מחקר זה ממומן בחלקו על ידי קרן הזיכרון של ג'נט בורוס. אנו מודים למטופלות ולמחלקה האונקולוגית הגינקולוגית של מכון קרמנוס לסרטן על איסוף דגימות אומנטום. כמו כן, אנו מודים לליבת ביובנק ומדעי הקורלציה במכון הסרטן קרמנוס על תיאום גיוס חולים והכנת שקופיות פתולוגיות. הליבה של ביובנק ומדעי הקורלציה נתמכת בחלקה על ידי מענק P30 CA22453 של מרכז NIH למכון קרמנוס לסרטן באוניברסיטת וויין סטייט.

פרוטוקול המחקר הבא נבדק ואושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת וויין סטייט (IRB). הסכמה מדעת התקבלה מכל המטופלים לפני הניתוח. איור 1 ממחיש את שלושת השלבים הכלליים בפרוטוקול זה.
1. הכנת רקמת omentum האנושי
<ol><li>הכינו תרבית אומנטום (DMEM/F12 + 10% סרום בקר עוברי + 1% פניצילין-סטרפטומיצין) ואחסנו בטמפרטורה של 4°C. Aliquot 30-40 מ"ל של מדיה זו לתוך סטרילי 50 מ"ל צינור חרוטי או מיכל דגימה כירורגית.</li>
	<li>קבל דגימות כירורגיות מביופסיה אומנטלית או ניתוח omentectomy. יש לטבול את הדגימה הסטרילית בתרבית אומנטום מיד לאחר ההסרה בחדר הניתוח. אם זרימת העבודה אינה מאפשרת זאת, מקם את הדגימה במדיה של תרבית omentum בהקדם האפשרי. מעבירים את הדגימה על ידי הנחתה על קרח ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד. הערה: גודל דגימת האומנטום שהוסרה יקבע את כמות הרקמה הניתנת לעבודה.</li>
	<li>עבד את דגימת omentum בתוך 1-2 שעות של איסוף באמצעות מכסה מנוע זרימה למינרית. ודא שכל החומרים והכלים סטריליים או מעוקרים.</li>
	<li>מוציאים את האומנטום ממיכל האיסוף ומעבירים לצלחת תרבית בקוטר 100 מ"מ. יש לטבול את הדגימה במי מלח חוצצי פוספט 1x (1x PBS) ולשטוף בעדינות את הדגימה כדי להסיר קרישי דם או פסולת.</li>
	<li>חותכים את הרקמה לחתיכות (0.5 ס"מ x 0.5 ס"מ או 100-200 מ"ג; איור 2A) באמצעות מספריים כירורגיים קטנים או אזמל 10-15 מ"מ. השתמש מלקחיים כירורגיים קטנים כדי לעזור לתפעל את הרקמה ולמנוע ריסוק omentum. אם נעשה שימוש במכשיר אנרגיה כדי להסיר בניתוח את דגימת האומנטום, הימנע משימוש ברקמה המעוותת בקצה האטום.</li>
	<li>הניחו כל פיסת אומנטום חתוכה בבארות נפרדות של צלחת תרבית בת 24 בארות ומלאו את הבארות ב-500 מיקרוליטר של מצע תרבית אומנטום או בנפח שמספיק כדי לכסות את האומנטום מבלי לאפשר לחתיכת האומנטום לצוף מעל רצפת הבאר (איור 2B).</li>
	<li>אחסנו חתיכות אומנטום במצע תרבית טרי בטמפרטורה של 4°C עד להזרקה.</li>
</ol>2. הכנת תאי סרטן השחלות
<ol><li>תרבית תאי סרטן שחלות אנושיים בבקבוק תרביתשל 75 ס"מ 2 ב 37 ° C ו 5% CO2 לפחות 75% מפגש עד יום איסוף omentum. הערה: פרוטוקול זה משתמש בתאי סרטן שחלות אנושיים מסוג OCSC1-F2 חיוביים ל-mCherry שתוארו בעברכ-15,16,17,18. ניתן לשנות אותו לכל קו תאים סרטניים המתויג באות פלואורסצנטי.</li>
	<li>הכינו תאים בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית מיד לאחר איסוף דגימת האומנטום. ודא שכל החומרים והכלים סטריליים או מעוקרים.</li>
	<li>הוסף 10 מ"ל של PBS סטרילי 1x PBS לבקבוק התרבית ושטוף את התאים על ידי נדנוד עדין של הצלוחית. הסר את 1x PBS ולאחר מכן הוסף 3 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA.</li>
	<li>נענעו בעדינות את בקבוק התרבית כדי לצפות את כל התאים, ולאחר מכן הניחו את הבקבוק באינקובטור (37°C ו-5% CO2) למשך לא יותר מ-5 דקות. הקש על בקבוק התרבית כדי לנתק לחלוטין את התאים, ולאחר מכן נטרל טריפסין על ידי הוספת 3 מ"ל של מדיה תרבית omentum.</li>
