Diese Studie wird zum Teil von der Janet Burros Memorial Foundation finanziert. Wir danken den Patienten und der Abteilung für gynäkologische Onkologie des Karmanos Cancer Institute für die Entnahme von Omentumproben. Wir danken auch dem Biobank and Correlative Sciences Core am Karmanos Cancer Institute für die Koordination der Patientenrekrutierung und die Vorbereitung von Pathologie-Objektträgern. Der Biobank and Correlative Sciences Core wird teilweise durch das NIH Center Grant P30 CA22453 an das Karmanos Cancer Institute an der Wayne State University unterstützt.

Das folgende Forschungsprotokoll wurde vom Wayne State University Institutional Review Board (IRB) geprüft und genehmigt. Vor der Operation wurde von allen Patienten eine Einverständniserklärung eingeholt. Abbildung 1 veranschaulicht die drei allgemeinen Schritte in diesem Protokoll.
1. Präparation von menschlichem Omentumgewebe
<ol><li>Omentum-Nährmedien (DMEM/F12 + 10 % fötales Kälberserum + 1 % Penicillin-Streptomycin) vorbereiten und bei 4 °C lagern. Aliquotieren Sie 30-40 ml dieses Mediums in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen oder einen chirurgischen Probenbehälter.</li>
	<li>Erhalten Sie chirurgische Proben aus einer omentalen Biopsie oder einer Omentektomie. Tauchen Sie die sterile Probe unmittelbar nach der Entnahme im Operationssaal in Omentum-Nährmedien ein. Wenn der Arbeitsablauf dies nicht zulässt, legen Sie die Probe so schnell wie möglich in Omentum-Nährmedien. Die Probe wird auf Eis gelegt und bis zur Verarbeitung bei 4 °C gelagert. HINWEIS: Die Größe der entfernten Omentumprobe bestimmt die Menge des bearbeitbaren Gewebes.</li>
	<li>Verarbeiten Sie die Omentumprobe innerhalb von 1-2 Stunden nach der Entnahme mit einer Laminar-Flow-Haube. Stellen Sie sicher, dass alle Materialien und Werkzeuge steril oder sterilisiert sind.</li>
	<li>Nehmen Sie das Omentum aus dem Auffangbehälter und füllen Sie es in eine 100-mm-Kulturschale um. Tauchen Sie die Probe in 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x PBS) und waschen Sie die Probe vorsichtig, um Blutgerinnsel oder Ablagerungen zu entfernen.</li>
	<li>Schneiden Sie das Gewebe in Stücke (0,5 cm x 0,5 cm oder 100-200 mg; Abbildung 2A) entweder mit einer kleinen chirurgischen Schere oder einem 10-15 mm Skalpell. Verwenden Sie eine kleine chirurgische Pinzette, um das Gewebe zu manipulieren und eine Quetschung des Omentums zu vermeiden. Wenn ein Energiegerät verwendet wurde, um die Omentum-Probe chirurgisch zu entfernen, vermeiden Sie es, das verzerrte Gewebe an der versiegelten Kante zu verwenden.</li>
	<li>Geben Sie jedes Stück geschnittenes Omentum in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Kulturplatte und füllen Sie die Vertiefungen mit 500 μl Omentum-Nährmedien oder mit einem Volumen, das ausreicht, um das Omentum zu bedecken, ohne dass das Omentumstück über dem Well-Boden schwebt (Abbildung 2B).</li>
	<li>Omentumstücke in frischem Nährmedium bei 4 °C lagern, bis sie zur Injektion bereit sind.</li>
</ol>2. Präparation von Eierstockkrebszellen
<ol><li>Menschliche Eierstockkrebszellen werden in einem 75 cm2 Kulturkolben bei 37 °C und 5 %CO2 bis zum Tag der Omentumentnahme auf eine Konfluenz von mindestens 75 % kultiviert. HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet mCherry-positive OCSC1-F2-menschliche Eierstockkrebszellen, die zuvor beschriebenwurden 15,16,17,18. Es kann zu jeder Krebszelllinie modifiziert werden, die mit einem Fluoreszenzsignal markiert ist.</li>
	<li>Bereiten Sie die Zellen in einer Laminar-Flow-Haube unmittelbar nach der Entnahme der Omentumprobe vor. Stellen Sie sicher, dass alle Materialien und Werkzeuge steril oder sterilisiert sind.</li>
	<li>Geben Sie 10 ml steriles 1x PBS in den Kulturkolben und waschen Sie die Zellen, indem Sie den Kolben vorsichtig schaukeln. Entfernen Sie das 1x PBS und fügen Sie dann 3 ml 0,05% Trypsin-EDTA hinzu.</li>
	<li>Der Kulturkolben wird vorsichtig geschaukelt, um alle Zellen zu bedecken, und dann wird der Kolben nicht länger als 5 Minuten in einen Inkubator (37 °C und 5 % CO2) gestellt. Klopfen Sie auf den Kulturkolben, um die Zellen vollständig zu lösen, und neutralisieren Sie dann Trypsin, indem Sie 3 ml Omentum-Nährmedium hinzufügen.</li>
