يتم تمويل هذه الدراسة جزئيا من قبل مؤسسة جانيت بوروس التذكارية. نحن نعترف بالمرضى وقسم الأورام النسائية في معهد كارمانوس للسرطان لجمع عينات الثرب. كما نعترف بالبنك الحيوي وجوهر العلوم المترابطة في معهد كارمانوس للسرطان لتنسيق توظيف المرضى وإعداد شرائح علم الأمراض. يتم دعم البنك الحيوي وجوهر العلوم المرتبطة جزئيا من خلال منحة مركز المعاهد الوطنية للصحة P30 CA22453 لمعهد كارمانوس للسرطان في جامعة واين ستيت.

تمت مراجعة بروتوكول البحث التالي والموافقة عليه من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة واين ستيت (IRB). تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المرضى قبل الجراحة. يوضح الشكل 1 الخطوات العامة الثلاث في هذا البروتوكول.
1. إعداد أنسجة الثرب البشري
<ol><li>تحضير وسائط زراعة الثرب (DMEM / F12 + 10٪ مصل بقري جنيني + 1٪ بنسلين ستربتومايسين) وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية. القسمة 30-40 مل من هذه الوسائط في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل أو حاوية عينة جراحية.</li>
	<li>الحصول على عينات جراحية من خزعة الأذن أو جراحة استئصال الثرب. اغمر العينة المعقمة في وسائط زراعة الثرب فور إزالتها في غرفة العمليات. إذا كان سير العمل لا يسمح بذلك ، فضع العينة في وسائط ثقافة الثرب في أسرع وقت ممكن. انقل العينة عن طريق وضعها على الثلج وتخزينها على حرارة 4 درجات مئوية حتى المعالجة. ملاحظة: سيحدد حجم عينة الثرب التي تمت إزالتها كمية الأنسجة العملية.</li>
	<li>قم بمعالجة عينة الثرب في غضون 1-2 ساعة من التجميع باستخدام غطاء التدفق الرقائقي. تأكد من أن جميع المواد والأدوات معقمة أو معقمة.</li>
	<li>أخرج الثرب من حاوية التجميع وانقله إلى طبق استزراع 100 مم. اغمر العينة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (1x PBS) واغسل العينة برفق لإزالة أي جلطات دموية أو حطام.</li>
	<li>قطع الأنسجة إلى قطع (0.5 سم × 0.5 سم أو 100-200 ملغ. الشكل 2 أ) باستخدام مقص جراحي صغير أو مشرط 10-15 ملم. استخدم ملقط جراحي صغير للمساعدة في معالجة الأنسجة وتجنب سحق الثرب. إذا تم استخدام جهاز طاقة لإزالة عينة الثرب جراحيا ، فتجنب استخدام الأنسجة المشوهة عند الحافة المختومة.</li>
	<li>ضع كل قطعة من الثرب المقطوع في آبار فردية من صفيحة استزراع مكونة من 24 بئرا واملأ الآبار ب 500 ميكرولتر من وسائط استزراع الثرب أو بحجم يكفي لتغطية الثرب دون السماح لقطعة الثرب بالطفو فوق أرضية البئر (الشكل 2 ب).</li>
	<li>قم بتخزين قطع الثرب في وسائط استزراع طازجة على حرارة 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للحقن.</li>
</ol>2. تحضير خلايا سرطان المبيض
<ol><li>زراعة خلايا سرطان المبيض البشري في قارورة مزرعة 75 سم 2 عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 إلى التقاء 75٪ على الأقل بحلول يوم جمع الثرب. ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول خلايا سرطان المبيض البشري OCSC1-F2 الإيجابية mCherry الموصوفة سابقا15،16،17،18. يمكن تعديله إلى أي خط خلية سرطانية موسوم بإشارة مضان.</li>
	<li>تحضير الخلايا داخل غطاء التدفق الصفحي مباشرة بعد جمع عينة الثرب. تأكد من أن جميع المواد والأدوات معقمة أو معقمة.</li>
	<li>أضف 10 مل من 1x PBS المعقم إلى قارورة الثقافة واغسل الخلايا عن طريق هز القارورة برفق. قم بإزالة 1x PBS ثم أضف 3 مل من 0.05٪ Trypsin-EDTA.</li>
	<li>هز قارورة الثقافة برفق لتغطية جميع الخلايا ، ثم ضع القارورة في حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2) لمدة لا تزيد عن 5 دقائق. اضغط على قارورة الثقافة لفصل الخلايا تماما ، ثم قم بتحييد التربسين بإضافة 3 مل من وسائط زراعة الثرب.</li>
