우리는 이광자 현미경을 제공한 캘리포니아 나노시스템 연구소(RRID:SCR_022789)의 UCLA Advanced Light Microscopy/Spectroscopy Laboratory 및 Leica Microsystems Center of Excellence를 인정합니다. AS는 이스라엘 과학 재단(Israel Science Foundation)의 ISF 604-21의 지원을 받았습니다. JH는 NIH/NIDCR의 R03DE030205 및 R01DE030471의 지원을 받았습니다. AS와 JH는 또한 미국-이스라엘 양국 과학 재단(BSF)의 보조금 2021007 지원을 받았습니다.

모든 쥐는 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 또는 예루살렘 히브리 대학교(HUJI)의 병원균이 없는 동물 시설에서 관리되었습니다. 마우스와 관련된 모든 실험은 각 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 규정 및 프로토콜에 따라 수행되었습니다(ARC-2019-013; UCLA) 또는 (MD-23-17184-3; HUJI)를 사용합니다. 실험 단계의 일반적인 워크플로우는 그림 2A에 나와 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 기기, 시약 및 재료와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 용액 및 겔의 준비
<ol><li>해부 배지: 0.5% 포도당으로 신선한 DMEM/F12를 준비하고 2.4단계에서 필요할 때까지 37°C에서 따뜻하게 유지합니다. 참고: 라이브 이미징 중 자가형광을 줄이기 위해 페놀 레드가 없는 DMEM/F12를 사용합니다.</li>
	<li>배양 배지 1개: 50% DMEM/F12, 50% 쥐 혈청, 1x 글루타민 대체물, 1x MEM 비필수 아미노산, 1% 포도당, 0.1mg/mL L-아스코르브산 및 0.5% 페니실린-스트렙토마이신을 사용하여 신선한 배지를 준비합니다. 37단계에서 필요할 때까지 5.5°C에서 따뜻하게 유지하십시오. 이 배지는 라이브 이미징 중에 앞니 외식을 배양하는 데 사용됩니다. 참고: 쥐 혈청은 고품질이어야 하며 연구원 또는 상업적 출처에서 전체 조직 배양을 위해 특별히 준비되어야 합니다. 특히, 혈액은 응고가 형성되기 전에 원심분리(실온에서 1,200× g 에서 5분 동안)해야 합니다. 원심분리 후, 생성된 피브린 응고를 압착하여 폐기해야 한다33.</li>
	<li>배양 겔: 겔의 목적은 이미징 중에 샘플을 고정시키는 것이며 신선하게 준비됩니다.<ol><li>전자레인지를 사용하여 10mL의 DMEM/F12에 저융점 아가로스 200mg을 용해시켜 DMEM/F12의 2% 겔을 만듭니다. 2% 겔을 37°C로 유지합니다.</li>
		<li>50% 쥐 혈청, 1x 글루타민 대체물, 1x MEM 비필수 아미노산, 1% 포도당, 0.1mg/mL L-아스코르브산 및 0.5% 페니실린-스트렙토마이신을 혼합하여 2x 배양 배지(DMEM/F12 제외)를 만듭니다. 2x 배양 배지(DMEM/F12 제외)를 37°C로 예열합니다.</li>
		<li>2% 겔과 2x 배양 배지(DMEM/F12 제외)를 동일한 부피로 혼합하여 1% 배양 겔을 만듭니다. 5.1단계에서 필요할 때까지 1% 배양 젤을 37°C로 유지합니다. 알림: 겔화를 방지하기 위해 혼합하기 전에 모든 용액이 따뜻한지 확인하십시오. 우리는 1% 젤이 성인 쥐 앞니를 배양하는 데 적합하다는 것을 발견했습니다. 겔 비율은 다른 조직을 배양해야 하는 경우 경험적으로 결정되어야 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 성체 마우스 하악골 적출
<ol><li>IACUC에서 승인한 표준 절차에 따라 원하는 나이에 마우스를 안락사시킵니다. 알림: 여기서는 CO2 질식 후 경추 탈구를 사용합니다. 동물 안락사에 대한 규정은 지역마다 다를 수 있습니다. 연구자는 실험을 수행하기 전에 필요한 기관 승인을 받아야 하며 현지 동물 관리 규정을 준수해야 합니다.</li>
	<li>70% 에탄올을 사용하여 마우스를 소독합니다.</li>
	<li>쥐의 목을 베고 왼쪽과 오른쪽 하악골을 추출합니다.<ol><li>마우스를 배에 눕힌 다음 #9 단일 모서리 산업용 면도날을 사용하여 목 부분을 자르고 마우스 머리를 몸의 나머지 부분과 분리합니다. 참고: 인두나 목 부위의 조직도 채취해야 하는 경우 참수를 수행해서는 안 되며 2.3.2단계로 바로 진행할 수 있습니다.</li>