	<li>מערבבים את תרחיף התא על ידי פיפטינג, ולאחר מכן מעבירים את התרחיף לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה את המתלים למשך 5 דקות ב-1,200 x גרם ב-24°C. הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא ב 6 מ"ל של מדיה תרבית omentum טרי.</li>
	<li>ספור את התאים באמצעות hemacytometer. לדלל את תרחיף התא לפחות 100,000 תאים לכל 100-200 μL של תרחיף. זהו נפח ההזרקה לכל חתיכת אומנטום חתוכה.</li>
	<li>העבר מספר מתאים של תאים לבקבוק תרבית חדש כדי להמשיך את מעבר התא.</li>
</ol>3. הזרקת תאי סרטן השחלות
<ol><li>השתמש מזרק 1 מ"ל כדי לצייר את השעיית התא, ולאחר מכן לחבר מחט 26-G. אין לצייר את השעיית התא באמצעות המחט, שכן זה יכול לשבור את התאים.</li>
	<li>השתמש במלקחיים כירורגיים קטנים כדי להרים חתיכת omentum חתוך. מעבירים את האומנטום לצלחת סטרילית נפרדת כדי להקל על ההזרקה. ניקבו בעדינות את האומנטום עם קצה המחט והזריקו נפח קטן של תרחיף תאים לתוך הרקמה (איור 2C).</li>
	<li>הזרקה חוזרת על פני מספר אזורים של omentum לנפח כולל של לפחות 100 μL או 100,000 תאים. שימו לב שחלק גדול מתרחיף התא עשוי להיראות כאילו הוא מצטבר סביב הדגימה. אם יש חשש לגבי איכות ההזרקה, יש לחזור על הזריקה או להזריק נפח גדול יותר של תרחיף תאים לדגימה.</li>
	<li>מחזירים את דגימות האומנטום המוזרקות לכל באר של צלחת תרבית בת 24 בארות. שימו לב שנפח המדיה של תרבות האומנטום הוא ברמה שמכסה את האומנטום מבלי לאפשר לו לצוף. בזהירות לטפל בצלחת ולהניח אותו בתוך אינקובטור (37 ° C ו 5% CO2).</li>
	<li>אופציונלי: השתמש במטריג'ל (מטריצת קרום מרתף) כדי להשהות רקמת אומנטום במטריצה מוצקה כדי לאפשר הזרקה קלה יותר ותרחיף תאים מרוכז יותר.<ol><li>הפשירו את מטריצת קרום המרתף בטמפרטורה של 4°C וערבבו ביחס של 1:1 עם מדיית תרבית אומנטום מיד לפני השימוש. אחסנו את תערובת מטריצת קרום המרתף על קרח או בטמפרטורה של 4°C עד להזרקה. מלאו בארות ריקות בתערובת מטריצת קרום מרתף מספיק כדי לטבול חתיכת omentum חתוך.</li>
		<li>מניחים דגימות לתוך תערובת מטריצת קרום המרתף ולאחר מכן מניחים את צלחת תרבית 24 בארות באינקובטור (37 ° C ו 5% CO2) במשך 20 דקות. לאחר שהתערובת התמצקה, המשיכו בהזרקה כמתואר לעיל.</li>
	</ol></li>
	<li>ודא הזרקה מוצלחת באמצעות הדמיה פלואורסצנטית. ודאו שפס של אות פלואורסצנטי מוצג באופן חזותי באתרי ההזרקה (איור 2D). שים לב כי מספר התאים בפועל מחובר omentum לאחר ההזרקה הוא בלתי צפוי.</li>
</ol>4. תרבות משותפת של omentum אנושי ותאי סרטן השחלות
<ol><li>שנה מדיה כל 48-72 שעות על ידי הוספת 500-2000 μL של מדיה תרבותית omentum טרי. אין לצנרת מדיה ישירות על גבי רקמת omentum, שכן זה עלול לעקור תאים סרטניים. שים לב שאם צבע המדיה הופך לצהוב, שנה את המדיה. הערה: תדירות שינוי המדיה תהיה תלויה בנפח המדיה בשימוש ובמסלול צמיחת התאים הסרטניים. ברגע שהתאים הסרטניים זרעו את האומנטום, כבר לא חשוב אם חתיכת האומנטום צפה או לא.</li>
	<li>אופציונלי: אם נעשה שימוש במטריצת קרום מרתף, המטריצה בדרך כלל תתמוסס בזמן שינוי המדיה הראשון.</li>
	<li>עקוב אחר הצמיחה של גידולים סרטניים בשחלות באמצעות הדמיה פלואורסצנטית. תדירות ההדמיה נתונה לשיקול דעתו של החוקר. צפו עדויות לגידולים קטנים בכ-14 יום (איור 3A-C). התוצאות עשויות להשתנות בהתאם לאיכות ההזרקה.</li>
	<li>סיים את הניסוי בהתבסס על נקודת הקצה של הניסוי. הערה: צמיחת הגידול ושלמות רקמת האומנטום נצפו ב-50 הימים האחרונים.</li>
</ol>

