O presente estudo é financiado em parte pela The Janet Burros Memorial Foundation. Agradecemos às pacientes e ao Departamento de Oncologia Ginecológica do Instituto do Câncer Karmanos pela coleta das amostras de omento. Também agradecemos ao Biobank e ao Correlative Sciences Core do Karmanos Cancer Institute pela coordenação do recrutamento de pacientes e preparação de lâminas de patologia. O Biobank and Correlative Sciences Core é apoiado em parte pela concessão P30 do NIH Center CA22453 ao Karmanos Cancer Institute da Wayne State University.

O seguinte protocolo de pesquisa foi revisado e aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional (IRB) da Wayne State University. Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido antes da cirurgia. A Figura 1 ilustra as três etapas gerais desse protocolo.
1. Preparação do tecido do omento humano
<ol><li>Preparar meios de cultura de omento (DMEM/F12 + 10% de soro fetal bovino + 1% de penicilina-estreptomicina) e armazenar a 4 °C. Alíquota 30-40 mL deste meio em um tubo cônico estéril de 50 mL ou recipiente de amostra cirúrgica.</li>
	<li>Obter espécimes cirúrgicos de biópsia omental ou cirurgia de omentectomia. Imergir o espécime estéril em meio de cultura de omento imediatamente após a remoção na sala de cirurgia. Se o fluxo de trabalho não permitir isso, coloque o espécime em meio de cultura de omento o mais rápido possível. Transferir a amostra colocando-a no gelo e conservar a 4 °C até ao processamento. NOTA: O tamanho da amostra de omento removida determinará a quantidade de tecido trabalhável.</li>
	<li>Processar o espécime de omento dentro de 1-2 h após a coleta usando uma capela de fluxo laminar. Certifique-se de que todos os materiais e ferramentas estejam estéreis ou esterilizados.</li>
	<li>Retire o omento do recipiente de coleta e transfira-o para uma placa de cultura de 100 mm. Mergulhe a amostra em solução salina tamponada com fosfato 1x (1x PBS) e lave suavemente a amostra para remover quaisquer coágulos sanguíneos ou detritos.</li>
	<li>Cortar o tecido em pedaços (0,5 cm x 0,5 cm ou 100-200 mg; Figura 2A) usando uma pequena tesoura cirúrgica ou um bisturi de 10-15 mm. Use pinças cirúrgicas pequenas para ajudar a manipular o tecido e evitar esmagar o omento. Se um dispositivo de energia foi usado para remover cirurgicamente o espécime de omento, evite usar o tecido distorcido na borda selada.</li>
	<li>Colocar cada pedaço de omento cortado em poços individuais de uma placa de cultura de 24 poços e encher os poços com 500 μL de meio de cultura de omento ou até um volume suficiente para cobrir o omento sem permitir que a peça de omento flutue acima do piso do poço (Figura 2B).</li>
	<li>Conservar pedaços de omento em meios de cultura frescos a 4 °C até estar pronto para a injeção.</li>
</ol>2. Preparação de células cancerosas do ovário
<ol><li>Cultivar células humanas de câncer de ovário em frasco de 75cm2 a 37 °C e 5% de CO2 com pelo menos 75% de confluência até o dia da coleta do omento. NOTA: Este protocolo utiliza células de câncer de ovário humano OCSC1-F2 mCherry-positivas previamente descritas15,16,17,18. Ele pode ser modificado para qualquer linha de células cancerosas marcadas com um sinal de fluorescência.</li>
	<li>Preparar as células dentro de uma capela de fluxo laminar imediatamente após a coleta do espécime de omento. Certifique-se de que todos os materiais e ferramentas estejam estéreis ou esterilizados.</li>
	<li>Adicionar 10 mL de PBS estéril 1x ao frasco de cultura e lavar as células balançando suavemente o frasco. Remover o PBS 1x e, em seguida, adicionar 3 mL de tripsina-EDTA a 0,05%.</li>
	<li>Agitar suavemente o balão de cultura para revestir todas as células e, em seguida, colocar o balão numa incubadora (37 °C e 5% CO2) durante um período máximo de 5 minutos. Tocar o frasco de cultura para separar completamente as células e, em seguida, neutralizar a tripsina adicionando 3 mL de meio de cultura de omento.</li>