	<li>Mischen Sie die Zellsuspension durch Pipettieren und überführen Sie die Suspension dann in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Die Suspension wird 5 min bei 1.200 x g bei 24 °C zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 6 ml frischem Omentum-Kulturmedium.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit einem Hämazytometer. Verdünnen Sie die Zellsuspension auf mindestens 100.000 Zellen pro 100-200 μl Suspension. Dies ist das Volumen der Injektion in jedes geschnittene Omentumstück.</li>
	<li>Eine angemessene Anzahl von Zellen wird in einen neuen Kulturkolben überführt, um die Zellpassage fortzusetzen.</li>
</ol>3. Injektion von Eierstockkrebszellen
<ol><li>Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze, um die Zellsuspension aufzuziehen, und bringen Sie dann eine 26-G-Nadel an. Ziehen Sie die Zellsuspension nicht mit der Nadel auf, da dies die Zellen fragmentieren kann.</li>
	<li>Verwende eine kleine chirurgische Pinzette, um ein Stück geschnittenes Omentum aufzunehmen. Geben Sie das Omentum in eine separate, sterile Schale, um die Injektion zu erleichtern. Stechen Sie vorsichtig mit der Nadelspitze in das Omentum und injizieren Sie ein kleines Volumen der Zellsuspension in das Gewebe (Abbildung 2C).</li>
	<li>Wiederholen Sie die Injektion über mehrere Bereiche des Omentums bis zu einem Gesamtvolumen von mindestens 100 μl oder 100.000 Zellen. Beachten Sie, dass sich ein Großteil der Zellsuspension um die Probe herum zu sammeln scheint. Wenn Bedenken hinsichtlich der Qualität der Injektion bestehen, wiederholen Sie die Injektion oder injizieren Sie ein größeres Volumen der Zellsuspension in die Probe.</li>
	<li>Die injizierten Omentumproben werden in jede Vertiefung einer 24-Well-Kulturplatte zurückgeführt. Beachten Sie, dass das Volumen der Omentum-Nährmedien ein Niveau erreicht, das das Omentum bedeckt, ohne dass es schwimmt. Behandeln Sie die Platte vorsichtig und legen Sie sie in einen Inkubator (37 °C und 5% CO2).</li>
	<li>OPTIONAL: Verwenden Sie Matrigel (Basalmembranmatrix), um Omentumgewebe in einer festen Matrix zu suspendieren, um eine einfachere Injektion und eine konzentriertere Verabreichung der Zellsuspension zu ermöglichen.<ol><li>Die Basalmembranmatrix wird bei 4 °C aufgetaut und unmittelbar vor Gebrauch im Verhältnis 1:1 mit Omentum-Nährmedien vermischt. Lagern Sie die Basalmembran-Matrixmischung bis zur Injektion auf Eis oder bei 4 °C. Füllen Sie leere Vertiefungen mit genügend Basalmembran-Matrix-Mischung, um ein abgeschnittenes Stück Omentum einzutauchen.</li>
		<li>Die Proben werden in die Basalmembran-Matrixmischung gegeben und dann die 24-Well-Kulturplatte für 20 Minuten in einen Inkubator (37 °C und 5 % CO2) gelegt. Sobald das Gemisch erstarrt ist, fahren Sie mit der Injektion wie oben beschrieben fort.</li>
	</ol></li>
	<li>Bestätigen Sie die erfolgreiche Injektion mit Hilfe der Fluoreszenzbildgebung. Stellen Sie sicher, dass ein Streifen des Fluoreszenzsignals an den Injektionsstellen sichtbar ist (Abbildung 2D). Beachten Sie, dass die tatsächliche Anzahl der Zellen, die nach der Injektion an das Omentum gebunden sind, unvorhersehbar ist.</li>
</ol>4. Co-Kultur von humanen Omentum- und Eierstockkrebszellen
<ol><li>Wechseln Sie das Medium alle 48-72 Stunden, indem Sie 500-2000 μl frisches Omentum-Nährmedium hinzufügen. Pieptieren Sie Medien nicht direkt auf das Omentumgewebe, da dies Krebszellen verdrängen kann. Beachten Sie, dass Sie die Medien ändern müssen, wenn die Medienfarbe gelb wird. HINWEIS: Die Häufigkeit des Medienwechsels hängt von der Menge der verwendeten Medien und dem Verlauf des Krebszellwachstums ab. Sobald die Krebszellen das Omentum ausgesät haben, ist es nicht mehr wichtig, ob das Omentumstück schwimmt oder nicht.</li>
	<li>OPTIONAL: Wenn eine Basalmembranmatrix verwendet wurde, war die Matrix in der Regel zum Zeitpunkt des ersten Medienwechsels aufgelöst.</li>
	<li>Überwachen Sie das Wachstum von Eierstockkrebstumoren mit Hilfe der Fluoreszenzbildgebung. Die Häufigkeit der Bildgebung liegt im Ermessen des Prüfarztes. Rechnen Sie mit dem Nachweis kleiner Tumore nach etwa 14 Tagen (Abbildung 3A-C). Die Ergebnisse können je nach Qualität der Injektion variieren.</li>
	<li>Beenden Sie das Experiment basierend auf dem Endpunkt des Experiments. HINWEIS: Das Tumorwachstum und die Integrität des Omentumgewebes wurden in den letzten 50 Tagen beobachtet.</li>
</ol>