הקמת מודל 3D Ex Vivo לאינטראקציה בין סרטן השחלות לאומנטום

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).</li><li>Berek, J. S., Renz, M., Kehoe, S., Kumar, L., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+of+the+ovary,+fallopian+tube,+and+peritoneum:+2021+update.">Cancer of the ovary, fallopian tube, and peritoneum: 2021 update.</a> Int J Gynaecol Obstet. 155 (Suppl 1), 61-85 (2021).</li><li>Ledermann, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+diagnosed+and+relapsed+epithelial+ovarian+carcinoma:+ESMO+clinical+practice+guidelines+for+diagnosis,+treatment+and+follow-up.">Newly diagnosed and relapsed epithelial ovarian carcinoma: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Ann Oncol. 24 (Suppl 6), vi24-32 (2013).</li><li>Jelovac, D., Armstrong, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+diagnosis+and+treatment+of+ovarian+cancer.">Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer.</a> CA Cancer J Clin. 61 (3), 183-203 (2011).</li><li>Morgan, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer.+Clinical+practice+guidelines+in+oncology.">Ovarian cancer. Clinical practice guidelines in oncology.</a> J Natl Compr Canc Netw. 6 (8), 766-794 (2008).</li><li>Nieman, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocytes+promote+ovarian+cancer+metastasis+and+provide+energy+for+rapid+tumor+growth.">Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth.</a> Nat Med. 17 (11), 1498-1503 (2011).</li><li>Motohara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolving+story+of+the+metastatic+voyage+of+ovarian+cancer+cells:+cellular+and+molecular+orchestration+of+the+adipose-rich+metastatic+microenvironment.">An evolving story of the metastatic voyage of ovarian cancer cells: cellular and molecular orchestration of the adipose-rich metastatic microenvironment.</a> Oncogene. 38 (16), 2885-2898 (2019).</li><li>Di Nicola, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omentum+a+powerful+biological+source+in+regenerative+surgery.">Omentum a powerful biological source in regenerative surgery.</a> Regen Ther. 11, 182-191 (2019).</li><li>Meza-Perez, S., Randall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+functions+of+the+omentum.">Immunological functions of the omentum.</a> Trends Immunol. 38 (7), 526-536 (2017).</li><li>Liu, M., Silva-Sanchez, A., Randall, T. D., Meza-Perez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+immune+responses+in+the+peritoneal+cavity+and+omentum.">Specialized immune responses in the peritoneal cavity and omentum.</a> J Leukoc Biol. 109 (4), 717-729 (2021).</li><li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+facilitate+ovarian+cancer+premetastatic+niche+formation+in+the+omentum.">Neutrophils facilitate ovarian cancer premetastatic niche formation in the omentum.</a> J Exp Med. 216 (1), 176-194 (2019).</li><li>Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+microenvironment+promotes+Bclxl+expression+and+confers+chemoresistance+in+ovarian+cancer+cells.">Adipocyte microenvironment promotes Bclxl expression and confers chemoresistance in ovarian cancer cells.</a> Apoptosis. 22 (4), 558-569 (2017).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+adipocytes:+key+players+in+breast+cancer+progression.">Cancer-associated adipocytes: key players in breast cancer progression.