	<li>Misturar a suspensão celular por pipetagem e, em seguida, transferir a suspensão para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar a suspensão por 5 min a 1.200 x g a 24 °C. Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em 6 mL de meio de cultura de omento fresco.</li>
	<li>Conte as células usando um hemacitômetro. Diluir a suspensão celular em pelo menos 100.000 células por 100-200 μL de suspensão. Este é o volume de injeção em cada pedaço cortado de omento.</li>
	<li>Transferir um número adequado de células para um novo frasco de cultura para continuar a passagem celular.</li>
</ol>3. Injeção de células cancerosas do ovário
<ol><li>Use uma seringa de 1 mL para retirar a suspensão celular e, em seguida, conecte uma agulha de 26 G. Não desenhe a suspensão celular usando a agulha, pois isso pode fragmentar as células.</li>
	<li>Use pinças cirúrgicas pequenas para pegar um pedaço de omento cortado. Transfira o omento para uma placa estéril de trabalho separada para facilitar a injeção. Perfurar suavemente o omento com a ponta da agulha e injetar um pequeno volume de suspensão celular no tecido (Figura 2C).</li>
	<li>Repetir a injeção em várias áreas do omento até um volume total de pelo menos 100 μL ou 100.000 células. Observe que grande parte da suspensão celular pode parecer se acumular ao redor do espécime. Se houver preocupação com a qualidade da injeção, repita a injeção ou injete um volume maior de suspensão celular na amostra.</li>
	<li>Devolva as amostras de omento injetadas em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços. Observe que o volume do meio de cultura de omento é de um nível que cobre o omento sem deixá-lo flutuar. Manuseie cuidadosamente a placa e coloque-a dentro de uma incubadora (37 °C e 5% CO2).</li>
	<li>OPCIONAL: Use Matrigel (matriz de membrana basal) para suspender o tecido do omento em uma matriz sólida para permitir uma injeção mais fácil e uma entrega de suspensão celular mais concentrada.<ol><li>Descongelar a matriz da membrana basal a 4 °C e misturar na proporção de 1:1 com meios de cultura de omento imediatamente antes da utilização. Conservar a mistura da matriz da membrana basal em gelo ou a 4 °C até à injeção. Encha poços vazios com mistura de matriz de membrana basal suficiente para imergir um pedaço cortado de omento.</li>
		<li>Coloque os espécimes na mistura da matriz da membrana basal e, em seguida, coloque a placa de cultura de 24 poços em uma incubadora (37 °C e 5% CO2) por 20 min. Uma vez que a mistura tenha solidificado, continue com a injeção como descrito acima.</li>
	</ol></li>
	<li>Confirme a injeção bem-sucedida usando imagens fluorescentes. Certifique-se de que uma faixa de sinal fluorescente seja visualizada nos locais de injeção (Figura 2D). Note que o número real de células ligadas ao omento após a injeção é imprevisível.</li>
</ol>4. Co-cultura de células cancerosas do omento humano e do ovário
<ol><li>Troque os meios a cada 48-72 h adicionando 500-2000 μL de meios de cultura frescos de omento. Não pipetar o meio diretamente sobre o tecido do omento, pois isso pode deslocar as células cancerosas. Observe que, se a cor da mídia ficar amarela, altere a mídia. NOTA: A frequência de mudança de mídia dependerá do volume de mídia usada e da trajetória de crescimento de células cancerosas. Uma vez que as células cancerosas tenham semeado o omento, se o pedaço de omento está ou não flutuando não é mais importante.</li>
	<li>OPCIONAL: Se uma matriz de membrana basal fosse usada, a matriz normalmente seria dissolvida no momento da primeira troca de meio.</li>
	<li>Monitorar o crescimento de tumores de câncer de ovário usando imagens fluorescentes. A frequência das imagens fica a critério do investigador. Antecipar a evidência de tumores pequenos em cerca de 14 dias (Figura 3A-C). Os resultados podem variar dependendo da qualidade da injeção.</li>
	<li>Encerre o experimento com base no ponto de extremidade do experimento. NOTA: O crescimento tumoral e a integridade do tecido omento foram observados nos últimos 50 dias.</li>
</ol>

