UCLA Gelişmiş Işık Mikroskobu/Spektroskopi Laboratuvarı'na ve California NanoSystems Enstitüsü'ndeki (RRID:SCR_022789) Leica Microsystems Mükemmeliyet Merkezi'ne iki foton mikroskobu sağladıkları için teşekkür ederiz. AS, İsrail Bilim Vakfı'ndan ISF 604-21 tarafından desteklenmiştir. JH, NIH/NIDCR'den R03DE030205 ve R01DE030471 tarafından desteklendi. AS ve JH, Amerika Birleşik Devletleri-İsrail İki Uluslu Bilim Vakfı'ndan (BSF) hibe 2021007 de desteklendi.

Tüm fareler, California Los Angeles Üniversitesi'nde (UCLA) veya Kudüs İbrani Üniversitesi'nde (HUJI) patojen içermeyen hayvan tesislerinde tutuldu. Fareleri içeren tüm deneyler, ilgili Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan yönetmelik ve protokollere göre gerçekleştirildi (ARC-2019-013; UCLA) veya (MD-23-17184-3; HUJI). Deneysel adımların genel bir iş akışı Şekil 2A'da gösterilmiştir. Bu protokolde kullanılan tüm aletler, reaktifler ve malzemelerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Çözelti ve jellerin hazırlanması
<ol><li>Diseksiyon ortamı: %0,5 glikoz içeren taze DMEM/F12 hazırlayın ve adım 2.4'te ihtiyaç duyulana kadar 37 °C'de sıcak tutun. NOT: Canlı görüntüleme sırasında otofloresansı azaltmak için fenol kırmızısı içermeyen DMEM/F12 kullanıyoruz.</li>
	<li>1x Kültür ortamı:% 50 DMEM / F12,% 50 sıçan serumu,% 1 glutamin ikamesi, 1x MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler,% 1 glikoz,% 0.1 mg / mL L-askorbik asit ve% 0.5 penisilin-streptomisin kullanarak taze ortam hazırlayın. Adım 5.5'te ihtiyaç duyulana kadar 37 °C'de sıcak tutun. Bu besiyeri, canlı görüntüleme sırasında kesici diş eksplantlarını kültürlemek için kullanılır. NOT: Sıçan serumu yüksek kalitede olmalı ve araştırmacılar tarafından veya ticari bir kaynaktan tüm doku kültürü için özel olarak hazırlanmalıdır. Özellikle, pıhtılaşma oluşmaya başlamadan önce kan santrifüj edilmelidir (oda sıcaklığında 1.200 × g'da 5 dakika). Santrifüjlemeden sonra ortaya çıkan fibrin pıhtısı sıkılmalı ve atılmalıdır33.</li>
	<li>Kültür jeli: Jelin amacı, görüntüleme sırasında numuneleri hareketsiz hale getirmektir ve taze olarak hazırlanır.<ol><li>Bir mikrodalga kullanarak 200 mg düşük erime noktalı agarozu 10 mL DMEM/F12 içinde çözerek DMEM/F12'de% 2 jel yapın. %2'lik jeli 37 °C'de tutun.</li>
		<li>% 50 sıçan serumu, 1 x glutamin ikamesi, 1 x MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler,% 1 glikoz, 0.1 mg / mL L-askorbik asit ve% 0.5 penisilin-streptomisin karıştırarak 2x kültür ortamı (DMEM / F12 olmadan) yapın. 2x kültür ortamını (DMEM/F12 olmadan) 37 °C'ye ısıtın.</li>
		<li>Eşit hacimlerde% 2 jel ve 2x kültür ortamını (DMEM / F12 olmadan) karıştırarak% 1 kültür jeli yapın. Adım 5.1'de ihtiyaç duyulana kadar% 1 kültür jelini 37 ° C'de tutun. NOT: Jelleşmeyi önlemek için karıştırmadan önce tüm solüsyonların sıcak olduğundan emin olun. Yetişkin fare kesici dişlerini kültürlemek için %1 jelin uygun olduğunu gördük. Diğer dokular kültürlenecekse jel yüzdesi ampirik olarak belirlenmelidir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Yetişkin fare mandibulalarının çıkarılması