</a> J Hematol Oncol. 12 (1), 95 (2019).</li><li>Zhang, Z., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue:+The+dysfunctional+adipocyte+-+a+cancer+cell's+best+friend.">Adipose tissue: The dysfunctional adipocyte - a cancer cell's best friend.</a> Nat Rev Endocrinol. 14 (3), 132-134 (2018).</li><li>Alvero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRX-E-002-1+Induces+c-Jun-dependent+apoptosis+in+ovarian+cancer+stem+cells+and+prevents+recurrence+in+vivo.">TRX-E-002-1 Induces c-Jun-dependent apoptosis in ovarian cancer stem cells and prevents recurrence in vivo.</a> Mol Cancer Ther. 15 (6), 1279-1290 (2016).</li><li>Alvero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+for+the+detection+of+intraperitoneal+micrometastasis+using+an+ovarian+cancer+mouse+model.">Novel approach for the detection of intraperitoneal micrometastasis using an ovarian cancer mouse model.</a> Sci Rep. 7, 40989 (2017).</li><li>Craveiro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+modifications+in+ovarian+cancer+stem+cells+following+Paclitaxel+treatment.">Phenotypic modifications in ovarian cancer stem cells following Paclitaxel treatment.</a> Cancer Med. 2 (6), 751-762 (2013).</li><li>Sumi, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+for+non-invasive+imaging+to+detect+and+monitor+ovarian+cancer+recurrence.">Murine model for non-invasive imaging to detect and monitor ovarian cancer recurrence.</a> J Vis Exp. (93), e51815 (2014).</li><li>Agarwal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+migration+inhibitory+factor+expression+in+ovarian+cancer.">Macrophage migration inhibitory factor expression in ovarian cancer.</a> Am J Obstet Gynecol. 196 (4), 348.e1-348.e5 (2007).</li><li>Kelly, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-4+signaling+promotes+tumor+growth+and+paclitaxel+chemoresistance+in+ovarian+cancer.">TLR-4 signaling promotes tumor growth and paclitaxel chemoresistance in ovarian cancer.</a> Cancer Res. 66 (7), 3859-3868 (2006).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBX7+binds+the+E-box+to+inhibit+TWIST-1+function+and+inhibit+tumorigenicity+and+metastatic+potential.">CBX7 binds the E-box to inhibit TWIST-1 function and inhibit tumorigenicity and metastatic potential.</a> Oncogene. 39 (20), 3965-3979 (2020).</li><li>Tedja, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+epithelial-mesenchymal+hybrid+cancer+cells+with+tumorigenic+potential.">Generation of stable epithelial-mesenchymal hybrid cancer cells with tumorigenic potential.</a> Cancers (Basel). 15 (3), 15030684 (2023).</li><li>Dauleh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+cultured+mesothelial+cells+derived+from+the+murine+adult+omentum.">Characterisation of cultured mesothelial cells derived from the murine adult omentum.</a> PLoS One. 11 (7), e0158997 (2016).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

באמצעות פרוטוקול זה, פותח מודל פרה-קליני של קרצינומטוזיס פריטוניאלי לסרטן השחלות תוך שימוש בשילוב של טכניקות בסיסיות במבחנה ואקס ויוו. גידול גידול מתקדם נצפה לאורך 50 יום של תרבית משותפת לאחר זריעת דגימות omentum עם mCherry+ OCSC1-F2 תאי סרטן שחלות אנושיים. שיטה זו פותחה ועברה אופטימיזציה ב?...