	<li>امزج تعليق الخلية عن طريق السحب ، ثم انقل التعليق إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي التعليق لمدة 5 دقائق عند 1200 × جم عند 24 درجة مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 6 مل من وسائط زراعة الثرب الطازجة.</li>
	<li>عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. تمييع تعليق الخلية إلى ما لا يقل عن 100000 خلية لكل 100-200 ميكرولتر من التعليق. هذا هو حجم الحقن في كل قطعة قطع من الثرب.</li>
	<li>نقل عدد مناسب من الخلايا إلى دورق مزرعة جديد لمواصلة مرور الخلية.</li>
</ol>3. حقن خلايا سرطان المبيض
<ol><li>استخدم حقنة سعة 1 مل لسحب تعليق الخلية ، ثم قم بتوصيل إبرة 26-G. لا تقم بسحب تعليق الخلية باستخدام الإبرة ، لأن هذا يمكن أن يجزئ الخلايا.</li>
	<li>استخدم ملقط جراحي صغير لالتقاط قطعة من الثرب المقطوع. انقل الثرب إلى طبق معقم منفصل لتسهيل الحقن. اخترق الثرب برفق بطرف الإبرة وحقن كمية صغيرة من تعليق الخلية في الأنسجة (الشكل 2C).</li>
	<li>كرر الحقن على عدة مناطق من الثرب إلى حجم إجمالي لا يقل عن 100 ميكرولتر أو 100000 خلية. لاحظ أن الكثير من تعليق الخلية قد يبدو أنه يتجمع حول العينة. إذا كان هناك قلق بشأن جودة الحقن ، فكرر الحقن أو حقن كمية أكبر من تعليق الخلية في العينة.</li>
	<li>أعد عينات الثرب المحقونة في كل بئر من صفيحة استزراع 24 بئرا. لاحظ أن حجم وسائط زراعة الثرب يصل إلى مستوى يغطي الثرب دون السماح له بالطفو. تعامل بعناية مع اللوحة وضعها داخل حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2).</li>
	<li>اختياري: استخدم Matrigel (مصفوفة الغشاء القاعدي) لتعليق أنسجة الثرب في مصفوفة صلبة للسماح بحقن أسهل وتوصيل معلق خلوي أكثر تركيزا.<ol><li>قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي عند 4 درجات مئوية واخلطها بنسبة 1: 1 مع وسائط زراعة الثرب مباشرة قبل الاستخدام. يخزن خليط مصفوفة الغشاء القاعدي على الثلج أو على حرارة 4 درجات مئوية حتى الحقن. املأ الآبار الفارغة بما يكفي من خليط مصفوفة الغشاء القاعدي لغمر قطعة مقطوعة من الثرب.</li>
		<li>ضع العينات في خليط مصفوفة الغشاء القاعدي ثم ضع صفيحة استزراع البئر 24 في حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2) لمدة 20 دقيقة. بمجرد أن يتجمد الخليط ، استمر في الحقن كما هو موضح أعلاه.</li>
	</ol></li>
	<li>تأكيد الحقن الناجح باستخدام التصوير بالفلورسنت. تأكد من تصور خط من إشارة الفلورسنت في مواقع الحقن (الشكل 2D). لاحظ أن العدد الفعلي للخلايا المرتبطة بالثرب بعد الحقن لا يمكن التنبؤ به.</li>
</ol>4. الزراعة المشتركة للثرب البشري وخلايا سرطان المبيض
<ol><li>قم بتغيير الوسائط كل 48-72 ساعة بإضافة 500-2000 ميكرولتر من وسائط زراعة الثرب الطازجة. لا تقم بسحب الوسائط مباشرة فوق أنسجة الثرب ، لأن هذا قد يحل محل الخلايا السرطانية. لاحظ أنه إذا تحول لون الوسائط إلى اللون الأصفر ، فقم بتغيير الوسائط. ملاحظة: يعتمد تواتر تغيير الوسائط على حجم الوسائط المستخدمة ومسار نمو الخلايا السرطانية. بمجرد أن تزرع الخلايا السرطانية الثرب ، لم يعد من المهم ما إذا كانت قطعة الثرب عائمة أم لا.</li>
	<li>اختياري: إذا تم استخدام مصفوفة غشاء القاعدية ، عادة إذابة المصفوفة بحلول وقت تغيير الوسائط الأول.</li>
	<li>مراقبة نمو أورام سرطان المبيض باستخدام التصوير بالفلورسنت. تواتر التصوير هو حسب تقدير المحقق. توقع وجود أورام صغيرة بحوالي 14 يوما (الشكل 3A-C). قد تختلف النتائج حسب جودة الحقن.</li>
	<li>قم بإنهاء التجربة استنادا إلى نقطة نهاية التجربة. ملاحظة: لوحظ نمو الورم وسلامة أنسجة الثرب بعد 50 يوما.</li>
</ol>