Estabelecendo um modelo 3D ex vivo para interação câncer de ovário-omento

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).</li><li>Berek, J. S., Renz, M., Kehoe, S., Kumar, L., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+of+the+ovary,+fallopian+tube,+and+peritoneum:+2021+update.">Cancer of the ovary, fallopian tube, and peritoneum: 2021 update.</a> Int J Gynaecol Obstet. 155 (Suppl 1), 61-85 (2021).</li><li>Ledermann, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+diagnosed+and+relapsed+epithelial+ovarian+carcinoma:+ESMO+clinical+practice+guidelines+for+diagnosis,+treatment+and+follow-up.">Newly diagnosed and relapsed epithelial ovarian carcinoma: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Ann Oncol. 24 (Suppl 6), vi24-32 (2013).</li><li>Jelovac, D., Armstrong, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+diagnosis+and+treatment+of+ovarian+cancer.">Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer.</a> CA Cancer J Clin. 61 (3), 183-203 (2011).</li><li>Morgan, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer.+Clinical+practice+guidelines+in+oncology.">Ovarian cancer. Clinical practice guidelines in oncology.</a> J Natl Compr Canc Netw. 6 (8), 766-794 (2008).</li><li>Nieman, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocytes+promote+ovarian+cancer+metastasis+and+provide+energy+for+rapid+tumor+growth.">Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth.</a> Nat Med. 17 (11), 1498-1503 (2011).</li><li>Motohara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolving+story+of+the+metastatic+voyage+of+ovarian+cancer+cells:+cellular+and+molecular+orchestration+of+the+adipose-rich+metastatic+microenvironment.">An evolving story of the metastatic voyage of ovarian cancer cells: cellular and molecular orchestration of the adipose-rich metastatic microenvironment.</a> Oncogene. 38 (16), 2885-2898 (2019).</li><li>Di Nicola, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omentum+a+powerful+biological+source+in+regenerative+surgery.">Omentum a powerful biological source in regenerative surgery.</a> Regen Ther. 11, 182-191 (2019).</li><li>Meza-Perez, S., Randall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+functions+of+the+omentum.">Immunological functions of the omentum.</a> Trends Immunol. 38 (7), 526-536 (2017).</li><li>Liu, M., Silva-Sanchez, A., Randall, T. D., Meza-Perez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+immune+responses+in+the+peritoneal+cavity+and+omentum.">Specialized immune responses in the peritoneal cavity and omentum.</a> J Leukoc Biol. 109 (4), 717-729 (2021).</li><li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+facilitate+ovarian+cancer+premetastatic+niche+formation+in+the+omentum.">Neutrophils facilitate ovarian cancer premetastatic niche formation in the omentum.</a> J Exp Med. 216 (1), 176-194 (2019).</li><li>Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+microenvironment+promotes+Bclxl+expression+and+confers+chemoresistance+in+ovarian+cancer+cells.">Adipocyte microenvironment promotes Bclxl expression and confers chemoresistance in ovarian cancer cells.</a> Apoptosis. 22 (4), 558-569 (2017).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+adipocytes:+key+players+in+breast+cancer+progression.">Cancer-associated adipocytes: key players in breast cancer progression.</a> J Hematol Oncol. 12 (1), 95 (2019).</li><li>Zhang, Z., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue:+The+dysfunctional+adipocyte+-+a+cancer+cell's+best+friend.">Adipose tissue: The dysfunctional adipocyte - a cancer cell's best friend.</a> Nat Rev Endocrinol. 14 (3), 132-134 (2018).</li><li>Alvero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRX-E-002-1+Induces+c-Jun-dependent+apoptosis+in+ovarian+cancer+stem+cells+and+prevents+recurrence+in+vivo.">TRX-E-002-1 Induces c-Jun-dependent apoptosis in ovarian cancer stem cells and prevents recurrence in vivo.</a> Mol Cancer Ther. 15 (6), 1279-1290 (2016).</li><li>Alvero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+for+the+detection+of+intraperitoneal+micrometastasis+using+an+ovarian+cancer+mouse+model.">Novel approach for the detection of intraperitoneal micrometastasis using an ovarian cancer mouse model.</a> Sci Rep. 7, 40989 (2017).</li><li>Craveiro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+modifications+in+ovarian+cancer+stem+cells+following+Paclitaxel+treatment.">Phenotypic modifications in ovarian cancer stem cells following Paclitaxel treatment.</a> Cancer Med. 2 (6), 751-762 (2013).</li><li>Sumi, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+for+non-invasive+imaging+to+detect+and+monitor+ovarian+cancer+recurrence.">Murine model for non-invasive imaging to detect and monitor ovarian cancer recurrence.</a> J Vis Exp. (93), e51815 (2014).</li><li>Agarwal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+migration+inhibitory+factor+expression+in+ovarian+cancer.">Macrophage migration inhibitory factor expression in ovarian cancer.</a> Am J Obstet Gynecol. 196 (4), 348.e1-348.e5 (2007).</li><li>Kelly, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-4+signaling+promotes+tumor+growth+and+paclitaxel+chemoresistance+in+ovarian+cancer.">TLR-4 signaling promotes tumor growth and paclitaxel chemoresistance in ovarian cancer.</a> Cancer Res. 66 (7), 3859-3868 (2006).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBX7+binds+the+E-box+to+inhibit+TWIST-1+function+and+inhibit+tumorigenicity+and+metastatic+potential.">CBX7 binds the E-box to inhibit TWIST-1 function and inhibit tumorigenicity and metastatic potential.</a> Oncogene. 39 (20), 3965-3979 (2020).</li><li>Tedja, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+epithelial-mesenchymal+hybrid+cancer+cells+with+tumorigenic+potential.">Generation of stable epithelial-mesenchymal hybrid cancer cells with tumorigenic potential.</a> Cancers (Basel). 15 (3), 15030684 (2023).</li><li>Dauleh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+cultured+mesothelial+cells+derived+from+the+murine+adult+omentum.">Characterisation of cultured mesothelial cells derived from the murine adult omentum.</a> PLoS One. 11 (7), e0158997 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Usando este protocolo, um modelo pré-clínico de carcinomatose peritoneal para câncer de ovário foi desenvolvido usando uma combinação de técnicas básicas in vitro e ex vivo. Um crescimento tumoral progressivo foi observado ao longo de 50 dias de co-cultivo após semeadura de espécimes de omento com células de câncer de ovário humano mCherry+ OCSC1-F2. Este método foi desenvolvido e otimizado em vários ensaios experimentais usando diferentes espécimes de omento. O sucesso do crescimento do...