		<li>마우스를 뒤집어 복부 쪽이 위를 향하고 하악골에 쉽게 접근할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>엄지와 검지 사이에 동물의 머리를 부드럽게 잡아 고정합니다.</li>
		<li>면도날을 사용하여 아래턱의 피부를 아랫입술에서 목선으로 자르는 시상 중간 절개를 합니다. 알림: #15 수술용 칼날을 사용하여 절개 및 후속 절개를 할 수도 있습니다(2.3.6-2.3.9단계).</li>
		<li>절개할 때 엄지와 검지를 사용하여 절단된 피부를 벌려 그 아래의 근육과 턱뼈를 노출시킵니다.</li>
		<li>면도날을 사용하여 아래턱 협측의 교근을 절단하여 왼쪽과 오른쪽 편근의 바깥쪽에 근육 부착물이 없도록 합니다.</li>
		<li>하악골 안쪽을 따라 있는 골수설근을 절단하여 하악골의 근육 부착물을 제거합니다.</li>
		<li>두 개의 반구를 연결하는 하악 대칭을 다시 절개합니다. 절단되면 하악골은 왼쪽과 오른쪽 절반으로 분리됩니다.</li>
		<li>하악과두와 측두하악관절 사이에 면도날을 끼우고 머리의 나머지 부분에서 반구를 조심스럽게 해부합니다. 참고: 자르는 동안 앞니를 부드럽게 당기는 것이 도움이 된다는 것을 알았습니다. 하악골이 부러지거나 하악골의 연조직이 손상되지 않도록 주의해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>즉시 예열된 해부 배지를 사용하여 절개된 하악골을 페트리 접시로 옮기고(1.1단계) #15 수술용 칼날을 사용하여 나머지 근육 조직을 제거합니다. 참고: 샘플을 차가운 매체에 보관하면 세포 활동이 느려져 실시간 이미징 중에 증식 또는 세포 이동과 같은 특정 세포 활동의 복구가 지연되거나 실패할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 전체 마우스 앞니의 격리
참고: 앞니의 추가 분리는 명시야 해부 현미경으로 수행됩니다.
<ol><li>앞니를 덮고 앞니의 정점 부분을 수용하는 하악의 타원형 영역을 시각적으로 식별합니다.</li>
	<li>안쪽(설측) 표면이 위쪽을 향하도록 하악골을 배치합니다.</li>
	<li>한 쌍의 톱니 모양의 집게로 하악골을 제자리에 고정하면서 과두에서 어금니 방향으로 #15 수술용 칼날을 사용하여 위에 놓인 막 뼈를 깎아 타원형 영역에 창을 만듭니다. 이렇게 하면 치근단 앞니의 연조직이 안쪽 표면에 노출됩니다.</li>
	<li>바깥쪽(협측) 표면이 위쪽을 향하도록 하악골을 뒤집습니다.</li>
	<li>3.3단계에서 설명한 대로 하악골 바깥쪽의 타원형 영역에 창을 생성하고 메스 끝을 사용하여 가장자리에 남아 있는 뼈 조각을 제거합니다. 치아의 정점 끝이 양쪽에서 보이는지 확인하십시오. 알림: 뼈를 면도하는 동안 과도한 압력을 가하지 않도록 하여 밑에 있는 연조직의 손상을 방지하십시오.</li>
	<li>앞니 주변의 뼈를 체계적으로 잘라내어 치아 전체를 분리합니다.<ol><li>정점 앞니에 바로 인접한 평면을 깨끗하게 절개하여 먼저 과두돌기를 제거합니다. 참고: 앞니를 자르지 않도록 주의하십시오.</li>
		<li>제3대구치 바로 뒤에서 두 번째 절개를 하되 치아를 손상시키지 않고 앞니에서 등쪽을 절개합니다. 이렇게 하면 코로나 돌기가 포함된 뼈가 제거됩니다.</li>
		<li>각돌기의 끝에서 앞니를 향해 연속적으로 절단하여 복부 하악을 단계적으로 제거합니다. 참고: 치아 상피 및 관련 치주 조직은 종종 뼈에 달라붙어 복부 뼈의 많은 부분을 한 번에 자르면 쉽게 찢어집니다. 앞니 연조직에서 뼈를 분리하기 위해 앞니의 정점 끝에 있는 두 조직 사이에 메스(또는 톱니 모양의 날카로운 집게 한 쌍)를 삽입하고 기구를 조심스럽게 앞으로 밀어 넣을 수 있습니다.</li>
		<li>어금니가 있는 치조골과 앞니에 붙어 있는 나머지 뼈를 잘라냅니다.</li>
		<li>이제 앞니 전체가 분리되어 있습니다. 완전히 절개된 앞니를 깨끗하고 따뜻한 해부 배지가 있는 접시에 옮깁니다(1.1단계).</li>
	</ol></li>
	<li>3.2-3.6단계를 반복하여 필요에 따라 추가 앞니를 분리합니다. 참고: 마우스의 상악/상악 앞니는 또한 성체 줄기세포를 유지하며, 치아 재생을 연구하는데 사용될 수 있다34. 치과 연구자들은 일반적으로 아래 앞니에 초점을 맞추는데, 그 이유는 위 앞니보다 접근이 더 쉽고 더 쉽게 절개할 수 있기 때문입니다. 하악 앞니와 상악 앞니 전구 세포의 차이는 아직 밝혀지지 않았습니다.</li>