<ol><li>IACUC tarafından onaylanan standart prosedürleri kullanarak fareleri istenen yaşta ötenazi yapın. NOT: Burada CO2 boğulmasını takiben servikal çıkık kullanıyoruz. Hayvan ötenazisi için düzenlemeler farklı bölgelerde farklılık gösterebilir. Araştırmacılar, deneyleri gerçekleştirmeden önce gerekli kurumsal onayı almalı ve yerel hayvan bakımı yönetmeliklerine uygunluğu sağlamalıdır.</li>
	<li>Fareyi% 70 etanol kullanarak dezenfekte edin.</li>
	<li>Farenin başını kesin ve sol ve sağ mandibulaları çıkarın.<ol><li>Fareyi karnının üzerine yatırın, ardından boyun bölgesini kesmek ve fare kafasını vücudun geri kalanından ayırmak için #9 tek kenarlı endüstriyel tıraş bıçağı kullanın. NOT: Farenks veya boyun bölgesinden de dokular toplanacaksa, dekapitasyon yapılmamalıdır ve doğrudan adım 2.3.2'ye geçilebilir.</li>
		<li>Fareyi ventral tarafı yukarı bakacak ve mandibulalara kolayca erişilebilecek şekilde ters çevirin.</li>
		<li>Hayvanın başını başparmak ve işaret parmağı arasında nazikçe tutarak sabitleyin.</li>
		<li>Alt çenenin derisini alt dudaktan boyun çizgisine doğru kesen orta sagital bir kesi yapmak için tıraş bıçağını kullanın. NOT: İnsizyon ve sonraki diseksiyonları yapmak için #15 cerrahi bıçak da kullanılabilir (adım 2.3.6-2.3.9).</li>
		<li>Kesi yapılırken, altındaki kasları ve çene kemiğini ortaya çıkarmak için başparmak ve işaret parmağını kullanarak kesilen deriyi açın.</li>
		<li>Alt çenenin bukkal tarafındaki masseter kaslarını kesmek için tıraş bıçağını kullanın, böylece sol ve sağ yarımların dış kısmı artık kas eklerinden arınmış olur.</li>
		<li>Oradaki kas eklerini çıkarmak için mandibulanın iç tarafındaki mylohyoid kasları kesin.</li>
		<li>İki hemimandible'ı birbirine bağlayan mandibular simfizde başka bir kesi yapın. Kesildikten sonra mandibula sol ve sağ yarıya ayrılacaktır.</li>
		<li>Tıraş bıçağını mandibular kondil ile temporal mandibular eklem arasına sıkıştırın ve hemimandible'ı başın geri kalanından dikkatlice çıkarın. NOT: Keserken aynı anda kesici dişi nazikçe çekmeyi faydalı bulduk. Alt çenenin kırılmamasına ve içindeki yumuşak dokulara zarar vermemesine özen gösterilmelidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Diseke edilmiş mandibulaları önceden ısıtılmış diseksiyon ortamı ile hemen bir Petri kabına aktarın (adım 1.1) ve kalan kas dokularını #15 cerrahi bıçak kullanarak çıkarın. NOT: Numunelerin soğuk ortamda tutulması, hücre aktivitelerini yavaşlatır, bu da canlı görüntüleme sırasında proliferasyon veya hücre hareketi gibi belirli hücre aktivitelerinin gecikmeli ve hatta başarısız bir şekilde geri kazanılmasına neden olur.</li>
</ol>3. Tüm fare kesici dişlerinin izolasyonu
NOT: Kesici dişin daha fazla izolasyonu, parlak alan diseksiyon mikroskobu altında yapılır.
<ol><li>Kesici diş yuvasını kaplayan ve kesici dişin apikal kısmını barındıran mandibulanın oval bölgesini görsel olarak tanımlayın.</li>
	<li>Mandibulayı iç (lingual) yüzey yukarı bakacak şekilde konumlandırın.</li>
	<li>Mandibulayı bir çift tırtıklı forseps ile yerinde tutarken, kondilden azı dişlerine doğru bir yönde #15 cerrahi bıçak kullanarak üstteki zar kemiğini tıraş ederek oval bölgede bir pencere oluşturun. Bu, apikal kesici dişin yumuşak dokusunu iç yüzeyde ortaya çıkarır.</li>