O câncer de ovário é a neoplasia maligna ginecológica mais letal domundo1. O risco ao longo da vida de desenvolver esse câncer é de aproximadamente 1 em 70, com mediana de idade de diagnóstico de 63 anos2. Neoplasias ovarianas primárias são classificadas histologicamente como epiteliais ou não epiteliais. Os cânceres epiteliais de ovário (EOC) representam mais de 90% dos tumores, e o subtipo mais comum é o carcinoma seroso de alto grau (HGSC), que responde por aproximadamente 70%-80% dos EOCs. Atualmente, não existem métodos de rastreamento eficazes para detectar a doença precocemente. Assim, a maioria dos pacientes é diagnosticada em estágio avançado (ou seja, estádio III ou IV da Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique [FIGO]) após o câncer se espalhar por toda a cavidade peritoneal2.
O tratamento padrão na linha de frente é a cirurgia citorredutora para remover toda a doença macroscópica visível, seguida de quimioterapia adjuvante à base de platina para destruir qualquer doença microscópica residual. Embora tenha havido muitos avanços no tratamento do câncer de ovário nas últimas duas décadas, aproximadamente 70% das pacientes com doença avançada terão recidiva dentro de 3 anos detratamento3. Dado o mau prognóstico geral desses pacientes, os esforços de pesquisa translacional em andamento e futuros no EOC visam identificar biomarcadores para detecção precoce, prevenir metástases, melhorar as terapias atuais para evitar a resistência e desenvolver novos tratamentos personalizados contra o câncer.
Metástases generalizadas dentro da cavidade peritoneal e sua quimiorresistência associada são duas das principais limitações para o aprimoramento do tratamento de pacientes com câncer deovário4,5. O omento, uma estrutura semelhante a um avental gorduroso que pende do estômago sobre os intestinos, é o principal sítio de metástase do câncer de ovário 6,7. Além de sua função como barreira física, o omento demonstrou ter capacidade regenerativa, angiogênica e possuir atividades imunológicas, que juntas promovem vascularização, aceleram a cicatrização de feridas e limitam a infecção8. Ele contém uma alta concentração de células-tronco que podem se diferenciar em vários tipos de células e podem ajudar a reparar tecidos danificados. O omento pode inflamar-se em resposta à lesão ou infecção, o que desencadeia a migração das células imunes para o local dalesão9. Essas células imunes liberam fatores de crescimento e outras moléculas que ajudam a promover o reparo e a regeneração do tecido danificado. As células imunes, como macrófagos, linfócitos e plasmócitos, localizadas no omento, são estruturas conhecidas como "manchas leitosas", responsáveis por detectar e atacar patógenos e regular a imunidade peritoneal. O omento também demonstrou desempenhar um papel na indução de tolerância imunológica10, que é a capacidade do sistema imunológico de tolerar autoantígenos e não atacar tecidos saudáveis. No entanto, as mesmas atividades imunológicas também estão envolvidas em respostas patológicas, como crescimento de tumores omentais, metástases e escape da vigilânciaimunológica9,11. Estudos prévios de nosso laboratório e de outros demonstraram um papel único e ativo do microambiente adiposo na inibição da resposta imune antitumoral e na aquisição de quimiorresistência12,13,14. Infelizmente, temos informações limitadas sobre os mecanismos celulares e moleculares pelos quais o omento fornece um microambiente pró-tumoral.
Para entender melhor as interações entre as células cancerosas e o omento, um sistema de cultura 3D consistindo de células cancerosas de ovário humano e explantes de omento derivados da paciente foi desenvolvido. O protocolo aqui descrito representa um novo modelo ex vivo de carcinomatose peritoneal. Este modelo mimetiza a progressão natural da tumorigênese do câncer de ovário neste tecido adiposo. O modelo proposto é fácil de gerar, barato e potencialmente aplicável a investigações translacionais na pesquisa do câncer de ovário.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>329652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipets</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229010B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 Tissue Culture Flask</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Counter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9819000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 imager</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1043028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel</td>
			<td>Integra-Miltex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revolve microscope</td>
			<td>Echo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo model of ovarian cancer peritoneal metastasis using human omentum