</ol>4. 앞니 상피 경추 루프를 노출시키기 위한 치주 조직 제거
<ol><li>앞니 전체를 설측으로 눕히고 한 쌍의 톱니 모양의 집게로 치아를 제자리에 고정하면서 #5 미세한 집게를 사용하여 정점 앞니와 경추 루프 영역을 덮는 치주 조직을 집어넣기 시작합니다.</li>
	<li>정점 새싹에서 치주 조직을 조심스럽게 벗겨내어 경추 루프의 측면(또는 다른 관심 영역)이 스코프 아래에서 보이도록 합니다. 알림: 치아 상피가 손상되거나 중간엽에서 분리되지 않도록 주의해야 합니다. 앞니의 관심 영역에 형광 신호가 있고 형광 해부 현미경을 사용할 수 있는 경우 형광 신호를 사용하여 조직 유형을 구별하고 해부를 도울 수 있습니다. 샘플을 배양 배지로 신속하게 옮기고 외식물 배양을 통해 적절하게 유지할 수 있도록 섹션 2-4를 효율적으로 수행하는 것이 중요합니다(아래 참조).</li>
</ol>5. 외식물 배양을 위한 조직 매립
<ol><li>500μL의 따뜻하고 응고되지 않은 배양 젤을 24웰 플레이트의 웰에 넣고 절개된 전체 앞니를 웰로 빠르게 옮깁니다. 접시를 몇 번 휘저어 앞니를 헹굽니다.</li>
	<li>400μL의 따뜻하고 응고되지 않은 배양 젤을 배양 접시에 넣고 헹군 앞니를 접시에 옮깁니다. 알림: 우리는 관류 설정과 호환되는 시중에서 판매되는 배양 접시를 사용합니다. 대체 옵션은 6.4단계를 참조하십시오.</li>
	<li>앞니의 방향을 잡아 경추 루프 영역(또는 기타 관심 영역)을 접시 중앙에 배치하고(그림 2A,B) 원하는 이미징 평면에 맞게 정점 앞니의 기울기를 조정합니다. 참고: 조직 배향은 완전한 겔화 전에 신속하게 수행되어야 합니다.</li>
	<li>젤을 굳힌 후 미세한 집게를 사용하여 관심 영역 위에 있는 젤을 제거하여 젤로 덮이지 않도록 합니다.</li>
	<li>샘플(~150μL)을 덮을 수 있도록 접시 가장자리에 천천히 피펫팅하여 충분한 양의 따뜻한 배양 배지를 추가합니다.</li>
	<li>외식물 배양액을 37°C 세포 배양 인큐베이터로 옮겨 조직 침전과 배양 조건 조절을 1시간 동안 진행합니다.</li>
</ol>6. 앞니 외식의 타임랩스 현미경 검사
참고: 이 실험에서는 개구수가 1인 25x 침지 대물렌즈가 장착된 정립 현미경을 사용했습니다. 일반적으로 개구수가 높은 water dipping lens는 deep tissue imaging에 가장 적합합니다.
<ol><li>현미경과 이광자 레이저를 켭니다.</li>
	<li>배양 접시를 s에 고정tage 어댑터를 선택하고 관류 어댑터 링을 상단에 장착합니다(그림 2C).</li>
	<li>단계 연결tage 배양을 37°C로 유지하도록 설정된 온도 컨트롤러에 어댑터를 연결합니다.</li>
	<li>어댑터 링의 입구와 출구를 마이크로 관류 펌프에 연결하고 펌프에서 관류 속도를 20으로 설정하여 배양 배지의 관류를 시작합니다. 이렇게 하면 시료 상단에서 배양 배지의 느린 흐름(~5mL/h)이 생성됩니다(그림 2C). 알림: 안정적으로 제어되는 환경에서 조직을 유지하기 위한 시스템에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 다른 시스템도 사용할 수 있습니다. 37°C 가열판과 주사기 펌프에 연결된 입구 및 출구가 있는 수제 관류 배양 접시(보충 그림 S1)의 조합도 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>어댑터 링 위에 ACBR(Atmospheric Control Barrier Ring)을 놓고 ACBR을 통해 대물렌즈를 내려 배양 배지와 접촉하도록 합니다(그림 2D).</li>
	<li>레이저 파장을 920nm로 조정하여 GFP 및 적색 형광(예: tdTomato) 신호를 모두 시각화합니다.</li>
	<li>접안렌즈를 통해 샘플을 찾은 다음 현미경의 소프트웨어에서 샘플을 찾습니다.</li>
	<li>소프트웨어를 사용하여 Z-스택, 다중 위치 이미징 및 시간 간격을 설정합니다. 이 프로토콜을 따르려면 4μm의 z-스텝 크기와 14시간 동안 5분의 시간 간격을 사용합니다. 참고: 5분보다 긴 시간 간격은 부드러운 세포 이동과 분열을 포착하기에 충분하지 않은 경우가 많다는 것을 발견했습니다.</li>
	<li>타임랩스 이미징을 시작합니다. 알림: Sample 위치는 처음 1시간 동안 이동할 수 있으며 추가 조정이 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>다운스트림 데이터 처리 및 분석을 위해 파일을 저장합니다.</li>
</ol>