إنشاء نموذج 3D Ex Vivo للتفاعل بين سرطان المبيض والثرب

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).</li><li>Berek, J. S., Renz, M., Kehoe, S., Kumar, L., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+of+the+ovary,+fallopian+tube,+and+peritoneum:+2021+update.">Cancer of the ovary, fallopian tube, and peritoneum: 2021 update.</a> Int J Gynaecol Obstet. 155 (Suppl 1), 61-85 (2021).</li><li>Ledermann, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+diagnosed+and+relapsed+epithelial+ovarian+carcinoma:+ESMO+clinical+practice+guidelines+for+diagnosis,+treatment+and+follow-up.">Newly diagnosed and relapsed epithelial ovarian carcinoma: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Ann Oncol. 24 (Suppl 6), vi24-32 (2013).</li><li>Jelovac, D., Armstrong, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+diagnosis+and+treatment+of+ovarian+cancer.">Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer.</a> CA Cancer J Clin. 61 (3), 183-203 (2011).</li><li>Morgan, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer.+Clinical+practice+guidelines+in+oncology.">Ovarian cancer. Clinical practice guidelines in oncology.</a> J Natl Compr Canc Netw. 6 (8), 766-794 (2008).</li><li>Nieman, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocytes+promote+ovarian+cancer+metastasis+and+provide+energy+for+rapid+tumor+growth.">Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth.</a> Nat Med. 17 (11), 1498-1503 (2011).</li><li>Motohara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolving+story+of+the+metastatic+voyage+of+ovarian+cancer+cells:+cellular+and+molecular+orchestration+of+the+adipose-rich+metastatic+microenvironment.">An evolving story of the metastatic voyage of ovarian cancer cells: cellular and molecular orchestration of the adipose-rich metastatic microenvironment.</a> Oncogene. 38 (16), 2885-2898 (2019).</li><li>Di Nicola, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omentum+a+powerful+biological+source+in+regenerative+surgery.">Omentum a powerful biological source in regenerative surgery.</a> Regen Ther. 11, 182-191 (2019).</li><li>Meza-Perez, S., Randall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+functions+of+the+omentum.">Immunological functions of the omentum.</a> Trends Immunol. 38 (7), 526-536 (2017).</li><li>Liu, M., Silva-Sanchez, A., Randall, T. D., Meza-Perez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+immune+responses+in+the+peritoneal+cavity+and+omentum.">Specialized immune responses in the peritoneal cavity and omentum.</a> J Leukoc Biol. 109 (4), 717-729 (2021).</li><li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+facilitate+ovarian+cancer+premetastatic+niche+formation+in+the+omentum.">Neutrophils facilitate ovarian cancer premetastatic niche formation in the omentum.</a> J Exp Med. 216 (1), 176-194 (2019).</li><li>Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+microenvironment+promotes+Bclxl+expression+and+confers+chemoresistance+in+ovarian+cancer+cells.">Adipocyte microenvironment promotes Bclxl expression and confers chemoresistance in ovarian cancer cells.