O câncer de ovário é a neoplasia ginecológica mais mortal. O omento desempenha um papel fundamental no fornecimento de um microambiente de suporte para células de câncer de ovário metastático, bem como sinais imunomodulatórios que permitem a tolerância tumoral. No entanto, temos modelos limitados que imitam de perto a interação entre células cancerosas do ovário e tecidos ricos em adiposo. Para entender melhor os mecanismos celulares e moleculares pelos quais o omento fornece um microambiente pró-tumoral, desenvolvemos um modelo 3D ex vivo único de interação célula-omento cancerígeno. Usando omento humano, somos capazes de cultivar células cancerosas de ovário dentro deste microambiente rico em adiposo e monitorar os fatores responsáveis pelo crescimento do tumor e regulação imunológica. Além de fornecer uma plataforma para o estudo deste microambiente tumoral rico em adiposo, o modelo fornece uma excelente plataforma para o desenvolvimento e avaliação de novas abordagens terapêuticas para atingir células cancerosas metastáticas neste nicho. O modelo proposto é de fácil geragem, barato e aplicável a investigações translacionais.

O estabelecimento bem-sucedido de células de câncer de ovário em espécimes de omento foi evidente por volta do 14º dia (Figura 3A-C). Pelo menos 24 repetições foram preparadas e injetadas por espécime coletado para permitir experimentação adicional. O crescimento tumoral foi monitorado por meio de imagens fluorescentes (Figura 3D,E). As imagens tiveram que ser cuidadosamente interpretadas como uma mono...