Two-Photon Microscopy를 통한 치아 세포의 실시간 추적

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

살아있는 조직 이미징은 세포가 틈새 환경에서 유지될 때 세포의 역동적인 과정과 행동을 연구할 수 있게 해주는 중요한 기술이다41. 이상적으로, 라이브 이미징은 높은 시공간 해상도로 생체 내에서 수행됩니다. 그러나, 포유류 장기에 대한 생체내 이미징은 조직 접근의 불가능성, 광학적 불투명도, 그리고 장기간 동안 동물 또는 장기를 고정시키는 것의 어려움으?...

지난 20년 동안 마우스 앞니는 성체 줄기 세포 조절 및 치아 재생의 원리를 조사하기 위한 귀중한 플랫폼으로 부상했습니다 1,2. 쥐 앞니는 동물의 일생 동안 지속적으로 성장하고 스스로 재생됩니다. 상피 줄기세포와 중간엽 줄기세포를 모두 유지함으로써 이를 수행하며, 이 줄기세포는 치아의 다른 세포 유형으로 자가 재생되고 분화할 수 있습니다 1,2. 치아 상피 줄기세포는 법랑질 기질을 분비하는 아멜로아세포를 생성하는 반면, 치아 중간엽 줄기세포는 상아질, 시멘트 및 치주 인대를 형성하는 odontoblast, cementoblast 및 fibroblast를 각각생성합니다 3,4,5,6. 이러한 새로운 세포의 지속적인 공급은 조직의 항상성을 유지하고 저작 마모 또는 부상으로 인해 손실된 오래된 세포를 대체할 수 있도록 합니다 7,8. 따라서 치아 줄기 세포의 유지와 분화를 조절하는 세포 및 분자 메커니즘을 밝히는 것은 점점 더 관심이 높아지고 있는 분야인 치아 재생을 이해하는 데 중요합니다.
해부학적으로 성체 쥐 앞니의 상당 부분이 턱뼈에 둘러싸여 있습니다. 치아의 앞니 가장자리가 노출되어 있는 동안 앞니의 치근단 끝은 소켓 내에 맞고 치주 인대와 결합 조직을 통해 주변 뼈에 단단히 부착됩니다(그림 1A, B). 앞니의 정점 끝은 치아의 성장 영역이기도 하며 상피층과 중간엽 치수(9,10,11,12,13) 모두에서 치아 줄기 세포와 전구 세포를 유지합니다. 특히, 치아 상피 줄기 세포는 순 경부 루프라고도 하는 정점 새싹으로 알려진 상피의 구근 끝에서 유지됩니다(그림 1C). 장 상피 및 표피와 유사하게, 앞니의 상피 재생은 주로 자궁 경부 고리의 안쪽 부분에 있는 줄기 세포와 통과 증폭 세포(transit-amplifying cells)라고 불리는 고도로 증식하는 중간 자손(14,15,16,17)에 의해 주로 지원됩니다. 그러나 앞니 상피가 재생 중에 정지된 줄기세포를 포함하고 활용하는지 여부는 아직 결정되지 않았습니다. 대조적으로, 활성 및 정지 치아 중간엽 줄기 세포는 모두 정점 치수에서 확인되었으며, 정지 줄기 세포는 부상 복구 동안 활성화되는 예비 개체군으로 기능합니다13,18.
생쥐 앞니 재생 및 재생의 생물학에 대한 많은 발견은 뚜렷한 시간적 접합점에서 샘플을 획득하고 고정, 처리 한 다음 특정 평면을 따라 미크론 두께의 조각으로 절단하는 조직 학적 조사의 결과입니다. 계통 추적 또는 유전적 교란을 가능하게 하는 다양한 마우스 모델의 조직학적 단면에 대한 상세한 분석을 통해 과학자들은 서로 다른 전구 세포 집단의 세포 계통뿐만 아니라 앞니 항상성 및 손상 복구를 제어하는 유전 및 신호 전달 경로를 확인했습니다 19,20,21. 그러나 단면에서 중요하지 않은 세포의 정적 2차원(2D) 이미지는 세포 형태 변화, 움직임 및 세포 동역학과 같은 생체 조직의 세포 행동 및 공간 조직의 전체 스펙트럼을 캡처할 수 없습니다. 조직 절편을 통해 해결할 수 없는 시간 척도에서 발생하는 이러한 급격한 세포 변화를 검출하고 측정하려면 다른 전략이 필요합니다. 또한 이러한 정보를 획득하는 것은 치과 세포가 서로 상호 작용하고, 다양한 신호 자극에 반응하고, 조직 구조와 기능을 유지하기 위해 스스로 조직화하는 방법을 이해하는 데에도 중요합니다.
3차원과 시간적 해상도를 통합하는 기술인 이광자 현미경22를 사용한 4차원(4D) 심부 조직 이미징의 출현은 배양된 조직 외식, 오가노이드 또는 심지어 제자리 조직의 시공간 검사를 가능하게 함으로써 조직학적 분석의 본질적인 한계를 극복합니다 23,24,25,26 . 예를 들어, 발달하는 치아 상피의 4D 라이브 이미징은 조직 성장, 신호 중추 형성 및 치아 상피 형태 형성을 조정하는 세포 분열 및 이동의 시공간 패턴을 밝혔습니다 27,28,29,30,31,32. 성체 쥐 앞니에서 4D 이미징은 최근 치아 상피 손상 복구 중 세포 거동을 연구하는 데 적용되었습니다. 실시간 이미징을 통해 기저층의 중간층 세포가 기저층에서 아멜로아세포로 직접 전환되어 손상된 상피를 재생할 수 있으며, 이는 상피 손상 복구의 전통적인 패러다임에 도전하는 것으로 나타났다15.