Etablierung eines 3D-Ex-vivo-Modells für die Interaktion zwischen Eierstockkrebs und Omentum

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).</li><li>Berek, J. S., Renz, M., Kehoe, S., Kumar, L., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+of+the+ovary,+fallopian+tube,+and+peritoneum:+2021+update.">Cancer of the ovary, fallopian tube, and peritoneum: 2021 update.</a> Int J Gynaecol Obstet. 155 (Suppl 1), 61-85 (2021).</li><li>Ledermann, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+diagnosed+and+relapsed+epithelial+ovarian+carcinoma:+ESMO+clinical+practice+guidelines+for+diagnosis,+treatment+and+follow-up.">Newly diagnosed and relapsed epithelial ovarian carcinoma: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Ann Oncol. 24 (Suppl 6), vi24-32 (2013).</li><li>Jelovac, D., Armstrong, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+diagnosis+and+treatment+of+ovarian+cancer.">Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer.</a> CA Cancer J Clin. 61 (3), 183-203 (2011).</li><li>Morgan, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer.+Clinical+practice+guidelines+in+oncology.">Ovarian cancer. Clinical practice guidelines in oncology.</a> J Natl Compr Canc Netw. 6 (8), 766-794 (2008).</li><li>Nieman, K. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue:+The+dysfunctional+adipocyte+-+a+cancer+cell's+best+friend.">Adipose tissue: The dysfunctional adipocyte - a cancer cell's best friend.</a> Nat Rev Endocrinol. 14 (3), 132-134 (2018).</li><li>Alvero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRX-E-002-1+Induces+c-Jun-dependent+apoptosis+in+ovarian+cancer+stem+cells+and+prevents+recurrence+in+vivo.">TRX-E-002-1 Induces c-Jun-dependent apoptosis in ovarian cancer stem cells and prevents recurrence in vivo.</a> Mol Cancer Ther. 15 (6), 1279-1290 (2016).</li><li>Alvero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+for+the+detection+of+intraperitoneal+micrometastasis+using+an+ovarian+cancer+mouse+model.">Novel approach for the detection of intraperitoneal micrometastasis using an ovarian cancer mouse model.</a> Sci Rep. 7, 40989 (2017).</li><li>Craveiro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+modifications+in+ovarian+cancer+stem+cells+following+Paclitaxel+treatment.">Phenotypic modifications in ovarian cancer stem cells following Paclitaxel treatment.</a> Cancer Med. 2 (6), 751-762 (2013).</li><li>Sumi, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+for+non-invasive+imaging+to+detect+and+monitor+ovarian+cancer+recurrence.">Murine model for non-invasive imaging to detect and monitor ovarian cancer recurrence.</a> J Vis Exp. (93), e51815 (2014).</li><li>Agarwal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+migration+inhibitory+factor+expression+in+ovarian+cancer.">Macrophage migration inhibitory factor expression in ovarian cancer.</a> Am J Obstet Gynecol. 196 (4), 348.e1-348.e5 (2007).</li><li>Kelly, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-4+signaling+promotes+tumor+growth+and+paclitaxel+chemoresistance+in+ovarian+cancer.">TLR-4 signaling promotes tumor growth and paclitaxel chemoresistance in ovarian cancer.</a> Cancer Res. 66 (7), 3859-3868 (2006).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBX7+binds+the+E-box+to+inhibit+TWIST-1+function+and+inhibit+tumorigenicity+and+metastatic+potential.">CBX7 binds the E-box to inhibit TWIST-1 function and inhibit tumorigenicity and metastatic potential.</a> Oncogene. 39 (20), 3965-3979 (2020).</li><li>Tedja, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+epithelial-mesenchymal+hybrid+cancer+cells+with+tumorigenic+potential.">Generation of stable epithelial-mesenchymal hybrid cancer cells with tumorigenic potential.</a> Cancers (Basel). 15 (3), 15030684 (2023).</li><li>Dauleh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+cultured+mesothelial+cells+derived+from+the+murine+adult+omentum.">Characterisation of cultured mesothelial cells derived from the murine adult omentum.</a> PLoS One. 11 (7), e0158997 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Unter Verwendung dieses Protokolls wurde ein präklinisches Modell der Peritonealkarzinose bei Ovarialkarzinom entwickelt, das eine Kombination aus grundlegenden In-vitro- und Ex-vivo-Techniken verwendet. Ein progressives Tumorwachstum wurde über 50 Tage in Kokultur beobachtet, nachdem Omentumproben mit mCherry+ OCSC1-F2 humanen Ovarialkarzinomzellen ausgesät wurden. Diese Methode wurde in mehreren experimentellen Versuchen mit verschiedenen Omentumproben entwickelt und optimiert. Ein erfolgreiches Tu...