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Autor em destaque: Modelo ex vivo avançado para investigar a interação câncer-microambiente adiposo 

Este protocolo descreve o estabelecimento de um modelo tridimensional (3D) ex vivo de interação célula-omento canceroso. O modelo fornece uma plataforma para elucidar mecanismos pró-tumorais dentro do nicho adiposo e para testar novas terapias.

Modelo Ex Vivo de Metástase Peritoneal de Câncer de Ovário Utilizando Omento Humano

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian ...

Estudos atuais utilizam sistemas de co-cultura compostos por adipócitos isolados e células cancerosas de ovário. Esses adipócitos são diferenciados in vitro dos pré-adipócitos. Essas células são então separadas através de uma inserção de transwell e, portanto, não têm contato direto célula a célula.Este método de cultura ex vivo oferece um modelo para estudar a interação direta de células cancerosas com o microambiente adiposo. Nosso modelo preserva a estrutura do momento humano e, portanto, mantém os vários tipos de células que estão tipicamente neste órgão. Além dos adipócitos, essas células incluem fibroblastos de suporte, bem como células imunológicas.Esse modelo também mantém essas células em sua matriz inerente. Este modelo fornece uma excelente plataforma para o desenvolvimento e avaliação de novas abordagens terapêuticas para atingir células cancerosas metastáticas neste nicho.

an-ex-vivo-model-ovarian-cancer-peritoneal-metastasis-using-human

Research

JoVE Journal

Cancer Research

An Ex Vivo Model of Ovarian Cancer Peritoneal Metastasis Using Human Omentum

2.4K visualizações.  Karmanos Cancer Institute. Estudos atuais utilizam sistemas de co-cultura compostos por adipócitos isolados e células cancerosas de ovário. Esses adipócitos são diferenciados in vitro dos pré-adipócitos. Essas células são então separadas através de uma inserção de transwell e, portanto, não têm contato direto célula a célula.Este método de cultura ex vivo oferece um modelo para estudar a interação direta de células cancerosas com o microambiente adiposo. Nosso modelo preserva a estrutura do ...

Vídeo: Autor em destaque: Modelo ex vivo avançado para investigar a interação câncer-microambiente adiposo 

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is important to control peritoneal dissemination. However, it is still unclear how tumor cells detach from primary lesions and attach to the mesothelium. The establishment of an appropriate animal model is needed to gain an understanding of the mechanism of peritoneal dissemination in vivo. In the current study, we introduce the process from the local injection of EOC cells into the murine ovarian surface to the development of metastasis, including the peritoneum and distant organs. Female nude mice (BALB/c nu/nu) at 8 weeks of age were used. Under a microscopic field of view, EOC cells (1 x 105 cells/&#181;l of medium-extracellular matrix (ECM)-based hydrogel/unilateral ovary/mouse) were injected into murine ovaries through a retroperitoneal approach from the dorsal flank. This proposed method is a less invasive procedure for the mouse and minimizes damage to the ovary. Here, we describe the methodological steps in the development of the original and metastatic tumor formation of EOC.

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

To clarify the multistep process of peritoneal dissemination of ovarian carcinoma, the current study presents a murine experimental model of original tumor development and peritoneal metastasis via orthotopic inoculation with these tumor cells.

Murino Experimental Modelo de desenvolvimento do tumor original e Peritoneal Metástase<em&gt; via</em&gt; Ortotópico injetar células do ovário Carcinoma

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

Pesquisa do câncer

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm3. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.

No modelo in vivo para o ensaio do efeito de hipoxia em metástase tumoral

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Um modelo de injeção da veia porta para o Estudo do Fígado metástase do câncer de mama