여기에서는 순 경추 루프의 상피 세포에 초점을 맞춘 성체 쥐 앞니의 해부, 배양 및 이미징에 대해 설명합니다(그림 1). 이 기술은 12시간 이상 치아 세포의 활력을 보존하고 단일 세포 분해능에서 형광 표지된 세포를 실시간으로 추적할 수 있습니다. 이 접근법을 통해 정상적인 배양 조건 또는 유전적, 물리적, 화학적 섭동에 대한 반응에서 세포 형태 및 분열 방향의 동적 변화뿐만 아니라 세포 운동 및 이동을 조사할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well, flat bottom tissue culture plate</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>25-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x HC IRAPO motCORR water dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11507704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid (Vitamin C)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>352685000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose bioxtra&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delta T system&#160;</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>0420-4</td>
			<td>Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope- LEICA S9E</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LED300 SLI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11039047</td>
			<td>Basal media without phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather surgical blade (#15)</td>
			<td>Feather</td>
			<td>72044-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-melting agarose</td>
			<td>NuSieve</td>
			<td>50080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-essential amino acids (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>90 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>AS3061SC</td>
			<td>Processed for live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade #9</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>37133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serrated forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11000-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spring scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ex vivo live imaging to investigate cell divisions and movements during mouse dental renewal

지속적으로 성장하는 마우스 앞니는 성체 상피 및 중간엽 줄기 세포의 조절과 치아 재생을 조사하기 위한 다루기 쉬운 모델 시스템으로 부상하고 있습니다. 이러한 전구 세포는 활발하게 분열, 이동 및 분화하여 조직 항상성을 유지하고 손실된 세포를 반응하는 방식으로 재생합니다. 그러나 고정 조직 절편을 사용하는 기존 분석은 세포 움직임 및 상호 작용의 동적 과정을 포착할 수 없었기 때문에 해당 규정을 연구하는 능력이 제한되었습니다. 이 논문은 이식 배양 시스템에서 전체 마우스 앞니를 유지하고 다광자 타임랩스 현미경을 사용하여 치아 상피 세포를 실시간으로 추적하는 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 치과 연구를 위한 기존 도구 상자에 추가되며 연구자가 살아있는 조직의 세포 행동 및 조직에 대한 시공간 정보를 얻을 수 있도록 합니다. 우리는 이 방법론이 연구자들이 치아 재생과 재생 중에 발생하는 역동적인 세포 과정을 제어하는 메커니즘을 추가로 탐구하는 데 도움이 될 것으로 기대합니다.

