipettandolo lentamente contro il bordo della piastra per coprire appena il campione (~150 μL).</li>
	<li>Spostare la coltura di espianto in un incubatore per colture cellulari a 37 °C per consentire la sedimentazione del tessuto e l'adattamento alle condizioni di coltura per 1 ora.</li>
</ol>6. Microscopia timelapse degli espianti incisivi
NOTA: In questo esperimento, abbiamo utilizzato un microscopio verticale dotato di un obiettivo 25x per immergere l'acqua che ha un'apertura numerica di 1. In generale, una lente per immersione in acqua con un'elevata apertura numerica è più adatta per l'imaging dei tessuti profondi.
<ol><li>Accendere il microscopio e il laser a due fotoni.</li>
	<li>Fissare la piastra di coltura all'adattatore del tavolino e montare l'anello dell'adattatore di perfusione sulla parte superiore (Figura 2C).</li>
	<li>Collegare l'adattatore del tavolino a un regolatore di temperatura impostato per mantenere la coltura a 37 °C.</li>
	<li>Collegare l'ingresso e l'uscita dell'anello adattatore a una pompa di microperfusione e iniziare la perfusione del terreno di coltura, con la velocità di perfusione impostata a 20 sulla pompa. Questo genera un flusso lento (~5 mL/h) del terreno di coltura sopra i campioni (Figura 2C). NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i dettagli sul sistema per mantenere il tessuto in un ambiente controllato in modo stabile. Possono essere utilizzati anche altri sistemi. È inoltre possibile utilizzare una combinazione di una piastra riscaldante a 37 °C e una piastra di coltura per perfusione fatta in casa (figura supplementare S1) con un ingresso e un'uscita collegati a pompe a siringa.</li>
	<li>Posizionare un anello barriera per il controllo atmosferico (ACBR) sopra l'anello adattatore e abbassare l'obiettivo attraverso l'ACBR per entrare in contatto con il terreno di coltura (Figura 2D).</li>
	<li>Regolare la lunghezza d'onda del laser a 920 nm per visualizzare sia i segnali GFP che quelli di fluorescenza rossa (ad es. tdTomato).</li>
	<li>Localizzare i campioni attraverso gli oculari e poi sul software del microscopio.</li>
	<li>Configura gli stack Z, l'imaging multiposizione e gli intervalli di tempo utilizzando il software. Per seguire questo protocollo, utilizzare una dimensione dello z-step di 4 μm e un intervallo di tempo di 5 min per 14 ore. NOTA: Abbiamo scoperto che un intervallo di tempo superiore a 5 minuti è spesso insufficiente per catturare movimenti e divisioni cellulari fluidi.</li>
	<li>Avviare l'imaging timelapse. NOTA: La posizione del campione potrebbe cambiare durante la prima ora e potrebbero essere necessarie ulteriori regolazioni.</li>
	<li>Salva i file per l'elaborazione e l'analisi dei dati a valle.</li>
</ol>

Tracciamento in tempo reale delle cellule dentali tramite microscopia a due fotoni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

L'imaging di tessuti vivi è una tecnica importante che ci permette di studiare i processi dinamici e i comportamenti delle cellule quando vengono mantenute nel loro ambiente di nicchia41. Idealmente, l'imaging dal vivo viene eseguito in vivo con un'elevata risoluzione spazio-temporale. Tuttavia, l'imaging in vivo per gli organi dei mammiferi può essere difficile a causa dell'inaccessibilità dei tessuti, dell'opacità ottica e della difficoltà di immobilizzare l'animale o l'or...