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the tumor microenvironment and respond adequately to tumor antigens. The recent development of improved imaging approaches, such as 2-photon microscopy, and the use of powerful mouse tumor models have shed light on some of the mechanisms that regulate anti-tumor T cell activities. Whereas such systems have provided valuable insights, they do not always predict human responses. In human, our knowledge in the field mainly comes from a description of fixed tumor samples from human patients, as well as in vitro studies. However, in vitro models lack the complex three-dimensional tumor milieu and, therefore, are incomplete approximations of in vivo T cell activities. Fresh slices made from explanted tissue represent a complex multi-cellular tumor environment that can act as an important link between co-cultured studies and animal models. Originally set up in murine lymph nodes1 and previously described in a JoVE article2, this approach has now been transposed to human tumors to examine the dynamics of both plated3&#160;as well as resident&#160;T cells4.
Here, a protocol for the preparation of human lung tumor slices, immunostaining of resident CD8 T and tumor cells, and tracking of CD8 T lymphocytes within the tumor microenvironment using confocal microscopy is described. This system is uniquely placed to screen for novel immunotherapy agents favoring T cell migration in tumors.

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

This protocol describes a method to image resident tumor-infiltrating CD8 T cells labeled with fluorescently coupled antibodies within human lung tumor slices. This technique permits real-time analyses of CD8 T cell migration using confocal microscopy.

Ex Vivo Imagem de linfócitos de T CD8 residente no Tumor de pulmão humano fatias utilizando microscopia Confocal

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve microenvironment. This type of invasion is exhibited by a variety of cancer types, and very frequently is found in pancreatic cancer. The microscopic size of nerve fibers within mouse pancreas renders the study of PNI difficult in orthotopic murine models. Here, we describe a heterotopic in vivo model of PNI, where we inject syngeneic pancreatic cancer cell line Panc02-H7 into the murine sciatic nerve. In this model, sciatic nerves of anesthetized mice are exposed and injected with cancer cells. The cancer cells invade in the nerves proximally toward the spinal cord from the point of injection. The invaded sciatic nerves are then extracted and processed with OCT for frozen sectioning. H&amp;E and immunofluorescence staining of these sections allow quantification of both the degree of invasion and changes in protein expression. This model can be applied to a variety of studies on PNI given its versatility. Using mice with different genetic modifications and/or different types of cancer cells allows for investigation of the cellular and molecular mechanisms of PNI and for different cancer types. Furthermore, the effects of therapeutic agents on nerve invasion can be studied by applying treatment to these mice.

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

We describe an in vivo murine model of perineural invasion by injecting syngeneic pancreatic cancer cells into the sciatic nerve. The model allows for quantification of the extent of nerve invasion, and supports investigation of the cellular and molecular mechanisms of perineural invasion.

Um modelo murino de nervo ciático na Vivo de invasão Perineural

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

Modelo de Zebrafish de Metástase neuroblastoma

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical outcomes. Preclinical mouse models of breast cancer brain metastatic (BCBM) growth are useful but are expensive, and it is difficult to track live cells and tumor cell invasion within the brain parenchyma. Presented here is a protocol for ex vivo brain slice cultures from xenografted mice containing intracranially injected breast cancer brain-seeking clonal sublines. MDA-MB-231BR luciferase tagged cells were injected intracranially into the brains of Nu/Nu female mice, and following tumor formation, the brains were isolated, sliced, and cultured ex vivo. The tumor slices were imaged to identify tumor cells expressing luciferase and monitor their proliferation and invasion in the brain parenchyma for up to 10 days. Further, the protocol describes the use of time-lapse microscopy to image the growth and invasive behavior of the tumor cells following treatment with ionizing radiation or chemotherapy. The response of tumor cells to treatments can be visualized by live-imaging microscopy, measuring bioluminescence intensity, and performing histology on the brain slice containing BCBM cells. Thus, this ex vivo slice model may be a useful platform for rapid testing of novel therapeutic agents alone or in combination with radiation to identify drugs personalized to target an individual patient&#39;s breast cancer brain metastatic growth within the brain microenvironment.

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

We introduce a protocol for measuring real-time drug and radiation response of breast cancer brain metastatic cells in an organotypic brain slice model. The methods provide a quantitative assay to investigate the therapeutic effects of various treatments on brain metastases from breast cancer in an ex vivo manner within the brain microenvironment interface.