</a> Apoptosis. 22 (4), 558-569 (2017).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+adipocytes:+key+players+in+breast+cancer+progression.">Cancer-associated adipocytes: key players in breast cancer progression.</a> J Hematol Oncol. 12 (1), 95 (2019).</li><li>Zhang, Z., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue:+The+dysfunctional+adipocyte+-+a+cancer+cell's+best+friend.">Adipose tissue: The dysfunctional adipocyte - a cancer cell's best friend.</a> Nat Rev Endocrinol. 14 (3), 132-134 (2018).</li><li>Alvero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRX-E-002-1+Induces+c-Jun-dependent+apoptosis+in+ovarian+cancer+stem+cells+and+prevents+recurrence+in+vivo.">TRX-E-002-1 Induces c-Jun-dependent apoptosis in ovarian cancer stem cells and prevents recurrence in vivo.</a> Mol Cancer Ther. 15 (6), 1279-1290 (2016).</li><li>Alvero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+for+the+detection+of+intraperitoneal+micrometastasis+using+an+ovarian+cancer+mouse+model.">Novel approach for the detection of intraperitoneal micrometastasis using an ovarian cancer mouse model.</a> Sci Rep. 7, 40989 (2017).</li><li>Craveiro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+modifications+in+ovarian+cancer+stem+cells+following+Paclitaxel+treatment.">Phenotypic modifications in ovarian cancer stem cells following Paclitaxel treatment.</a> Cancer Med. 2 (6), 751-762 (2013).</li><li>Sumi, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+for+non-invasive+imaging+to+detect+and+monitor+ovarian+cancer+recurrence.">Murine model for non-invasive imaging to detect and monitor ovarian cancer recurrence.</a> J Vis Exp. (93), e51815 (2014).</li><li>Agarwal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+migration+inhibitory+factor+expression+in+ovarian+cancer.">Macrophage migration inhibitory factor expression in ovarian cancer.</a> Am J Obstet Gynecol. 196 (4), 348.e1-348.e5 (2007).</li><li>Kelly, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-4+signaling+promotes+tumor+growth+and+paclitaxel+chemoresistance+in+ovarian+cancer.">TLR-4 signaling promotes tumor growth and paclitaxel chemoresistance in ovarian cancer.</a> Cancer Res. 66 (7), 3859-3868 (2006).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBX7+binds+the+E-box+to+inhibit+TWIST-1+function+and+inhibit+tumorigenicity+and+metastatic+potential.">CBX7 binds the E-box to inhibit TWIST-1 function and inhibit tumorigenicity and metastatic potential.</a> Oncogene. 39 (20), 3965-3979 (2020).</li><li>Tedja, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+epithelial-mesenchymal+hybrid+cancer+cells+with+tumorigenic+potential.">Generation of stable epithelial-mesenchymal hybrid cancer cells with tumorigenic potential.</a> Cancers (Basel). 15 (3), 15030684 (2023).</li><li>Dauleh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+cultured+mesothelial+cells+derived+from+the+murine+adult+omentum.">Characterisation of cultured mesothelial cells derived from the murine adult omentum.</a> PLoS One. 11 (7), e0158997 (2016).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