Eierstockkrebs ist die tödlichste gynäkologische Malignität weltweit1. Das Lebenszeitrisiko, an diesem Krebs zu erkranken, liegt bei etwa 1 zu 70, wobei das mediane Alter bei der Diagnose bei 63 Jahren liegt2. Primäre Malignome der Eierstöcke werden histologisch entweder als epithelial oder nicht-epithelial klassifiziert. Epitheliale Ovarialkarzinome (EOC) machen über 90 % der Tumoren aus, und der häufigste Subtyp ist das hochgradige seröse Karzinom (HGSC), das etwa 70 % bis 80 % der EOCs ausmacht. Derzeit gibt es keine wirksamen Screening-Methoden, um Krankheiten frühzeitig zu erkennen. Daher werden die meisten Patienten in einem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert (d. h. Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique [FIGO] Stadium III oder IV), nachdem sich der Krebs in der Bauchhöhle ausgebreitet hat2.
Die Standardbehandlung an vorderster Front ist die zytoreduktive Chirurgie, um alle sichtbaren makroskopischen Erkrankungen zu entfernen, gefolgt von einer adjuvanten Chemotherapie auf Platinbasis, um alle verbleibenden mikroskopischen Erkrankungen zu zerstören. Obwohl es in den letzten zwei Jahrzehnten viele Fortschritte in der Behandlung von Eierstockkrebs gegeben hat, erleiden etwa 70 % der Patientinnen mit fortgeschrittener Erkrankung innerhalb von 3 Jahren nach der Behandlung einen Rückfall3. Angesichts der insgesamt schlechten Prognose dieser Patienten zielen laufende und zukünftige translationale Forschungsbemühungen im EOC darauf ab, Biomarker für die Früherkennung zu identifizieren, Metastasen zu verhindern, aktuelle Therapien zu verbessern, um Resistenzen zu umgehen und neue personalisierte Krebsbehandlungen zu entwickeln.
Generalisierte Metastasen in der Peritonealhöhle und die damit verbundene Chemoresistenz sind zwei der Haupteinschränkungen für die Verbesserung der Behandlung von Patientinnen mit Ovarialkarzinom 4,5. Das Omentum, eine fettige, schürzenartige Struktur, die vom Magen über den Darm herabhängt, ist ein Hauptort der Metastasierung von Eierstockkrebs 6,7. Zusätzlich zu seiner Funktion als physikalische Barriere hat das Omentum nachweislich regenerative und angiogene Fähigkeiten und besitzt Immunaktivitäten, die zusammen die Vaskularisierung fördern, die Wundheilung beschleunigen und Infektionen begrenzen8. Es enthält eine hohe Konzentration an Stammzellen, die sich in verschiedene Zelltypen differenzieren und bei der Reparatur von beschädigtem Gewebe helfen können. Das Omentum kann sich als Reaktion auf eine Verletzung oder Infektion entzünden, was die Migration von Immunzellen an die Verletzungsstelle auslöst9. Diese Immunzellen setzen Wachstumsfaktoren und andere Moleküle frei, die dazu beitragen, die Reparatur und Regeneration von geschädigtem Gewebe zu fördern. Immunzellen wie Makrophagen, Lymphozyten und Plasmazellen, die im Omentum lokalisiert sind, sind Strukturen, die als "milchige Flecken" bekannt sind und für die Erkennung und Bekämpfung von Krankheitserregern und die Regulierung der peritonealen Immunität verantwortlich sind. Es wurde auch gezeigt, dass das Omentum eine Rolle bei der Induktion der Immuntoleranz10 spielt, d. h. der Fähigkeit des Immunsystems, Selbstantigene zu tolerieren und gesundes Gewebe nicht anzugreifen. Dieselben immunbezogenen Aktivitäten sind jedoch auch an pathologischen Reaktionen beteiligt, wie z. B. dem Wachstum von omentalen Tumoren, Metastasen und der Flucht aus der Immunüberwachung 9,11. Frühere Studien aus unserem Labor und anderen haben eine einzigartige und aktive Rolle der adipösen Mikroumgebung bei der Hemmung antitumoraler Immunantworten und beim Erwerb von Chemoresistenzen gezeigt12,13,14. Leider haben wir nur begrenzte Informationen über die zellulären und molekularen Mechanismen, durch die das Omentum eine pro-tumorale Mikroumgebung bietet.
Um die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und dem Omentum besser zu verstehen, wurde ein 3D-Kultursystem entwickelt, das aus humanen Ovarialkarzinomzellen und patienteneigenen Omentum-Explantaten besteht. Das hier beschriebene Protokoll stellt ein neuartiges ex vivo Modell der Peritonealkarzinose dar. Dieses Modell ahmt den natürlichen Verlauf der Tumorgenese von Eierstockkrebs in diesem fettreichen Gewebe nach. Das vorgeschlagene Modell ist einfach zu generieren, kostengünstig und potenziell auf translationale Untersuchungen in der Eierstockkrebsforschung anwendbar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>329652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipets</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229010B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 Tissue Culture Flask</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Counter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9819000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 imager</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1043028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel</td>
			<td>Integra-Miltex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revolve microscope</td>
			<td>Echo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo model of ovarian cancer peritoneal metastasis using human omentum