Over the past two decades, the mouse incisor has emerged as an invaluable platform for investigating the principles of adult stem cell regulation and tooth regeneration1,2. The mouse incisor grows continuously and renews itself throughout the animal&#39;s life. It does so by maintaining both epithelial and mesenchymal stem cells, which can self-renew and differentiate into different cell types of the tooth1,2. While dental epithelial stem cells give rise to ameloblasts, which secrete the enamel matrix, dental mesenchymal stem cells give rise to odontoblasts, cementoblasts, and fibroblasts, which form dentin, cementum, and periodontal ligament, respectively3,4,5,6. This constant supply of new cells maintains tissue homeostasis and allows the replacement of old cells that are lost due to masticatory wear or injuries7,8. Elucidating the cellular and molecular mechanisms that regulate the maintenance and differentiation of dental stem cells is therefore central to understanding dental regeneration, an area of growing interest.
Anatomically, a large portion of the adult mouse incisor is encased in the jawbone. While the incisal edge of the tooth is exposed, the apical end of the incisor fits within a socket and is firmly attached to the surrounding bone through periodontal ligaments and connective tissues (Figure 1A,B). The incisor&#39;s apical end is also the growth region of the tooth and maintains dental stem and progenitor cells in both the epithelial layer and the mesenchymal pulp9,10,11,12,13. Specifically, dental epithelial stem cells are maintained at the bulbous end of the epithelium, known as the apical bud, also referred to as the labial cervical loop (Figure 1C). Similar to the intestinal epithelium and the epidermis, epithelial renewal in the incisor is primarily supported by actively cycling stem cells and their highly proliferative intermediate descendants, called transit-amplifying cells14,15,16,17, both residing in the inner part of the cervical loop. However, whether the incisor epithelium contains and utilizes quiescent stem cells during regeneration remains to be determined. In contrast, both active and quiescent dental mesenchymal stem cells have been identified in the apical pulp, and the quiescent stem cells function as a reserve population that becomes activated during injury repair13,18.
Many of the discoveries on the biology of the mouse incisor renewal and regeneration have resulted from histological investigations, in which samples are obtained at distinct temporal junctures, fixed, processed, and then sectioned into micron-thin slices along a particular plane. Through detailed analysis of histological sections from different mouse models that enable lineage tracing or genetic perturbations, scientists have identified the cell lineages of different progenitor populations, as well as the genetic and signaling pathways that control incisor homeostasis and injury repair19,20,21. However, the static two-dimensional (2D) images of non-vital cells in sections cannot capture the full spectrum of cellular behaviors and spatial organizations in living tissue, such as cell shape changes, movements, and cellular kinetics. Detecting and measuring these rapid cellular changes, which occur at a timescale that is unresolvable through tissue sectioning, require a different strategy. Moreover, acquiring such information is also critical for understanding how dental cells interact with each other, react to different signaling stimuli, and self-organize to maintain tissue structures and functions.
The advent of four-dimensional (4D) deep tissue imaging using two-photon microscopy22, a technology that integrates three spatial dimensions with temporal resolution, overcomes the inherent limitations of histological analysis by enabling spatiotemporal examination of cultured tissue explants, organoids, or even tissues in situ23,24,25,26. For instance, 4D live imaging of the developing tooth epithelium has unveiled the spatiotemporal patterns of cell divisions and migrations that coordinate tissue growth, signaling center formation, and dental epithelial morphogenesis27,28,29,30,31,32. In the adult mouse incisor, 4D imaging has been recently adapted to study cellular behaviors during dental epithelial injury repair. Live imaging revealed that stratum intermedium cells in the suprabasal layer can be directly converted into ameloblasts in the basal layer to regenerate the damaged epithelium, challenging the traditional paradigm of epithelial injury repair15.
Here, we describe the dissection, culturing, and imaging of the adult mouse incisor, focusing on epithelial cells in the labial cervical loop (Figure 1). This technique preserves dental cell vitality for more than 12 h and permits live tracking of fluorescently labeled cells at single-cell resolution. This approach allows investigation of cell motion and migration as well as dynamic changes in cell shape and division orientation under normal culture conditions, or in responses to genetic, physical, and chemical perturbations.