Um modelo de fatia cerebral ex vivo para estudar e direcionar o crescimento do tumor metastático do câncer de mama

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular diversity, as well as complex interactions between tumor microenvironments, can make finding effective treatments a challenge. Traditional adherent or sphere culture methods can mask such complexities, whereas three-dimensional organoid culture can recapitulate regional microenvironmental gradients. Organoids are a method of three-dimensional GBM culture that better mimics patient tumor architecture, contains phenotypically diverse cell populations, and can be used for medium-throughput experiments. Although three-dimensional organoid culture is more laborious and time-consuming compared to traditional culture, it offers unique benefits and can serve to bridge the gap between current in vitro and in vivo systems. Organoids have established themselves as invaluable tools in the arsenal of cancer biologists to better understand tumor behavior and mechanisms of resistance, and their applications only continue to grow. Here, details are provided about methods for generating and maintaining GBM organoids. Instructions of how to perform organoid sample embedding and sectioning using both frozen and paraffin-embedding techniques, as well as recommendations for immunohistochemistry and immunofluorescence protocols on organoid sections, and measurement of total organoid cell viability, are all also described.

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Here, we describe a method of generating glioblastoma (GBM) organoids from primary patient specimens or patient-derived cell cultures and maintaining them to maturity. These GBM organoids contain phenotypically diverse cell populations and recreate tumor microenvironments ex vivo.

Manutenção da Diversidade Celular Glioblastoma Humano Ex vivo usando cultura organoide tridimensional

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites have been the gold standards for conditional or inducible gene targeting. To provide faster and more efficient experimental models, an ex vivo organoid culture system is developed using adenovirus Cre and normal urothelial cells carrying multiple loxP alleles of the tumor suppressors Trp53, Pten, and Rb1. Normal urothelial cells are enzymatically disassociated from four bladders of triple floxed mice (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). The urothelial cells are transduced ex vivo with adenovirus-Cre driven by a CMV promoter (Ad5CMVCre). The transduced bladder organoids are cultured, propagated, and characterized in vitro and in vivo. PCR is used to confirm gene deletions in Trp53, Pten, and Rb1. Immunofluorescence (IF) staining of organoids demonstrates positive expression of urothelial lineage markers (CK5 and p63). The organoids are injected subcutaneously into host mice for tumor expansion and serial passages. The immunohistochemistry (IHC) of xenografts exhibits positive expression of CK7, CK5, and p63 and negative expression of CK8 and Uroplakin 3. In summary, adenovirus-mediated gene deletion from mouse urothelial cells engineered with loxP sites is an efficient method to rapidly test the tumorigenic potential of defined genetic alterations.

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

This protocol describes the process of the generation and characterization of mouse urothelial organoids harboring deletions in genes of interest. The methods include harvesting mouse urothelial cells, ex vivo transduction with adenovirus driving Cre expression with a CMV promoter, and in vitro as well as in vivo characterization.

Ex Vivo Modelo organoide de deleções genéticas mediadas por Adenovírus-Cre em células uroteliais de camundongos

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Intra-Cardiac Injection of Human Prostate Cancer Cells to Create a Bone Metastasis Xenograft Mouse Model

As the most common male malignancy, prostate cancer (PC) ranks second in mortality, primarily due to a 65%-75% bone metastasis rate. Therefore, it is essential to understand the process and related mechanisms of prostate cancer bone metastasis for developing new therapeutics. For this, an animal model of bone metastasis is an essential tool. Here, we report detailed procedures to generate a bone metastasis mouse model via intra-cardiac injection of prostate cancer cells. A bioluminescence imaging system can determine whether prostate cancer cells have been accurately injected into the heart and monitor cancer cell metastasis since it has great advantages in monitoring metastatic lesion development. This model replicates the natural development of disseminated cancer cells to form micro-metastases in the bone and imitates the pathological process of prostate cancer bone metastasis. It provides an effective tool for further exploration of the molecular mechanisms and the in vivo therapeutic effects of this disease.

Here, we present a protocol for the intra-cardiac injection of human prostate cancer cells to generate a mouse model with bone metastasis lesions.

Injeção intra-cardíaca de células humanas de câncer de próstata para criar um modelo de xenoenxerto de metástase óssea em camundongos

As the most common male malignancy, prostate cancer (PC) ranks second in mortality, primarily due to a 65%-75% bone metastasis rate. Therefore, it is ...