Eierstockkrebs ist die tödlichste gynäkologische Malignität. Das Omentum spielt eine Schlüsselrolle bei der Bereitstellung einer unterstützenden Mikroumgebung für metastasierende Eierstockkrebszellen sowie bei immunmodulatorischen Signalen, die eine Tumortoleranz ermöglichen. Wir haben jedoch nur begrenzte Modelle, die die Interaktion zwischen Eierstockkrebszellen und fettreichem Gewebe genau nachahmen. Um die zellulären und molekularen Mechanismen, durch die das Omentum eine pro-tumorale Mikroumgebung bietet, besser zu verstehen, haben wir ein einzigartiges 3D-Ex-vivo-Modell der Krebszell-Omentum-Interaktion entwickelt. Mit Hilfe des menschlichen Omentums sind wir in der Lage, Eierstockkrebszellen in dieser fettreichen Mikroumgebung zu züchten und die Faktoren zu überwachen, die für das Tumorwachstum und die Immunregulation verantwortlich sind. Das Modell bietet nicht nur eine Plattform für die Untersuchung dieser fettreichen Tumormikroumgebung, sondern auch eine hervorragende Plattform für die Entwicklung und Bewertung neuartiger therapeutischer Ansätze, um metastasierende Krebszellen in dieser Nische anzugreifen. Das vorgeschlagene Modell ist einfach zu generieren, kostengünstig und auf translationale Untersuchungen anwendbar.

Die erfolgreiche Etablierung von Ovarialkarzinomzellen in Omentumproben war etwa am 14. Tag offensichtlich (Abbildung 3A-C). Mindestens 24 Replikate wurden präpariert und pro entnommener Probe injiziert, um weitere Experimente zu ermöglichen. Das Tumorwachstum wurde durch Fluoreszenzaufnahmen überwacht (Abbildung 3D,E). Die Bilder mussten vorsichtig interpretiert werden, da eine Monoschicht von Krebszellen au...