저자 스포트라이트: Understanding Dynamic Cellular Behaviors in Adult Mouse Dental Tissue Renewal and Repairment(성인 마우스 치아 조직 재생 및 수리에서 동적 세포 행동 이해) 

Ex vivo Live Imaging을 사용하여 마우스 치아 재생 중 세포 분열 및 움직임 조사

To maintain the correct cellular organization during organ renewal, tissue approaching the cells move and dividing specific orientations and patterns. It is therefore important to understand the rules and regulations of these dynamic cellular events. The mouse incisor is an emerging model for adult stem cell research, and many genetic tools are available in the system to study gene functions, and to label cells for lineage tracing.Most studies to date use adult dental samples collected and fixed its specific time points, and this prevents us from examining life cell behavior. In this protocol, we describe a method to track lifestyles in the adult mouse incisor, and this technique will enable future studies that aim to understand how dynamic cell behaviors contribute to the renewal and repairment of dental tissues.

성체 쥐 앞니의 정점 영역은 하악골 내에 둘러싸여 있기 때문에(그림 1) 성장 영역 내에 있는 전구 세포를 시각화하고 실시간으로 추적하기 위해 직접 접근할 수 없습니다. 따라서 우리는 턱뼈에서 전체 앞니를 추출하고 이광자 타임랩스 현미경을 위한 외식물 배양 시스템에서 유지하는 방법을 개발했습니다(그림 2). 여기서는 치아 상피의 순 경추 루프...

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생체 외 라이브 이미징은 생체 조직에서 세포 움직임과 상호 작용의 동적 과정을 연구하기 위한 강력한 기술입니다. 여기에서는 배양된 전체 성체 마우스 앞니에서 치아 상피 세포를 실시간으로 추적하기 위해 이광자 현미경을 구현하는 프로토콜을 제시합니다.

The continuously growing mouse incisor is emerging as a highly tractable model system to investigate the regulation of adult epithelial and mesenchymal ...

장기 재생 중에 올바른 세포 조직을 유지하기 위해 세포에 접근하는 조직은 특정 방향과 패턴을 이동하고 분열합니다. 따라서 이러한 역동적인 세포 이벤트의 규칙과 규정을 이해하는 것이 중요합니다. 생쥐 앞니는 성체 줄기 세포 연구의 새로운 모델이며, 유전자 기능을 연구하고 계통 추적을 위해 세포에 라벨을 붙이기 위해 시스템에서 많은 유전 도구를 사용할 수 있습니다.현재까지 대부분의 연구는 특정 시점을 수집하고 고정한 성인 치아 샘플을 사용하기 때문에 생명 세포의 행동을 조사할 수 없습니다. 이 프로토콜에서는 성체 마우스 앞니의 생활 방식을 추적하는 방법을 설명하며, 이 기술은 동적 세포 행동이 치아 조직의 재생 및 복구에 어떻게 기여하는지 이해하는 것을 목표로 하는 향후 연구를 가능하게 할 것입니다.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal

867 조회수.  University of California Los Angeles. 장기 재생 중에 올바른 세포 조직을 유지하기 위해 세포에 접근하는 조직은 특정 방향과 패턴을 이동하고 분열합니다. 따라서 이러한 역동적인 세포 이벤트의 규칙과 규정을 이해하는 것이 중요합니다. 생쥐 앞니는 성체 줄기 세포 연구의 새로운 모델이며, 유전자 기능을 연구하고 계통 추적을 위해 세포에 라벨을 붙이기 위해 시스템에서 많은 유전 도구를 사용할 수 있습니...

비디오: 저자 스포트라이트: Understanding Dynamic Cellular Behaviors in Adult Mouse Dental Tissue Renewal and Repairment(성인 마우스 치아 조직 재생 및 수리에서 동적 세포 행동 이해) 

The continuously growing mouse incisor is emerging as a highly tractable model system to investigate the regulation of adult epithelial and mesenchymal stem cells and tooth regeneration. These progenitor populations actively divide, move, and differentiate to maintain tissue homeostasis and regenerate lost cells in a responsive manner. However, traditional analyses using fixed tissue sections could not capture the dynamic processes of cellular movements and interactions, limiting our ability to study their regulations. This paper describes a protocol to maintain whole mouse incisors in an explant culture system and live-track dental epithelial cells using multiphoton timelapse microscopy. This technique adds to our existing toolbox for dental research and allows investigators to acquire spatiotemporal information on cell behaviors and organizations in a living tissue. We anticipate that this methodology will help researchers further explore mechanisms that control the dynamic cellular processes taking place during both dental renewal and regeneration.

Ex vivo live imaging is a powerful technique for studying the dynamic processes of cellular movements and interactions in living tissues. Here, we present a protocol that implements two-photon microscopy to live track dental epithelial cells in cultured whole adult mouse incisors.