باستخدام هذا البروتوكول ، تم تطوير نموذج قبل السريري لسرطان الصفاق لسرطان المبيض باستخدام مزيج من التقنيات الأساسية في المختبر وخارج الجسم الحي. لوحظ نمو تدريجي للورم على مدار 50 يوما من الثقافة المشتركة بعد بذر عينات الثرب بخلايا سرطان المبيض البشري mCherry + OCSC1-F2. تم تطوير هذه الطر...

سرطان المبيض هو أكثر الأورام الخبيثة النسائية فتكا في جميع أنحاء العالم1. يبلغ خطر الإصابة بهذا السرطان مدى الحياة حوالي 1 من كل 70 ، مع متوسط عمر التشخيص عند 63 عاما2. تصنف أورام المبيض الخبيثة الأولية نسيجيا على أنها إما ظهارية أو غير ظهارية. تمثل سرطانات المبيض الظهارية (EOC) أكثر من 90٪ من الأورام ، والنوع الفرعي الأكثر شيوعا هو السرطان المصلي عالي الدرجة (HGSC) ، والذي يمثل حوالي 70٪ -80٪ من EOCs. حاليا ، لا توجد طرق فحص فعالة للكشف عن المرض مبكرا. لذلك يتم تشخيص معظم المرضى في مرحلة متقدمة (أي الاتحاد الدولي لأمراض النساء والتوليد [FIGO] المرحلة الثالثة أو الرابعة) بعد انتشار السرطان في جميع أنحاء التجويف البريتوني2.
العلاج القياسي في الخطوط الأمامية هو الجراحة الخلوية لإزالة جميع الأمراض العيانية المرئية ، يليها العلاج الكيميائي المساعد القائم على البلاتين لتدمير أي مرض مجهري متبقي. في حين كان هناك العديد من التطورات في علاج سرطان المبيض على مدى العقدين الماضيين ، فإن ما يقرب من 70 ٪ من المرضى الذين يعانون من مرض متقدم سوف ينتكسون في غضون 3 سنوات من العلاج3. بالنظر إلى التشخيص السيئ العام لهؤلاء المرضى ، تهدف الجهود البحثية الانتقالية الجارية والمستقبلية في EOC إلى تحديد المؤشرات الحيوية للكشف المبكر ، ومنع ورم خبيث ، وتحسين العلاجات الحالية لتجنب المقاومة وتطوير علاجات شخصية جديدة للسرطان.
ورم خبيث معمم داخل التجويف البريتوني والمقاومة الكيميائية المرتبطة به هما من القيود الرئيسية لتحسين علاج المرضى الذين يعانون من سرطان المبيض 4,5. الثرب ، وهو هيكل يشبه المريلة الدهنية يتدلى من المعدة فوق الأمعاء ، هو الموقع الرئيسي لورم خبيث لسرطان المبيض 6,7. بالإضافة إلى وظيفته كحاجز مادي ، فقد ثبت أن الثرب له قدرات متجددة وعائية ويمتلك أنشطة مناعية ، والتي تعزز معا الأوعية الدموية ، وتسريع التئام الجروح ، والحد من العدوى8. يحتوي على تركيز عال من الخلايا الجذعية التي يمكن أن تتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا ويمكن أن تساعد في إصلاح الأنسجة التالفة. يمكن أن يلتهب الثرب استجابة للإصابة أو العدوى ، مما يؤدي إلى هجرة الخلايا المناعية إلى موقع الإصابة9. تطلق هذه الخلايا المناعية عوامل النمو والجزيئات الأخرى التي تساعد على تعزيز إصلاح وتجديد الأنسجة التالفة. الخلايا المناعية ، مثل الضامة والخلايا الليمفاوية وخلايا البلازما ، المترجمة في الثرب هي هياكل تعرف باسم "البقع اللبنية" ، وهي المسؤولة عن اكتشاف مسببات الأمراض ومهاجمتها وتنظيم المناعة البريتونية. كما ثبت أن الثرب يلعب دورا في تحفيز التحمل المناعي10 ، وهو قدرة الجهاز المناعي على تحمل المستضدات الذاتية وعدم مهاجمة الأنسجة السليمة. ومع ذلك ، فإن نفس الأنشطة المتعلقة بالمناعة تشارك أيضا في الاستجابات المرضية ، مثل نمو الأورام الأذنية ، ورم خبيث ، والهروب من المراقبة المناعية 9,11. أظهرت الدراسات السابقة من مختبرنا وغيره دورا فريدا ونشطا للبيئة المكروية الدهنية في تثبيط الاستجابات المناعية المضادة للأورام وفي اكتساب المقاومة الكيميائية12،13،14. لسوء الحظ ، لدينا معلومات محدودة عن الآليات الخلوية والجزيئية التي يوفر بها الثرب بيئة دقيقة مؤيدة للورم.
لفهم التفاعلات بين الخلايا السرطانية والثرب بشكل أفضل ، تم تطوير نظام ثقافة 3D يتكون من خلايا سرطان المبيض البشري ونباتات الثرب المشتقة من المريض. يمثل البروتوكول الموصوف هنا نموذجا جديدا خارج الجسم الحي للسرطان البريتوني. يحاكي هذا النموذج التطور الطبيعي لتكوين أورام سرطان المبيض في هذا النسيج الغني بالدهون. النموذج المقترح سهل التوليد وغير مكلف ويحتمل أن يكون قابلا للتطبيق على التحقيقات الانتقالية في أبحاث سرطان المبيض.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>329652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipets</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229010B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 Tissue Culture Flask</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Counter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9819000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 imager</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1043028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel</td>
			<td>Integra-Miltex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revolve microscope</td>
			<td>Echo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo model of ovarian cancer peritoneal metastasis using human omentum