Negli ultimi due decenni, l'incisivo di topo è emerso come una piattaforma inestimabile per studiare i principi della regolazione delle cellule staminali adulte e della rigenerazione dei denti 1,2. L'incisivo del topo cresce continuamente e si rinnova per tutta la vita dell'animale. Lo fa mantenendo sia le cellule staminali epiteliali che quelle mesenchimali, che possono auto-rinnovarsi e differenziarsi in diversi tipi di cellule del dente 1,2. Mentre le cellule staminali epiteliali dentali danno origine ad ameloblasti, che secernono la matrice dello smalto, le cellule staminali mesenchimali dentali danno origine a odontoblasti, cementoblasti e fibroblasti, che formano dentina, cemento e legamento parodontale, rispettivamente 3,4,5,6. Questo apporto costante di nuove cellule mantiene l'omeostasi dei tessuti e consente la sostituzione delle vecchie cellule perse a causa dell'usura masticatoria o delle lesioni 7,8. Chiarire i meccanismi cellulari e molecolari che regolano il mantenimento e la differenziazione delle cellule staminali dentali è quindi fondamentale per comprendere la rigenerazione dentale, un'area di crescente interesse.
Anatomicamente, gran parte dell'incisivo del topo adulto è racchiuso nell'osso mascellare. Mentre il bordo incisale del dente è esposto, l'estremità apicale dell'incisivo si inserisce all'interno di una presa ed è saldamente attaccata all'osso circostante attraverso i legamenti parodontali e i tessuti connettivi (Figura 1A,B). L'estremità apicale dell'incisivo è anche la regione di crescita del dente e mantiene le cellule staminali dentali e progenitrici sia nello strato epiteliale che nella polpa mesenchimale 9,10,11,12,13. In particolare, le cellule staminali epiteliali dentali sono mantenute all'estremità bulbosa dell'epitelio, nota come gemma apicale, nota anche come ansa cervicale labiale (Figura 1C). Analogamente all'epitelio intestinale e all'epidermide, il rinnovamento epiteliale nell'incisivo è supportato principalmente dalle cellule staminali a ciclo attivo e dai loro discendenti intermedi altamente proliferativi, chiamati cellule di amplificazione del transito 14,15,16,17, entrambe residenti nella parte interna dell'ansa cervicale. Tuttavia, resta da determinare se l'epitelio incisivo contenga e utilizzi cellule staminali quiescenti durante la rigenerazione. Al contrario, nella polpa apicale sono state identificate cellule staminali mesenchimali dentali attive e quiescenti e le cellule staminali quiescenti funzionano come una popolazione di riserva che si attiva durante la riparazione della lesione13,18.
Molte delle scoperte sulla biologia del rinnovamento e della rigenerazione degli incisivi del topo sono il risultato di indagini istologiche, in cui i campioni vengono ottenuti in giunture temporali distinte, fissati, processati e quindi sezionati in fette sottili come un micron lungo un particolare piano. Attraverso un'analisi dettagliata delle sezioni istologiche di diversi modelli murini che consentono il tracciamento del lignaggio o delle perturbazioni genetiche, gli scienziati hanno identificato i lignaggi cellulari di diverse popolazioni di progenitori, nonché le vie genetiche e di segnalazione che controllano l'omeostasi degli incisivi e la riparazione delle lesioni 19,20,21. Tuttavia, le immagini statiche bidimensionali (2D) di cellule non vitali in sezioni non possono catturare l'intero spettro dei comportamenti cellulari e delle organizzazioni spaziali nei tessuti viventi, come i cambiamenti di forma delle cellule, i movimenti e la cinetica cellulare. Rilevare e misurare questi rapidi cambiamenti cellulari, che si verificano su una scala temporale che non è risolvibile attraverso il sezionamento dei tessuti, richiede una strategia diversa. Inoltre, l'acquisizione di tali informazioni è fondamentale anche per comprendere come le cellule dentali interagiscono tra loro, reagiscono a diversi stimoli di segnalazione e si auto-organizzano per mantenere le strutture e le funzioni dei tessuti.
L'avvento dell'imaging dei tessuti profondi a quattro dimensioni (4D) utilizzando la microscopia a due fotoni22, una tecnologia che integra tre dimensioni spaziali con la risoluzione temporale, supera i limiti intrinseci dell'analisi istologica consentendo l'esame spazio-temporale di espianti di tessuti in coltura, organoidi o persino tessuti in situ 23,24,25,26 . Ad esempio, l'imaging dal vivo 4D dell'epitelio dentale in via di sviluppo ha svelato i modelli spazio-temporali delle divisioni e delle migrazioni cellulari che coordinano la crescita dei tessuti, la formazione del centro di segnalazione e la morfogenesi dell'epitelio dentale 27,28,29,30,31,32. Nell'incisivo di topo adulto, l'imaging 4D è stato recentemente adattato per studiare i comportamenti cellulari durante la riparazione del danno epiteliale dentale. L'imaging dal vivo ha rivelato che le cellule intermedie dello strato soprabasale possono essere convertite direttamente in ameloblasti nello strato basale per rigenerare l'epitelio danneggiato, sfidando il paradigma tradizionale della riparazione del danno epiteliale15.
Qui, descriviamo la dissezione, la coltura e l'imaging dell'incisivo di topo adulto, concentrandoci sulle cellule epiteliali nell'ansa cervicale labiale (Figura 1). Questa tecnica preserva la vitalità delle cellule dentali per più di 12 ore e consente il monitoraggio in tempo reale delle cellule marcate con fluorescenza con una risoluzione a singola cellula. Questo approccio consente di studiare il movimento e la migrazione delle cellule, nonché i cambiamenti dinamici nella forma delle cellule e nell'orientamento della divisione in condizioni di coltura normali o in risposta a perturbazioni genetiche, fisiche e chimiche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well, flat bottom tissue culture plate</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>25-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x HC IRAPO motCORR water dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11507704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid (Vitamin C)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>352685000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose bioxtra&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delta T system&#160;</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>0420-4</td>
			<td>Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope- LEICA S9E</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LED300 SLI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11039047</td>
			<td>Basal media without phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather surgical blade (#15)</td>
			<td>Feather</td>
			<td>72044-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-melting agarose</td>
			<td>NuSieve</td>
			<td>50080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-essential amino acids (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>90 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>AS3061SC</td>
			<td>Processed for live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade #9</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>37133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serrated forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11000-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spring scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ex vivo live imaging to investigate cell divisions and movements during mouse dental renewal