연구

발생학

Dissection and Isolation of Mouse Mandibular Incisors and Associated Periodontal Tissues to Expose the Incisor Epithelial Cervical Loop

To begin, turn the euthanized mouse over so its ventral side faces up and the mandibles are easily accessible. Secure the mouse's head gently between the thumb and the index finger. Using a razor blade, starting from the lower lip toward the neckline, make a mid-sagittal incision on the lower jaw skin.During the incision, use the thumb and index finger to open the cut skin, exposing the underneath muscles and jawbone. Next, sever the masseter muscles on the buccal side of the lower jaw. Sever the mylohyoid muscles along the inner side of the mandible and remove muscle attachments.Make another incision at the mandibular synthesis, connecting the two hemi-mandibles, separating them into the left and right halves. Wedge the razor blade between the mandibular condyle and the temporal mandibular joint to carefully dissect out the hemi mandible from the rest of the head. Immediately transfer the dissected mandibles to a Petri dish containing pre-warmed dissection medium.Next, under a brightfield dissection microscope, use a number 15 surgical blade to remove muscle tissues. Identify the oval region of the mandible that covers the incisor socket and houses the apical portion of the incisor. Position the mandibles such that the inner or lingual surface is facing upward.While holding the mandible with a pair of serrated forceps, using a number 15 surgical blade, shave off the overlying membrane bone from the condyle towards the molars to generate a window at the oval. This exposes the soft tissue of the apical incisor on the inner surface. Next, turn the mandible so the outer or buccal surface faces upwards.As demonstrated for the inner mandible, generate a window at the oval region on the outer mandible. Using a pair of forceps, pick away the remaining bone fragments at the edge, ensuring that the apical end of the tooth is visible from both sides. To isolate the entire tooth, make a clean cut at a plane immediately adjacent to the apical incisor to remove the condylar process.Then make a second cut just posterior to the third molar, but dorsal to the incisor, without damaging the tooth, to remove the coronary process. Serially cut from the tip of the angular process towards the incisor to gradually remove the ventral mandible. Next, cut away the alveolar bone with molars and any remaining bones that are still attached to the incisor.Transfer the fully dissected incisor to a dish containing warm dissection media. Turn on the fluorescent microscope and use the fluorescent signal from tissues to guide the removal of periodontium. Position the inner incisor on its lingual side, and using serrated forceps hold the tooth in place.Then using a pair of number five fine forceps, start tugging on the periodontal tissues, covering the apical incisor, and the cervical loop region. Carefully peel off periodontal tissues from the apical bud, such that the lateral side of the cervical loop is visible.

앞니 상피 자궁 경부 루프를 노출시키기 위한 마우스 하악 앞니 및 관련 치주 조직의 해부 및 격리

Periodontal Tissue Embedding and Timelapse Microscopy of Mouse Incisor Explant Cultures

To begin, add 500 microliters of warm culture gel to a well in a 24-well plate. Quickly transfer the dissected whole incisors isolated from the mouse to the well. Swirl the plate a few times to rinse the incisors.Add 400 microliters of warm culture gel to a culture dish and to transfer the rinsed incisors to the dish. Orient the incisor to position the cervical loop region at the center of the dish and adjust the tilt of the apical incisor for the desired imaging plane. Once the gel is set, using a pair of fine forceps, remove any gel on top of the region of interest.Add approximately 150 microliters of warm culture media against the edge of the dish to cover the sample. Place the explant culture at 37 degrees Celsius to allow the tissue to settle. After one hour, turn on the microscope and the two-photon laser.Secure the culture dish to the stage adapter and place the profusion adapter ring on top. Connect the stage adapter to a temperature controller to maintain the culture at 37 degrees Celsius. Connect the inlet and the outlet of the adapter ring to a microprofusion pump.Set the profusion speed to 20 and initiate the profusion of the medium over the sample. Place an ACBR on top of the adapter ring and raise the stage so the objective fits through the ACBR to make contact with the culture medium. Turn the laser wavelength to 920 nanometers to visualize GFP.After locating the sample through an eyepiece, visualize it with a microscope software, then set up Z-step size of four micrometers and a time interval of five minutes for 14 hours. Initiate the time-lapse imaging and save the subsequent files for downstream data analysis. In time-lapse microscopy of the K14-Cre;R26-rtTA;tetO-H2B-GFP cervical loop, the H2B-GFP signals were predominantly observed in the trans-amplifying region of the cervical loop, indicating active cell divisions.Further, the condensation and alignment of chromosomes at the metaphase plate in mitotic cells followed by their segregation during anaphase and into two daughter cells was observed. Most cell divisions were perpendicular or at an oblique angle relative to the basement membrane with fewer horizontal divisions parallel to the basement membrane. Cell division events were also apparent in K14-Cre;R26-mT/mG cervical loops where all epithelial cell membranes were labeled green.Mitotic cells were identified by their cell rounding and subsequent cytokinesis. In K14-Cre;R26-mT/mG cervical loops, both horizontal and vertical cell divisions were also observed.