	<li>Mandibulayı, dış (bukkal) yüzey yukarı bakacak şekilde ters çevirin.</li>
	<li>Adım 3.3'te açıklandığı gibi dış mandibuladaki oval bölgede bir pencere oluşturun ve kenarda kalan kemik parçalarını almak için neşterin ucunu kullanın. Dişin apikal ucunun her iki taraftan da görünür olduğundan emin olun. NOT: Alttaki yumuşak dokuya zarar vermemek için kemikleri tıraş ederken aşırı basınçtan kaçının.</li>
	<li>Tüm dişi izole etmek için kesici dişi çevreleyen kemikleri sistematik olarak kesin.<ol><li>Önce kondiler işlemi çıkarmak için apikal kesici dişin hemen bitişiğindeki bir düzlemde temiz bir kesim yapın. NOT: Kesici dişi kesmemeye dikkat edin.</li>
		<li>3. azı dişinin hemen arkasında, ancak dişe zarar vermeden kesici dişin dorsalinde ikinci bir kesi yapın. Bu, koronoid süreci içeren kemiği çıkarır.</li>
		<li>Ventral mandibulayı kademeli olarak kademeli olarak çıkarmak için açısal işlemin ucundan kesici kısma doğru seri olarak kesin. NOT: Diş epiteli ve ilişkili periodontal dokular genellikle kemiğe yapışır ve ventral kemiğin büyük bir kısmı bir kerede kesilirse kolayca kopar. Kemiği kesici yumuşak dokudan ayırmak için, neşter (veya bir çift keskin tırtıklı olmayan forseps) kesici dişin apikal ucundaki iki doku arasına yerleştirilebilir ve alet hassas bir şekilde ileri kaydırılabilir.</li>
		<li>Alveolar kemiği azı dişleri ve hala kesici dişlere bağlı kalan kemiklerle kesin.</li>
		<li>Tüm kesici diş şimdi izole edilmiştir. Tamamen diseke edilmiş kesici dişi temiz, sıcak diseksiyon ortamı olan bir kaba aktarın (adım 1.1).</li>
	</ol></li>
	<li>Gerektiğinde ek kesici dişleri izole etmek için 3.2-3.6 adımlarını tekrarlayın. NOT: Farenin maksiller/üst kesici dişleri de yetişkin kök hücreleri korur ve diş rejenerasyonunu incelemek için kullanılabilir34. Diş araştırmacıları tipik olarak alt kesici dişlere odaklanır çünkü bunlar daha erişilebilirdir ve üst kesici dişlerden daha kolay diseke edilebilir. Mandibular ve maksiller kesici progenitör hücreler arasındaki farklar henüz belirlenmemiştir.</li>
</ol>4. Kesici epitelyal servikal halkayı ortaya çıkarmak için periodontal dokuların çıkarılması
<ol><li>Tüm kesici diş lingual tarafında yatarken ve dişi bir çift tırtıklı forseps ile yerinde tutarken, apikal kesici dişi ve servikal halka bölgesini kaplayan periodontal dokuları sıkıştırmaya başlamak için bir çift #5 ince forseps kullanın.</li>
	<li>Periodontal dokuyu apikal tomurcuktan dikkatlice soyun, böylece servikal döngünün (veya diğer ilgi bölgelerinin) lateral tarafı kapsam altında görünür hale gelir. NOT: Diş epiteline zarar vermemek veya mezenşimden ayrılmamak için özen gösterilmelidir. Kesici dişin ilgilenilen bölgede floresan sinyalleri varsa ve bir floresan diseksiyon mikroskobu mevcutsa, doku tiplerini ayırt etmeye yardımcı olmak ve diseksiyonlara yardımcı olmak için floresan sinyalleri kullanılabilir. Numunelerin hızlı bir şekilde kültür ortamına aktarılabilmesi ve eksplant kültürü yoluyla yeterince korunabilmesi için bölüm 2-4'ün verimli bir şekilde yürütülmesi önemlidir (aşağıya bakınız).</li>
</ol>5. Eksplant kültürü için doku gömme
<ol><li>24 oyuklu bir plakadaki bir kuyucuğa 500 μL ılık, katılaşmamış kültür jeli ekleyin ve diseke edilen bütün kesici dişleri hızlı bir şekilde kuyuya aktarın. Kesici dişleri durulamak için plakayı birkaç kez döndürün.</li>