سرطان المبيض هو أكثر الأورام الخبيثة النسائية فتكا. يلعب الثرب دورا رئيسيا في توفير بيئة دقيقة داعمة لخلايا سرطان المبيض النقيلي بالإضافة إلى الإشارات المعدلة المناعية التي تسمح بتحمل الورم. ومع ذلك ، لدينا نماذج محدودة تحاكي عن كثب التفاعل بين خلايا سرطان المبيض والأنسجة الغنية بالدهون. لمزيد من الفهم للآليات الخلوية والجزيئية التي يوفر بها الثرب بيئة دقيقة مؤيدة للورم ، قمنا بتطوير نموذج 3D ex vivo فريد من نوعه للتفاعل بين الخلايا السرطانية والثرب. باستخدام الثرب البشري ، نحن قادرون على زراعة خلايا سرطان المبيض داخل هذه البيئة المكروية الغنية بالدهون ومراقبة العوامل المسؤولة عن نمو الورم وتنظيم المناعة. بالإضافة إلى توفير منصة لدراسة هذه البيئة المكروية الغنية بالورم الدهني ، يوفر النموذج منصة ممتازة لتطوير وتقييم مناهج علاجية جديدة لاستهداف الخلايا السرطانية النقيلي في هذا المجال. النموذج المقترح سهل الإنشاء وغير مكلف وقابل للتطبيق على التحقيقات الانتقالية.

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy worldwide1. The lifetime risk of developing this cancer is approximately 1 in 70, with the median age of diagnosis at 63 years old2. Primary ovarian malignancies are classified histologically as either epithelial or non-epithelial. Epithelial ovarian cancers (EOC) represent over 90% of tumors, and the most common subtype is high-grade serous carcinoma (HGSC), which accounts for approximately 70%-80% of EOCs. Currently, there are no effective screening methods to detect disease early. So most patients are diagnosed at an advanced stage (i.e., F&#233;d&#233;ration Internationale de Gyn&#233;cologie et d&#39;Obst&#233;trique [FIGO] stage III or IV) after the cancer has spread throughout the peritoneal cavity2.
Standard frontline treatment is cytoreductive surgery to remove all visible macroscopic disease, followed by adjuvant platinum-based chemotherapy to destroy any residual microscopic disease. While there have been many advances in ovarian cancer treatment over the last two decades, approximately 70% of patients with advanced disease will relapse within 3 years of treatment3. Given the overall poor prognosis of these patients, ongoing and future translational research efforts in EOC aim to identify biomarkers for early detection, prevent metastasis, improve current therapies to evade resistance and develop new personalized cancer treatments.
Generalized metastasis within the peritoneal cavity and its associated chemoresistance are two of the major limitations for the improvement of the treatment of patients with ovarian cancer4,5. The omentum, a fatty apron-like structure that hangs down from the stomach over the intestines, is a main site of ovarian cancer metastasis6,7. In addition to its function as a physical barrier, the omentum has been shown to have regenerative and angiogenic capacities and possess immune activities, which together promote vascularization, accelerate wound healing, and limit infection8. It contains a high concentration of stem cells that can differentiate into various cell types and can help repair damaged tissues. The omentum can become inflamed in response to injury or infection, which triggers the migration of immune cells to the site of injury9. These immune cells release growth factors and other molecules that help to promote the repair and regeneration of damaged tissue. Immune cells, such as macrophages, lymphocytes, and plasma cells, localized in the omentum are structures known as &#34;milky spots&#34;, which are responsible for detecting and attacking pathogens and regulating peritoneal immunity. The omentum has also been shown to play a role in inducing immune tolerance10, which is the ability of the immune system to tolerate self-antigens and not attack healthy tissues. However, the same immune-related activities are also involved in pathological responses, such as the growth of omental tumors, metastasis, and escape of immune surveillance9,11. Previous studies from our lab and others have demonstrated a unique and active role of the adipose microenvironment in the inhibition of anti-tumoral immune responses and in the acquisition of chemoresistance12,13,14. Unfortunately, we have limited information on the cellular and molecular mechanisms by which the omentum provides a pro-tumoral microenvironment.
To better understand the interactions between cancer cells and the omentum, a 3D culture system consisting of human ovarian cancer cells and patient-derived omentum explants was developed. The protocol described here represents a novel ex vivo model of peritoneal carcinomatosis. This model mimics the natural progression of ovarian cancer tumorigenesis in this adipose-rich tissue. The proposed model is easy to generate, inexpensive, and potentially applicable to translational investigations in ovarian cancer research.