סרטן השחלות הוא הממאירות הגינקולוגית הקטלנית ביותר בעולם1. הסיכון לכל החיים לפתח סרטן זה הוא כ -1 ל -70, כאשר הגיל החציוני של האבחנה הוא 63 שנים2. ממאירויות שחלות ראשוניות מסווגות היסטולוגית כאפיתל או לא אפיתל. סרטן שחלות אפיתל (EOC) מייצג מעל 90% מהגידולים, ותת-הסוג הנפוץ ביותר הוא קרצינומה סרוטית בדרגה גבוהה (HGSC), המהווה כ-70%-80% ממקרי EOC. נכון לעכשיו, אין שיטות סינון יעילות כדי לזהות מחלה מוקדם. אז רוב החולים מאובחנים בשלב מתקדם (כלומר, Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique [FIGO] שלב III או IV) לאחר שהסרטן התפשט בכל חלל הצפק2.
טיפול סטנדרטי בקו החזית הוא ניתוח ציטורדוקטיבי להסרת כל המחלה המקרוסקופית הנראית לעין, ואחריו כימותרפיה מבוססת פלטינה אדג'ובנטית כדי להרוס כל מחלה מיקרוסקופית שיורית. בעוד שבשני העשורים האחרונים חלה התקדמות רבה בטיפול בסרטן השחלות, כ-70% מהחולות עם מחלה מתקדמת יחזרו תוך 3 שנים מהטיפול3. בהתחשב בפרוגנוזה הגרועה הכוללת של חולים אלה, מאמצי מחקר תרגומיים מתמשכים ועתידיים ב- EOC שואפים לזהות סמנים ביולוגיים לגילוי מוקדם, למנוע גרורות, לשפר את הטיפולים הנוכחיים כדי להתחמק מעמידות ולפתח טיפולים מותאמים אישית חדשים לסרטן.
גרורות כלליות בתוך חלל הצפק והעמידות הכימותרפית הנלווית אליו הן שתיים מהמגבלות העיקריות לשיפור הטיפול בחולות עם סרטן השחלות 4,5. האומנטום, מבנה דמוי סינר שומני התלוי מהקיבה מעל המעיים, הוא האתר העיקרי של גרורות סרטן השחלות 6,7. בנוסף לתפקודו כמחסום פיזי, האומנטום הוכח כבעל יכולות התחדשות ואנגיוגניות ובעל פעילות חיסונית, אשר יחד מקדמים את כלי הדם, מאיצים ריפוי פצעים ומגבילים זיהום8. הוא מכיל ריכוז גבוה של תאי גזע שיכולים להתמיין לסוגי תאים שונים ויכולים לסייע בתיקון רקמות פגועות. omentum יכול להיות מודלק בתגובה לפציעה או זיהום, אשר מפעיל את ההגירה של תאים חיסוניים לאתר של פציעה9. תאי חיסון אלה משחררים גורמי גדילה ומולקולות אחרות המסייעות לקדם את התיקון וההתחדשות של רקמות פגועות. תאים חיסוניים, כגון מקרופאגים, לימפוציטים ותאי פלזמה, הממוקמים באומנטום הם מבנים המכונים "כתמים חלביים", האחראים על איתור ותקיפה של פתוגנים וויסות חסינות הצפק. כמו כן, הוכח כי האומנטום ממלא תפקיד בגרימת סבילות חיסונית10, שהיא היכולת של מערכת החיסון לסבול אנטיגנים עצמיים ולא לתקוף רקמות בריאות. עם זאת, אותן פעילויות הקשורות למערכת החיסון מעורבות גם בתגובות פתולוגיות, כגון צמיחת גידולים אומנטליים, גרורות ובריחה ממעקב חיסוני 9,11. מחקרים קודמים מהמעבדה שלנו ואחרים הדגימו תפקיד ייחודי ופעיל של מיקרו-סביבת השומן בעיכוב תגובות חיסוניות אנטי-גידוליות וברכישת עמידות לכימותרפיה12,13,14. למרבה הצער, יש לנו מידע מוגבל על המנגנונים התאיים והמולקולריים שבאמצעותם האומנטום מספק מיקרו-סביבה פרו-גידולית.
כדי להבין טוב יותר את יחסי הגומלין בין תאים סרטניים לבין האומנטום, פותחה מערכת תרבית תלת-ממדית המורכבת מתאי סרטן שחלות אנושיים וצמחי אומנטום שמקורם במטופלות. הפרוטוקול המתואר כאן מייצג מודל אקס ויו חדשני של קרצינומטוזיס פריטוניאלי. מודל זה מחקה את ההתקדמות הטבעית של גידולי סרטן השחלות ברקמה עשירה בשומן. המודל המוצע קל לייצור, זול ועשוי להיות ישים למחקרים תרגומיים בחקר סרטן השחלות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>329652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipets</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229010B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 Tissue Culture Flask</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Counter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9819000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 imager</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1043028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel</td>
			<td>Integra-Miltex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revolve microscope</td>
			<td>Echo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo model of ovarian cancer peritoneal metastasis using human omentum