	<li>Bir kültür kabına 400 μL ılık, katılaşmamış kültür jeli ekleyin ve durulanmış kesici dişleri tabağa aktarın. NOT: Perfüzyon kurulumuyla uyumlu, piyasada bulunan bir kültür kabı kullanıyoruz. Alternatif seçenekler için adım 6.4'e bakın.</li>
	<li>Servikal halka bölgesini (veya ilgilenilen diğer bölgeleri) çanağın ortasına yerleştirmek için kesici dişi yönlendirin (Şekil 2A,B) ve apikal kesici dişin eğimini istenen görüntüleme düzlemi için ayarlayın. NOT: Doku oryantasyonu, tam jelleşmeden önce hızlı bir şekilde yapılmalıdır.</li>
	<li>Jel sertleştikten sonra, jel ile kaplanmaması için ilgilenilen bölgenin üstündeki herhangi bir jeli çıkarmak için bir çift ince forseps kullanın.</li>
	<li>Numuneyi (~150 μL) kaplayacak şekilde tabağın kenarına yavaşça pipetleyerek yeterli hacimde ılık kültür ortamı ekleyin.</li>
	<li>Doku çökelmesine ve 1 saat boyunca kültür durumuna uyum sağlamasına izin vermek için eksplant kültürünü 37 °C'lik bir hücre kültürü inkübatörüne taşıyın.</li>
</ol>6. Kesici diş eksplantlarının timelapse mikroskobu
NOT: Bu deneyde, sayısal açıklığı 1 olan 25x suya daldırma objektifi ile donatılmış dik bir mikroskop kullandık. Genel olarak, yüksek sayısal açıklığa sahip bir su daldırma merceği, derin doku görüntüleme için en uygunudur.
<ol><li>Mikroskobu ve iki fotonlu lazeri açın.</li>
	<li>Kültür çanağını s'ye sabitleyintage adaptör ve perfüzyon adaptör halkasını üstüne monte edin (Şekil 2C).</li>
	<li>Kültürü 37 °C'de tutmak için s'yi bir sıcaklık kontrol cihazına bağlayın.</li>
	<li>Adaptör halkasının giriş ve çıkışını bir mikro perfüzyon pompasına bağlayın ve pompada perfüzyon hızı 20'ye ayarlanmış olarak kültür ortamının perfüzyonuna başlayın. Bu, numunelerin üst kısmında kültür ortamının yavaş bir akışını (~5 mL/h) oluşturur (Şekil 2C). NOT: Dokuyu stabil bir şekilde kontrol edilen bir ortamda tutmak için sistemle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Diğer sistemler de kullanılabilir. 37 °C'lik bir ısıtma plakası ve şırınga pompalarına bağlı bir giriş ve çıkışa sahip ev yapımı bir perfüzyon kültürü kabının (Ek Şekil S1) bir kombinasyonu da kullanılabilir.</li>
	<li>Adaptör halkasının üzerine bir Atmosferik Kontrol Bariyeri Halkası (ACBR) yerleştirin ve sadece kültür ortamıyla temas etmek için hedefi ACBR'den indirin (Şekil 2D).</li>
	<li>Hem GFP hem de kırmızı floresan (örn. tdTomato) sinyallerini görselleştirmek için lazer dalga boyunu 920 nm'ye ayarlayın.</li>
	<li>Örnekleri göz merceklerinden ve ardından mikroskobun yazılımından bulun.</li>
	<li>Yazılımı kullanarak Z yığınlarını, çok konumlu görüntülemeyi ve zaman aralıklarını ayarlayın. Bu protokolü takip etmek için, 4 μm'lik bir z adımı boyutu ve 14 saat boyunca 5 dakikalık bir zaman aralığı kullanın. NOT: 5 dakikadan daha uzun bir zaman aralığının, düzgün hücre hareketlerini ve bölünmelerini yakalamak için genellikle yetersiz olduğunu bulduk.</li>
	<li>Timelapse görüntülemeyi başlatın. NOT: Numune konumu ilk bir saat içinde değişebilir ve daha fazla ayarlama gerekebilir.</li>
	<li>Aşağı akış veri işleme ve analizleri için dosyaları kaydedin.</li>
</ol>