تسليط الضوء على المؤلف: نموذج متقدم خارج الجسم الحي للتحقيق في تفاعل البيئة المكروية للسرطان والدهون 

نموذج خارج الجسم الحي للورم الخبيث البريتوني لسرطان المبيض باستخدام الثرب البشري

Current studies use co-culture systems comprised of isolated adipocytes and ovarian cancer cells. These adipocytes are differentiated in vitro from pre adipocytes. These cells are then separated through a transwell insert and therefore lack direct cell to cell contact.This ex vivo culture method offers a model to study the direct interaction of cancer cells with the adipose microenvironment. Our model preserves the structure of the human momentum and therefore maintains the various cell types that are typically in this organ. In addition to adipocytes, these cells include supporting fibroblasts as well as immune cells.This model also maintains these cells in their inherent matrix. This model provides an excellent platform for the development and evaluation of novel therapeutic approaches to target metastatic cancer cells in this niche.

كان التأسيس الناجح لخلايا سرطان المبيض في عينات الثرب واضحا بحلول اليوم 14 تقريبا (الشكل 3A-C). تم تحضير ما لا يقل عن 24 نسخة مكررة وحقنها لكل عينة تم جمعها للسماح بإجراء مزيد من التجارب. تمت مراقبة نمو الورم عن طريق التقاط صور الفلورسنت (الشكل 3D</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Advanced Ex Vivo Model for Investigating Cancer-Adipose Microenvironment Interaction at JoVE.com

يصف هذا البروتوكول إنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد (3D) خارج الجسم الحي للتفاعل بين الخلايا السرطانية والثرب. يوفر النموذج منصة لتوضيح الآليات المؤيدة للورم داخل المكانة الدهنية ولاختبار العلاجات الجديدة.

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian ...

تستخدم الدراسات الحالية أنظمة الاستزراع المشترك التي تتكون من الخلايا الشحمية المعزولة وخلايا سرطان المبيض. يتم تمييز هذه الخلايا الشحمية في المختبر عن الخلايا الشحمية السابقة. ثم يتم فصل هذه الخلايا من خلال إدخال transwell وبالتالي تفتقر إلى الاتصال المباشر من خلية إلى خلية.تقدم طريقة الاستزراع خارج الجسم الحي نموذجا لدراسة التفاعل المباشر للخلايا السرطانية مع البيئة المكروية الدهنية. يحافظ نموذجنا على بنية كمية الحركة البشرية؛ ومن ثم يحافظ على أنواع الخلايا المختلفة الموجودة عادة في هذا العضو. بالإضافة إلى الخلايا الشحمية ، تشمل هذه الخلايا الخلايا الليفية الداعمة وكذلك الخلايا المناعية.يحافظ هذا النموذج أيضا على هذه الخلايا في مصفوفتها المتأصلة. يوفر هذا النموذج منصة ممتازة لتطوير وتقييم مناهج علاجية جديدة لاستهداف الخلايا السرطانية النقيلي في هذا المجال.

an-ex-vivo-model-ovarian-cancer-peritoneal-metastasis-using-human

Research

JoVE Journal

Cancer Research

An Ex Vivo Model of Ovarian Cancer Peritoneal Metastasis Using Human Omentum

1.6K Views.  Karmanos Cancer Institute. تستخدم الدراسات الحالية أنظمة الاستزراع المشترك التي تتكون من الخلايا الشحمية المعزولة وخلايا سرطان المبيض. يتم تمييز هذه الخلايا الشحمية في المختبر عن الخلايا الشحمية السابقة. ثم يتم فصل هذه الخلايا من خلال إدخال transwell وبالتالي تفتقر إلى الاتصال المباشر من خلية إلى خلية....

Video: تسليط الضوء على المؤلف: نموذج متقدم خارج الجسم الحي للتحقيق في تفاعل البيئة المكروية للسرطان والدهون 

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian cancer cells as well as immune modulatory signals that allow tumor tolerance. However, we have limited models that closely mimic the interaction between ovarian cancer cells and adipose-rich tissues. To further understand the cellular and molecular mechanisms by which the omentum provides a pro-tumoral microenvironment, we developed a unique 3D ex vivo model of cancer cell-omentum interaction. Using human omentum, we are able to grow ovarian cancer cells within this adipose-rich microenvironment and monitor the factors responsible for tumor growth and immune regulation. In addition to providing a platform for the study of this adipose-rich tumor microenvironment, the model provides an excellent platform for the development and evaluation of novel therapeutic approaches to target metastatic cancer cells in this niche. The proposed model is easy to generate, inexpensive, and applicable to translational investigations.

This protocol describes the establishment of a three-dimensional (3D) ex vivo model of cancer cell-omentum interaction. The model provides a platform for elucidating pro-tumor mechanisms within the adipose niche and for testing novel therapies.