סרטן השחלות הוא הממאירות הגינקולוגית הקטלנית ביותר. האומנטום ממלא תפקיד מפתח במתן מיקרו-סביבה תומכת לתאי סרטן שחלות גרורתיים, כמו גם אותות מודולריים חיסוניים המאפשרים סבילות לגידול. עם זאת, יש לנו מודלים מוגבלים המחקים באופן הדוק את האינטראקציה בין תאי סרטן השחלות ורקמות עשירות בשומן. כדי להבין עוד יותר את המנגנונים התאיים והמולקולריים שבאמצעותם האומנטום מספק מיקרו-סביבה פרו-גידולית, פיתחנו מודל 3D ex vivo ייחודי של אינטראקציה בין תאים סרטניים לאומנטום (omentum). באמצעות אומנטום אנושי, אנו מסוגלים לגדל תאי סרטן שחלות בתוך מיקרו-סביבה עשירה בשומן זו ולנטר את הגורמים האחראים לצמיחת הגידול ולוויסות מערכת החיסון. בנוסף למתן פלטפורמה לחקר מיקרו-סביבה סרטנית עשירה בשומן, המודל מספק פלטפורמה מצוינת לפיתוח והערכה של גישות טיפוליות חדשניות למיקוד תאי סרטן גרורתיים בנישה זו. המודל המוצע קל ליצור, זול וישים לחקירות תרגומיות.

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy worldwide1. The lifetime risk of developing this cancer is approximately 1 in 70, with the median age of diagnosis at 63 years old2. Primary ovarian malignancies are classified histologically as either epithelial or non-epithelial. Epithelial ovarian cancers (EOC) represent over 90% of tumors, and the most common subtype is high-grade serous carcinoma (HGSC), which accounts for approximately 70%-80% of EOCs. Currently, there are no effective screening methods to detect disease early. So most patients are diagnosed at an advanced stage (i.e., F&#233;d&#233;ration Internationale de Gyn&#233;cologie et d&#39;Obst&#233;trique [FIGO] stage III or IV) after the cancer has spread throughout the peritoneal cavity2.
Standard frontline treatment is cytoreductive surgery to remove all visible macroscopic disease, followed by adjuvant platinum-based chemotherapy to destroy any residual microscopic disease. While there have been many advances in ovarian cancer treatment over the last two decades, approximately 70% of patients with advanced disease will relapse within 3 years of treatment3. Given the overall poor prognosis of these patients, ongoing and future translational research efforts in EOC aim to identify biomarkers for early detection, prevent metastasis, improve current therapies to evade resistance and develop new personalized cancer treatments.
Generalized metastasis within the peritoneal cavity and its associated chemoresistance are two of the major limitations for the improvement of the treatment of patients with ovarian cancer4,5. The omentum, a fatty apron-like structure that hangs down from the stomach over the intestines, is a main site of ovarian cancer metastasis6,7. In addition to its function as a physical barrier, the omentum has been shown to have regenerative and angiogenic capacities and possess immune activities, which together promote vascularization, accelerate wound healing, and limit infection8. It contains a high concentration of stem cells that can differentiate into various cell types and can help repair damaged tissues. The omentum can become inflamed in response to injury or infection, which triggers the migration of immune cells to the site of injury9. These immune cells release growth factors and other molecules that help to promote the repair and regeneration of damaged tissue. Immune cells, such as macrophages, lymphocytes, and plasma cells, localized in the omentum are structures known as &#34;milky spots&#34;, which are responsible for detecting and attacking pathogens and regulating peritoneal immunity. The omentum has also been shown to play a role in inducing immune tolerance10, which is the ability of the immune system to tolerate self-antigens and not attack healthy tissues. However, the same immune-related activities are also involved in pathological responses, such as the growth of omental tumors, metastasis, and escape of immune surveillance9,11. Previous studies from our lab and others have demonstrated a unique and active role of the adipose microenvironment in the inhibition of anti-tumoral immune responses and in the acquisition of chemoresistance12,13,14. Unfortunately, we have limited information on the cellular and molecular mechanisms by which the omentum provides a pro-tumoral microenvironment.
To better understand the interactions between cancer cells and the omentum, a 3D culture system consisting of human ovarian cancer cells and patient-derived omentum explants was developed. The protocol described here represents a novel ex vivo model of peritoneal carcinomatosis. This model mimics the natural progression of ovarian cancer tumorigenesis in this adipose-rich tissue. The proposed model is easy to generate, inexpensive, and potentially applicable to translational investigations in ovarian cancer research.