İki foton mikroskobu ile diş hücrelerinin canlı takibi

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Canlı doku görüntüleme, hücrelerin niş ortamlarında tutulduklarında dinamik süreçlerini ve davranışlarını incelememizi sağlayan önemli bir tekniktir41. İdeal olarak, canlı görüntüleme yüksek uzay-zamansal çözünürlükle in vivo olarak gerçekleştirilir. Bununla birlikte, memeli organları için in vivo görüntüleme, doku erişilemezliği, optik opaklık ve hayvanı veya organı uzun süre hareketsiz hale getirme zorluğu nedeniyle zor olabilir<sup clas...

Son yirmi yılda, fare kesici dişi, yetişkin kök hücre regülasyonu ve diş rejenerasyonuilkelerini araştırmak için paha biçilmez bir platform olarak ortaya çıkmıştır 1,2. Fare kesici diş sürekli büyür ve hayvanın yaşamı boyunca kendini yeniler. Bunu, kendi kendini yenileyebilen ve dişin farklı hücre tiplerine farklılaşabilen hem epitelyal hem de mezenkimal kök hücreleri koruyarak yapar 1,2. Dental epitelyal kök hücreler mine matriksini salgılayan ameloblastlara yol açarken, dental mezenkimal kök hücreler sırasıyla dentin, sement ve periodontal ligament oluşturan odontoblastlara, sementoblastlara ve fibroblastlara yol açar 3,4,5,6. Bu sürekli yeni hücre kaynağı, doku homeostazını korur ve çiğneme aşınması veya yaralanmalar nedeniyle kaybedilen eski hücrelerin değiştirilmesine izin verir 7,8. Bu nedenle, dental kök hücrelerin korunmasını ve farklılaşmasını düzenleyen hücresel ve moleküler mekanizmaların aydınlatılması, artan bir ilgi alanı olan dental rejenerasyonu anlamanın merkezinde yer almaktadır.
Anatomik olarak, yetişkin fare kesici dişinin büyük bir kısmı çene kemiği ile kaplıdır. Dişin insizal kenarı açıktayken, kesici dişin apikal ucu bir yuvaya oturur ve periodontal ligamentler ve bağ dokuları aracılığıyla çevre kemiğe sıkıca tutunur (Şekil 1A,B). Kesici dişin apikal ucu aynı zamanda dişin büyüme bölgesidir ve hem epitel tabakasında hem de mezenkimal pulpada diş sapı ve progenitör hücreleri korur 9,10,11,12,13. Spesifik olarak, diş epitelyal kök hücreleri, apikal tomurcuk olarak bilinen ve labial servikal döngü olarak da adlandırılan epitelin soğanlı ucunda tutulur (Şekil 1C). Bağırsak epiteli ve epidermise benzer şekilde, kesici dişteki epitelyal yenilenme, öncelikle aktif olarak döngüsel kök hücreler ve bunların transit-amplifikasyon hücreleri 14,15,16,17 olarak adlandırılan, her ikisi de servikal döngünün iç kısmında bulunan yüksek oranda proliferatif ara torunları tarafından desteklenir. Bununla birlikte, kesici epitelin rejenerasyon sırasında hareketsiz kök hücreler içerip içermediği ve kullanıp kullanmadığı henüz belirlenmemiştir. Buna karşılık, apikal pulpada hem aktif hem de hareketsiz dental mezenkimal kök hücreler tanımlanmıştır ve hareketsiz kök hücreler, yaralanma onarımı sırasında aktive olan bir yedek popülasyon olarak işlev görür13,18.
Fare kesici dişlerin yenilenmesi ve yenilenmesinin biyolojisi üzerine yapılan keşiflerin çoğu, örneklerin farklı zamansal kavşaklarda elde edildiği, sabitlendiği, işlendiği ve daha sonra belirli bir düzlem boyunca mikron inceliğinde dilimler halinde bölümlere ayrıldığı histolojik araştırmalardan kaynaklanmıştır. Bilim adamları, soy takibini veya genetik bozulmaları mümkün kılan farklı fare modellerinden alınan histolojik kesitlerin ayrıntılı analizi yoluyla, farklı progenitör popülasyonların hücre soylarının yanı sıra kesici diş homeostazını ve yaralanma onarımını kontrol eden genetik ve sinyal yollarını tanımladılar 19,20,21. Bununla birlikte, bölümlerdeki hayati olmayan hücrelerin statik iki boyutlu (2B) görüntüleri, hücre şekli değişiklikleri, hareketleri ve hücresel kinetik gibi canlı dokudaki hücresel davranışların ve uzamsal organizasyonların tam spektrumunu yakalayamaz. Doku kesiti ile çözülemeyen bir zaman ölçeğinde meydana gelen bu hızlı hücresel değişiklikleri tespit etmek ve ölçmek farklı bir strateji gerektirir. Ayrıca, bu tür bilgileri edinmek, diş hücrelerinin birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğini, farklı sinyal uyaranlarına nasıl tepki verdiğini ve doku yapılarını ve işlevlerini korumak için kendi kendini nasıl organize ettiğini anlamak için de kritik öneme sahiptir.
Üç uzamsal boyutu zamansal çözünürlükle bütünleştiren bir teknoloji olan iki foton mikroskobu22 kullanılarak dört boyutlu (4D) derin doku görüntülemenin ortaya çıkışı, kültürlenmiş doku eksplantlarının, organoidlerin ve hatta dokuların yerinde uzay-zamansal incelemesini sağlayarak histolojik analizin doğal sınırlamalarının üstesinden gelir 23,24,25,26 . Örneğin, gelişmekte olan diş epitelinin 4 boyutlu canlı görüntülemesi, doku büyümesini, sinyal merkezi oluşumunu ve diş epitel morfogenezini koordine eden hücre bölünmelerinin ve göçlerinin uzay-zamansal modellerini ortaya çıkarmıştır 27,28,29,30,31,32. Yetişkin fare kesici dişinde, 4D görüntüleme son zamanlarda diş epitel yaralanması onarımı sırasında hücresel davranışları incelemek için uyarlanmıştır. Canlı görüntüleme, suprabazal tabakadaki stratum intermedium hücrelerinin, hasarlı epiteli yeniden oluşturmak için bazal tabakada doğrudan ameloblastlara dönüştürülebileceğini ortaya koydu ve geleneksel epitel hasarı onarımı paradigmasınameydan okudu 15.
Burada, labial servikal döngüdeki epitel hücrelerine odaklanarak yetişkin fare kesici dişinin diseksiyonunu, kültürlenmesini ve görüntülenmesini açıklıyoruz (Şekil 1). Bu teknik, diş hücresi canlılığını 12 saatten fazla korur ve floresan etiketli hücrelerin tek hücre çözünürlüğünde canlı olarak izlenmesine izin verir. Bu yaklaşım, hücre hareketi ve göçünün yanı sıra normal kültür koşulları altında veya genetik, fiziksel ve kimyasal bozulmalara yanıt olarak hücre şekli ve bölünme oryantasyonundaki dinamik değişikliklerin araştırılmasına izin verir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well, flat bottom tissue culture plate</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>25-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x HC IRAPO motCORR water dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11507704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid (Vitamin C)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>352685000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose bioxtra&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delta T system&#160;</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>0420-4</td>
			<td>Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope- LEICA S9E</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LED300 SLI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11039047</td>
			<td>Basal media without phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather surgical blade (#15)</td>
			<td>Feather</td>
			<td>72044-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-melting agarose</td>
			<td>NuSieve</td>
			<td>50080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-essential amino acids (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>90 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>AS3061SC</td>
			<td>Processed for live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade #9</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>37133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serrated forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11000-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spring scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ex vivo live imaging to investigate cell divisions and movements during mouse dental renewal