L'incisivo di topo in continua crescita sta emergendo come un sistema modello altamente trattabile per studiare la regolazione delle cellule staminali epiteliali e mesenchimali adulte e la rigenerazione dei denti. Queste popolazioni progenitrici si dividono, si muovono e si differenziano attivamente per mantenere l'omeostasi tissutale e rigenerare le cellule perse in modo reattivo. Tuttavia, le analisi tradizionali che utilizzano sezioni fisse di tessuto non sono in grado di catturare i processi dinamici dei movimenti e delle interazioni cellulari, limitando la nostra capacità di studiarne le regolazioni. Questo articolo descrive un protocollo per mantenere gli incisivi interi di topo in un sistema di coltura di espianto e cellule epiteliali dentali live-track utilizzando la microscopia timelapse multifotone. Questa tecnica si aggiunge alla nostra cassetta degli attrezzi esistente per la ricerca odontoiatrica e consente ai ricercatori di acquisire informazioni spazio-temporali sui comportamenti e le organizzazioni delle cellule in un tessuto vivente. Prevediamo che questa metodologia aiuterà i ricercatori a esplorare ulteriormente i meccanismi che controllano i processi cellulari dinamici che avvengono sia durante il rinnovamento che la rigenerazione dentale.

Over the past two decades, the mouse incisor has emerged as an invaluable platform for investigating the principles of adult stem cell regulation and tooth regeneration1,2. The mouse incisor grows continuously and renews itself throughout the animal&#39;s life. It does so by maintaining both epithelial and mesenchymal stem cells, which can self-renew and differentiate into different cell types of the tooth1,2. While dental epithelial stem cells give rise to ameloblasts, which secrete the enamel matrix, dental mesenchymal stem cells give rise to odontoblasts, cementoblasts, and fibroblasts, which form dentin, cementum, and periodontal ligament, respectively3,4,5,6. This constant supply of new cells maintains tissue homeostasis and allows the replacement of old cells that are lost due to masticatory wear or injuries7,8. Elucidating the cellular and molecular mechanisms that regulate the maintenance and differentiation of dental stem cells is therefore central to understanding dental regeneration, an area of growing interest.
Anatomically, a large portion of the adult mouse incisor is encased in the jawbone. While the incisal edge of the tooth is exposed, the apical end of the incisor fits within a socket and is firmly attached to the surrounding bone through periodontal ligaments and connective tissues (Figure 1A,B). The incisor&#39;s apical end is also the growth region of the tooth and maintains dental stem and progenitor cells in both the epithelial layer and the mesenchymal pulp9,10,11,12,13. Specifically, dental epithelial stem cells are maintained at the bulbous end of the epithelium, known as the apical bud, also referred to as the labial cervical loop (Figure 1C). Similar to the intestinal epithelium and the epidermis, epithelial renewal in the incisor is primarily supported by actively cycling stem cells and their highly proliferative intermediate descendants, called transit-amplifying cells14,15,16,17, both residing in the inner part of the cervical loop. However, whether the incisor epithelium contains and utilizes quiescent stem cells during regeneration remains to be determined. In contrast, both active and quiescent dental mesenchymal stem cells have been identified in the apical pulp, and the quiescent stem cells function as a reserve population that becomes activated during injury repair13,18.
Many of the discoveries on the biology of the mouse incisor renewal and regeneration have resulted from histological investigations, in which samples are obtained at distinct temporal junctures, fixed, processed, and then sectioned into micron-thin slices along a particular plane. Through detailed analysis of histological sections from different mouse models that enable lineage tracing or genetic perturbations, scientists have identified the cell lineages of different progenitor populations, as well as the genetic and signaling pathways that control incisor homeostasis and injury repair19,20,21. However, the static two-dimensional (2D) images of non-vital cells in sections cannot capture the full spectrum of cellular behaviors and spatial organizations in living tissue, such as cell shape changes, movements, and cellular kinetics. Detecting and measuring these rapid cellular changes, which occur at a timescale that is unresolvable through tissue sectioning, require a different strategy. Moreover, acquiring such information is also critical for understanding how dental cells interact with each other, react to different signaling stimuli, and self-organize to maintain tissue structures and functions.
The advent of four-dimensional (4D) deep tissue imaging using two-photon microscopy22, a technology that integrates three spatial dimensions with temporal resolution, overcomes the inherent limitations of histological analysis by enabling spatiotemporal examination of cultured tissue explants, organoids, or even tissues in situ23,24,25,26. For instance, 4D live imaging of the developing tooth epithelium has unveiled the spatiotemporal patterns of cell divisions and migrations that coordinate tissue growth, signaling center formation, and dental epithelial morphogenesis27,28,29,30,31,32. In the adult mouse incisor, 4D imaging has been recently adapted to study cellular behaviors during dental epithelial injury repair. Live imaging revealed that stratum intermedium cells in the suprabasal layer can be directly converted into ameloblasts in the basal layer to regenerate the damaged epithelium, challenging the traditional paradigm of epithelial injury repair15.
Here, we describe the dissection, culturing, and imaging of the adult mouse incisor, focusing on epithelial cells in the labial cervical loop (Figure 1). This technique preserves dental cell vitality for more than 12 h and permits live tracking of fluorescently labeled cells at single-cell resolution. This approach allows investigation of cell motion and migration as well as dynamic changes in cell shape and division orientation under normal culture conditions, or in responses to genetic, physical, and chemical perturbations.