Watch this Scientific Journal Video about Advanced Ex Vivo Model for Investigating Cancer-Adipose Microenvironment Interaction at JoVE.com

Autor im Rampenlicht: Fortschrittliches Ex-vivo-Modell zur Untersuchung der Interaktion zwischen Krebs und Fett in der Mikroumgebung 

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung eines dreidimensionalen (3D) ex vivo Modells der Krebszell-Omentum-Interaktion. Das Modell bietet eine Plattform zur Aufklärung von Pro-Tumor-Mechanismen in der Fettnische und zur Erprobung neuartiger Therapien.

Ein Ex-vivo-Modell der Peritonealmetastasierung von Eierstockkrebs mit humanem Omentum

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian ...

In aktuellen Studien werden Co-Kultursysteme verwendet, die aus isolierten Adipozyten und Eierstockkrebszellen bestehen. Diese Adipozyten werden in vitro von Präadipozyten unterschieden. Diese Zellen werden dann durch einen Transwell-Einsatz getrennt und haben daher keinen direkten Kontakt von Zelle zu Zelle.Diese Ex-vivo-Kulturmethode bietet ein Modell, um die direkte Interaktion von Krebszellen mit der adipösen Mikroumgebung zu untersuchen. Unser Modell bewahrt die Struktur des menschlichen Impulses und erhält daher die verschiedenen Zelltypen, die sich typischerweise in diesem Organ befinden. Zu diesen Zellen gehören neben den Adipozyten auch unterstützende Fibroblasten sowie Immunzellen.Dieses Modell hält diese Zellen auch in ihrer inhärenten Matrix erhalten. Dieses Modell bietet eine hervorragende Plattform für die Entwicklung und Evaluierung neuartiger therapeutischer Ansätze, um metastasierende Krebszellen in dieser Nische anzugreifen.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

An Ex Vivo Model of Ovarian Cancer Peritoneal Metastasis Using Human Omentum

1.7K Aufrufe.  Karmanos Cancer Institute. In aktuellen Studien werden Co-Kultursysteme verwendet, die aus isolierten Adipozyten und Eierstockkrebszellen bestehen. Diese Adipozyten werden in vitro von Präadipozyten unterschieden. Diese Zellen werden dann durch einen Transwell-Einsatz getrennt und haben daher keinen direkten Kontakt von Zelle zu Zelle.Diese Ex-vivo-Kulturmethode bietet ein Modell, um die direkte Interaktion von Krebszellen mit der adipösen Mikroumgebung zu untersuchen. Unser Modell bewahrt die Struktur des men...

Serie: Autor im Rampenlicht: Fortschrittliches Ex-vivo-Modell zur Untersuchung der Interaktion zwischen Krebs und Fett in der Mikroumgebung 

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is important to control peritoneal dissemination. However, it is still unclear how tumor cells detach from primary lesions and attach to the mesothelium. The establishment of an appropriate animal model is needed to gain an understanding of the mechanism of peritoneal dissemination in vivo. In the current study, we introduce the process from the local injection of EOC cells into the murine ovarian surface to the development of metastasis, including the peritoneum and distant organs. Female nude mice (BALB/c nu/nu) at 8 weeks of age were used. Under a microscopic field of view, EOC cells (1 x 105 cells/&#181;l of medium-extracellular matrix (ECM)-based hydrogel/unilateral ovary/mouse) were injected into murine ovaries through a retroperitoneal approach from the dorsal flank. This proposed method is a less invasive procedure for the mouse and minimizes damage to the ovary. Here, we describe the methodological steps in the development of the original and metastatic tumor formation of EOC.

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

To clarify the multistep process of peritoneal dissemination of ovarian carcinoma, the current study presents a murine experimental model of original tumor development and peritoneal metastasis via orthotopic inoculation with these tumor cells.

Murine experimentellen Modell der ursprünglichen Tumor-Entwicklung und Peritoneal Metastasierung<em&gt; über</em&gt; Orthotopische Inokulation mit Ovarialkarzinomzellen

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

Forschung

Krebsforschung

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm3. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.