Sürekli büyüyen fare kesici dişi, yetişkin epitelyal ve mezenkimal kök hücrelerin düzenlenmesini ve diş rejenerasyonunu araştırmak için oldukça izlenebilir bir model sistem olarak ortaya çıkmaktadır. Bu progenitör popülasyonlar, doku homeostazını korumak ve kayıp hücreleri duyarlı bir şekilde yenilemek için aktif olarak bölünür, hareket eder ve farklılaşır. Bununla birlikte, sabit doku kesitlerini kullanan geleneksel analizler, hücresel hareketlerin ve etkileşimlerin dinamik süreçlerini yakalayamadı ve bu da düzenlemelerini inceleme yeteneğimizi sınırladı. Bu makale, bir eksplant kültür sisteminde tüm fare kesici dişlerini korumak ve multifoton timelapse mikroskobu kullanarak canlı diş epitel hücrelerini izlemek için bir protokolü açıklamaktadır. Bu teknik, diş araştırmaları için mevcut araç kutumuza katkıda bulunur ve araştırmacıların canlı bir dokudaki hücre davranışları ve organizasyonları hakkında uzay-zamansal bilgi edinmelerini sağlar. Bu metodolojinin, araştırmacıların hem diş yenilenmesi hem de rejenerasyon sırasında meydana gelen dinamik hücresel süreçleri kontrol eden mekanizmaları daha fazla keşfetmelerine yardımcı olacağını tahmin ediyoruz.