Autore in primo piano: Comprensione dei comportamenti cellulari dinamici nel rinnovamento e nella riparazione del tessuto dentale del topo adulto 

Utilizzo dell'imaging dal vivo ex vivo per studiare le divisioni e i movimenti cellulari durante il rinnovamento dentale del topo

To maintain the correct cellular organization during organ renewal, tissue approaching the cells move and dividing specific orientations and patterns. It is therefore important to understand the rules and regulations of these dynamic cellular events. The mouse incisor is an emerging model for adult stem cell research, and many genetic tools are available in the system to study gene functions, and to label cells for lineage tracing.Most studies to date use adult dental samples collected and fixed its specific time points, and this prevents us from examining life cell behavior. In this protocol, we describe a method to track lifestyles in the adult mouse incisor, and this technique will enable future studies that aim to understand how dynamic cell behaviors contribute to the renewal and repairment of dental tissues.

La regione apicale dell'incisivo del topo adulto è racchiusa all'interno della mandibola (Figura 1) e quindi non è direttamente accessibile per visualizzare e seguire in tempo reale le cellule progenitrici che risiedono all'interno della regione di crescita. Pertanto, abbiamo sviluppato un metodo per estrarre l'intero incisivo dall'osso mascellare e mantenerlo in un sistema di coltura di espianto per la microscopia timelapse a due fotoni (Figura 2). Qui descri...

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L'imaging dal vivo ex vivo è una potente tecnica per studiare i processi dinamici dei movimenti e delle interazioni cellulari nei tessuti viventi. Qui, presentiamo un protocollo che implementa la microscopia a due fotoni per tracciare in tempo reale le cellule epiteliali dentali in incisivi di topo adulti interi in coltura.

The continuously growing mouse incisor is emerging as a highly tractable model system to investigate the regulation of adult epithelial and mesenchymal ...

Per mantenere la corretta organizzazione cellulare durante il rinnovamento degli organi, i tessuti che si avvicinano alle cellule si muovono e si dividono orientamenti e modelli specifici. È quindi importante comprendere le regole e i regolamenti di questi eventi cellulari dinamici. L'incisivo di topo è un modello emergente per la ricerca sulle cellule staminali adulte e molti strumenti genetici sono disponibili nel sistema per studiare le funzioni geniche e per etichettare le cellule per tracciare il lignaggio.La maggior parte degli studi fino ad oggi utilizza campioni dentali di adulti raccolti e fissati in punti temporali specifici, e questo ci impedisce di esaminare il comportamento delle cellule vitali. In questo protocollo, descriviamo un metodo per tracciare gli stili di vita nell'incisivo di topo adulto, e questa tecnica consentirà studi futuri che mirano a capire come i comportamenti cellulari dinamici contribuiscono al rinnovamento e alla riparazione dei tessuti dentali.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal

855 Views.  University of California Los Angeles. Per mantenere la corretta organizzazione cellulare durante il rinnovamento degli organi, i tessuti che si avvicinano alle cellule si muovono e si dividono orientamenti e modelli specifici. È quindi importante comprendere le regole e i regolamenti di questi eventi cellulari dinamici. L'incisivo di topo è un modello emergente per la ricerca sulle cellule staminali adulte e molti strumenti genetici sono disponibili nel sistema per studiare le funzioni geniche e per etichettare le cellule per t...

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