In - vivo - Modell für die Prüfung von Wirkung von Hypoxie auf die Tumormetastasierung

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Ein Portal Veneninjektion Modell zur Untersuchung der Leber Metastasierung von Brustkrebs

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the tumor microenvironment and respond adequately to tumor antigens. The recent development of improved imaging approaches, such as 2-photon microscopy, and the use of powerful mouse tumor models have shed light on some of the mechanisms that regulate anti-tumor T cell activities. Whereas such systems have provided valuable insights, they do not always predict human responses. In human, our knowledge in the field mainly comes from a description of fixed tumor samples from human patients, as well as in vitro studies. However, in vitro models lack the complex three-dimensional tumor milieu and, therefore, are incomplete approximations of in vivo T cell activities. Fresh slices made from explanted tissue represent a complex multi-cellular tumor environment that can act as an important link between co-cultured studies and animal models. Originally set up in murine lymph nodes1 and previously described in a JoVE article2, this approach has now been transposed to human tumors to examine the dynamics of both plated3&#160;as well as resident&#160;T cells4.
Here, a protocol for the preparation of human lung tumor slices, immunostaining of resident CD8 T and tumor cells, and tracking of CD8 T lymphocytes within the tumor microenvironment using confocal microscopy is described. This system is uniquely placed to screen for novel immunotherapy agents favoring T cell migration in tumors.

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

This protocol describes a method to image resident tumor-infiltrating CD8 T cells labeled with fluorescently coupled antibodies within human lung tumor slices. This technique permits real-time analyses of CD8 T cell migration using confocal microscopy.

Ex-Vivo Bildgebung von Resident CD8-T-Lymphozyten in menschlichen Lungentumor Scheiben mit konfokalen Mikroskopie

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve microenvironment. This type of invasion is exhibited by a variety of cancer types, and very frequently is found in pancreatic cancer. The microscopic size of nerve fibers within mouse pancreas renders the study of PNI difficult in orthotopic murine models. Here, we describe a heterotopic in vivo model of PNI, where we inject syngeneic pancreatic cancer cell line Panc02-H7 into the murine sciatic nerve. In this model, sciatic nerves of anesthetized mice are exposed and injected with cancer cells. The cancer cells invade in the nerves proximally toward the spinal cord from the point of injection. The invaded sciatic nerves are then extracted and processed with OCT for frozen sectioning. H&amp;E and immunofluorescence staining of these sections allow quantification of both the degree of invasion and changes in protein expression. This model can be applied to a variety of studies on PNI given its versatility. Using mice with different genetic modifications and/or different types of cancer cells allows for investigation of the cellular and molecular mechanisms of PNI and for different cancer types. Furthermore, the effects of therapeutic agents on nerve invasion can be studied by applying treatment to these mice.

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

We describe an in vivo murine model of perineural invasion by injecting syngeneic pancreatic cancer cells into the sciatic nerve. The model allows for quantification of the extent of nerve invasion, and supports investigation of the cellular and molecular mechanisms of perineural invasion.

Eine In Vivo murinen Ischiasnerv Modell Perineural Invasion

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

Zebrafisch-Modell der Neuroblastom-Metastasierung

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical outcomes. Preclinical mouse models of breast cancer brain metastatic (BCBM) growth are useful but are expensive, and it is difficult to track live cells and tumor cell invasion within the brain parenchyma. Presented here is a protocol for ex vivo brain slice cultures from xenografted mice containing intracranially injected breast cancer brain-seeking clonal sublines. MDA-MB-231BR luciferase tagged cells were injected intracranially into the brains of Nu/Nu female mice, and following tumor formation, the brains were isolated, sliced, and cultured ex vivo. The tumor slices were imaged to identify tumor cells expressing luciferase and monitor their proliferation and invasion in the brain parenchyma for up to 10 days. Further, the protocol describes the use of time-lapse microscopy to image the growth and invasive behavior of the tumor cells following treatment with ionizing radiation or chemotherapy. The response of tumor cells to treatments can be visualized by live-imaging microscopy, measuring bioluminescence intensity, and performing histology on the brain slice containing BCBM cells. Thus, this ex vivo slice model may be a useful platform for rapid testing of novel therapeutic agents alone or in combination with radiation to identify drugs personalized to target an individual patient&#39;s breast cancer brain metastatic growth within the brain microenvironment.

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

We introduce a protocol for measuring real-time drug and radiation response of breast cancer brain metastatic cells in an organotypic brain slice model. The methods provide a quantitative assay to investigate the therapeutic effects of various treatments on brain metastases from breast cancer in an ex vivo manner within the brain microenvironment interface.