Over the past two decades, the mouse incisor has emerged as an invaluable platform for investigating the principles of adult stem cell regulation and tooth regeneration1,2. The mouse incisor grows continuously and renews itself throughout the animal&#39;s life. It does so by maintaining both epithelial and mesenchymal stem cells, which can self-renew and differentiate into different cell types of the tooth1,2. While dental epithelial stem cells give rise to ameloblasts, which secrete the enamel matrix, dental mesenchymal stem cells give rise to odontoblasts, cementoblasts, and fibroblasts, which form dentin, cementum, and periodontal ligament, respectively3,4,5,6. This constant supply of new cells maintains tissue homeostasis and allows the replacement of old cells that are lost due to masticatory wear or injuries7,8. Elucidating the cellular and molecular mechanisms that regulate the maintenance and differentiation of dental stem cells is therefore central to understanding dental regeneration, an area of growing interest.
Anatomically, a large portion of the adult mouse incisor is encased in the jawbone. While the incisal edge of the tooth is exposed, the apical end of the incisor fits within a socket and is firmly attached to the surrounding bone through periodontal ligaments and connective tissues (Figure 1A,B). The incisor&#39;s apical end is also the growth region of the tooth and maintains dental stem and progenitor cells in both the epithelial layer and the mesenchymal pulp9,10,11,12,13. Specifically, dental epithelial stem cells are maintained at the bulbous end of the epithelium, known as the apical bud, also referred to as the labial cervical loop (Figure 1C). Similar to the intestinal epithelium and the epidermis, epithelial renewal in the incisor is primarily supported by actively cycling stem cells and their highly proliferative intermediate descendants, called transit-amplifying cells14,15,16,17, both residing in the inner part of the cervical loop. However, whether the incisor epithelium contains and utilizes quiescent stem cells during regeneration remains to be determined. In contrast, both active and quiescent dental mesenchymal stem cells have been identified in the apical pulp, and the quiescent stem cells function as a reserve population that becomes activated during injury repair13,18.
Many of the discoveries on the biology of the mouse incisor renewal and regeneration have resulted from histological investigations, in which samples are obtained at distinct temporal junctures, fixed, processed, and then sectioned into micron-thin slices along a particular plane. Through detailed analysis of histological sections from different mouse models that enable lineage tracing or genetic perturbations, scientists have identified the cell lineages of different progenitor populations, as well as the genetic and signaling pathways that control incisor homeostasis and injury repair19,20,21. However, the static two-dimensional (2D) images of non-vital cells in sections cannot capture the full spectrum of cellular behaviors and spatial organizations in living tissue, such as cell shape changes, movements, and cellular kinetics. Detecting and measuring these rapid cellular changes, which occur at a timescale that is unresolvable through tissue sectioning, require a different strategy. Moreover, acquiring such information is also critical for understanding how dental cells interact with each other, react to different signaling stimuli, and self-organize to maintain tissue structures and functions.
The advent of four-dimensional (4D) deep tissue imaging using two-photon microscopy22, a technology that integrates three spatial dimensions with temporal resolution, overcomes the inherent limitations of histological analysis by enabling spatiotemporal examination of cultured tissue explants, organoids, or even tissues in situ23,24,25,26. For instance, 4D live imaging of the developing tooth epithelium has unveiled the spatiotemporal patterns of cell divisions and migrations that coordinate tissue growth, signaling center formation, and dental epithelial morphogenesis27,28,29,30,31,32. In the adult mouse incisor, 4D imaging has been recently adapted to study cellular behaviors during dental epithelial injury repair. Live imaging revealed that stratum intermedium cells in the suprabasal layer can be directly converted into ameloblasts in the basal layer to regenerate the damaged epithelium, challenging the traditional paradigm of epithelial injury repair15.
Here, we describe the dissection, culturing, and imaging of the adult mouse incisor, focusing on epithelial cells in the labial cervical loop (Figure 1). This technique preserves dental cell vitality for more than 12 h and permits live tracking of fluorescently labeled cells at single-cell resolution. This approach allows investigation of cell motion and migration as well as dynamic changes in cell shape and division orientation under normal culture conditions, or in responses to genetic, physical, and chemical perturbations.