Ein Ex-vivo-Gehirnschnittmodell zur Untersuchung und Bekämpfung des metastasierenden Tumorwachstums von Brustkrebs im Gehirn

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular diversity, as well as complex interactions between tumor microenvironments, can make finding effective treatments a challenge. Traditional adherent or sphere culture methods can mask such complexities, whereas three-dimensional organoid culture can recapitulate regional microenvironmental gradients. Organoids are a method of three-dimensional GBM culture that better mimics patient tumor architecture, contains phenotypically diverse cell populations, and can be used for medium-throughput experiments. Although three-dimensional organoid culture is more laborious and time-consuming compared to traditional culture, it offers unique benefits and can serve to bridge the gap between current in vitro and in vivo systems. Organoids have established themselves as invaluable tools in the arsenal of cancer biologists to better understand tumor behavior and mechanisms of resistance, and their applications only continue to grow. Here, details are provided about methods for generating and maintaining GBM organoids. Instructions of how to perform organoid sample embedding and sectioning using both frozen and paraffin-embedding techniques, as well as recommendations for immunohistochemistry and immunofluorescence protocols on organoid sections, and measurement of total organoid cell viability, are all also described.

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Here, we describe a method of generating glioblastoma (GBM) organoids from primary patient specimens or patient-derived cell cultures and maintaining them to maturity. These GBM organoids contain phenotypically diverse cell populations and recreate tumor microenvironments ex vivo.

Erhaltung der zellulären Vielfalt des menschlichen Glioblastoms ex vivo unter Verwendung dreidimensionaler Organoidkultur

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites have been the gold standards for conditional or inducible gene targeting. To provide faster and more efficient experimental models, an ex vivo organoid culture system is developed using adenovirus Cre and normal urothelial cells carrying multiple loxP alleles of the tumor suppressors Trp53, Pten, and Rb1. Normal urothelial cells are enzymatically disassociated from four bladders of triple floxed mice (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). The urothelial cells are transduced ex vivo with adenovirus-Cre driven by a CMV promoter (Ad5CMVCre). The transduced bladder organoids are cultured, propagated, and characterized in vitro and in vivo. PCR is used to confirm gene deletions in Trp53, Pten, and Rb1. Immunofluorescence (IF) staining of organoids demonstrates positive expression of urothelial lineage markers (CK5 and p63). The organoids are injected subcutaneously into host mice for tumor expansion and serial passages. The immunohistochemistry (IHC) of xenografts exhibits positive expression of CK7, CK5, and p63 and negative expression of CK8 and Uroplakin 3. In summary, adenovirus-mediated gene deletion from mouse urothelial cells engineered with loxP sites is an efficient method to rapidly test the tumorigenic potential of defined genetic alterations.

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

This protocol describes the process of the generation and characterization of mouse urothelial organoids harboring deletions in genes of interest. The methods include harvesting mouse urothelial cells, ex vivo transduction with adenovirus driving Cre expression with a CMV promoter, and in vitro as well as in vivo characterization.

Ex vivo Organoid-Modell von Adenovirus-Cre-vermittelten Gendeletionen in Urothelzellen der Maus

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Intra-Cardiac Injection of Human Prostate Cancer Cells to Create a Bone Metastasis Xenograft Mouse Model

As the most common male malignancy, prostate cancer (PC) ranks second in mortality, primarily due to a 65%-75% bone metastasis rate. Therefore, it is essential to understand the process and related mechanisms of prostate cancer bone metastasis for developing new therapeutics. For this, an animal model of bone metastasis is an essential tool. Here, we report detailed procedures to generate a bone metastasis mouse model via intra-cardiac injection of prostate cancer cells. A bioluminescence imaging system can determine whether prostate cancer cells have been accurately injected into the heart and monitor cancer cell metastasis since it has great advantages in monitoring metastatic lesion development. This model replicates the natural development of disseminated cancer cells to form micro-metastases in the bone and imitates the pathological process of prostate cancer bone metastasis. It provides an effective tool for further exploration of the molecular mechanisms and the in vivo therapeutic effects of this disease.

Here, we present a protocol for the intra-cardiac injection of human prostate cancer cells to generate a mouse model with bone metastasis lesions.

Intrakardiale Injektion menschlicher Prostatakrebszellen zur Erzeugung eines Knochenmetastasierungs-Xenograft-Mausmodells

As the most common male malignancy, prostate cancer (PC) ranks second in mortality, primarily due to a 65%-75% bone metastasis rate. Therefore, it is ...