Yazar Spotlight: Yetişkin Fare Diş Dokusu Yenileme ve Onarımında Dinamik Hücresel Davranışları Anlama 

Fare Diş Yenileme Sırasında Hücre Bölünmelerini ve Hareketlerini Araştırmak için Ex Vivo Canlı Görüntülemeyi Kullanma

Yetişkin fare kesici dişinin apikal bölgesi mandibula içinde yer alır (Şekil 1) ve bu nedenle, büyüme bölgesinde bulunan progenitör hücreleri görselleştirmek ve canlı izlemek için doğrudan erişilebilir değildir. Bu nedenle, tüm kesici dişin çene kemiğinden çıkarılması ve iki fotonlu timelapse mikroskobu için bir eksplant kültür sisteminde tutulması için bir yöntem geliştirdik (Şekil 2). Burada, diş epitelinin labial servikal d?...

Watch this Scientific Journal Video about Understanding Dynamic Cellular Behaviors in Adult Mouse Dental Tissue Renewal and Repairment at JoVE.com

Ex vivo canlı görüntüleme, canlı dokulardaki hücresel hareketlerin ve etkileşimlerin dinamik süreçlerini incelemek için güçlü bir tekniktir. Burada, kültürlenmiş tüm yetişkin fare kesici dişlerinde diş epitel hücrelerini canlı izlemek için iki foton mikroskobu uygulayan bir protokol sunuyoruz.

The continuously growing mouse incisor is emerging as a highly tractable model system to investigate the regulation of adult epithelial and mesenchymal ...

Organ yenilenmesi sırasında doğru hücresel organizasyonu sürdürmek için, hücrelere yaklaşan doku hareket eder ve belirli yönelimleri ve kalıpları böler. Bu nedenle, bu dinamik hücresel olayların kurallarını ve düzenlemelerini anlamak önemlidir. Fare kesici dişi, yetişkin kök hücre araştırmaları için ortaya çıkan bir modeldir ve sistemde gen fonksiyonlarını incelemek ve soy takibi için hücreleri etiketlemek için birçok genetik araç mevcuttur.Bugüne kadar yapılan çalışmaların çoğu, belirli zaman noktalarında toplanan ve sabitlenen yetişkin diş örneklerini kullanır ve bu, yaşam hücresi davranışını incelememizi engeller. Bu protokolde, yetişkin fare kesici dişlerindeki yaşam tarzlarını izlemek için bir yöntem tarif ediyoruz ve bu teknik, dinamik hücre davranışlarının diş dokularının yenilenmesine ve onarımına nasıl katkıda bulunduğunu anlamayı amaçlayan gelecekteki çalışmaları mümkün kılacaktır.

using-ex-vivo-live-imaging-to-investigate-cell-divisions-movements

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal

907 Görüntüleme.  University of California Los Angeles. Organ yenilenmesi sırasında doğru hücresel organizasyonu sürdürmek için, hücrelere yaklaşan doku hareket eder ve belirli yönelimleri ve kalıpları böler. Bu nedenle, bu dinamik hücresel olayların kurallarını ve düzenlemelerini anlamak önemlidir. Fare kesici dişi, yetişkin kök hücre araştırmaları için ortaya çıkan bir modeldir ve sistemde gen fonksiyonlarını incelemek ve soy takibi için hücreleri etiketlemek için birçok genetik araç mevcuttur.Bugüne k...

Video: Yazar Spotlight: Yetişkin Fare Diş Dokusu Yenileme ve Onarımında Dinamik Hücresel Davranışları Anlama 

The continuously growing mouse incisor is emerging as a highly tractable model system to investigate the regulation of adult epithelial and mesenchymal stem cells and tooth regeneration. These progenitor populations actively divide, move, and differentiate to maintain tissue homeostasis and regenerate lost cells in a responsive manner. However, traditional analyses using fixed tissue sections could not capture the dynamic processes of cellular movements and interactions, limiting our ability to study their regulations. This paper describes a protocol to maintain whole mouse incisors in an explant culture system and live-track dental epithelial cells using multiphoton timelapse microscopy. This technique adds to our existing toolbox for dental research and allows investigators to acquire spatiotemporal information on cell behaviors and organizations in a living tissue. We anticipate that this methodology will help researchers further explore mechanisms that control the dynamic cellular processes taking place during both dental renewal and regeneration.

Ex vivo live imaging is a powerful technique for studying the dynamic processes of cellular movements and interactions in living tissues. Here, we present a protocol that implements two-photon microscopy to live track dental epithelial cells in cultured whole adult mouse incisors.