מחבר זרקור: מודל מתקדם Ex Vivo לחקר אינטראקציה בין סרטן לשומן מיקרו-סביבה 

מודל Ex Vivo של סרטן השחלות גרורות פריטוניאליות באמצעות Omentum אנושי

Current studies use co-culture systems comprised of isolated adipocytes and ovarian cancer cells. These adipocytes are differentiated in vitro from pre adipocytes. These cells are then separated through a transwell insert and therefore lack direct cell to cell contact.This ex vivo culture method offers a model to study the direct interaction of cancer cells with the adipose microenvironment. Our model preserves the structure of the human momentum and therefore maintains the various cell types that are typically in this organ. In addition to adipocytes, these cells include supporting fibroblasts as well as immune cells.This model also maintains these cells in their inherent matrix. This model provides an excellent platform for the development and evaluation of novel therapeutic approaches to target metastatic cancer cells in this niche.

התבססות מוצלחת של תאי סרטן השחלות לתוך דגימות omentum נראתה בערך ביום ה-14 (איור 3A-C). לפחות 24 עותקים משוכפלים הוכנו והוזרקו לכל דגימה שנאספה כדי לאפשר ניסויים נוספים. צמיחת הגידול נוטרה על-ידי צילום תמונות פלואורסצנטיות (איור 3D,E). תמונ...

Watch this Scientific Journal Video about Advanced Ex Vivo Model for Investigating Cancer-Adipose Microenvironment Interaction at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר את הקמתו של מודל אקס ויו תלת-ממדי (3D) של אינטראקציה בין תאים סרטניים ל-omentum. המודל מספק פלטפורמה להבהרת מנגנונים מעודדי גידול בתוך נישת השומן ולבדיקת טיפולים חדשניים.

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian ...

מחקרים עכשוויים משתמשים במערכות תרבית משותפת המורכבות מאדיפוציטים מבודדים ותאי סרטן השחלות. אדיפוציטים אלה נבדלים במבחנה מקדם-אדיפוציטים. תאים אלה מופרדים לאחר מכן באמצעות החדרת טרנסוול ולכן חסרים מגע ישיר בין תא לתא.שיטת תרבית ex vivo זו מציעה מודל לחקר האינטראקציה הישירה של תאים סרטניים עם מיקרו-סביבת השומן. המודל שלנו משמר את מבנה התנע האנושי ולכן שומר על סוגי התאים השונים שנמצאים בדרך כלל באיבר זה. בנוסף לאדיפוציטים, תאים אלה כוללים תמיכה בפיברובלסטים כמו גם בתאי מערכת החיסון.מודל זה גם שומר על תאים אלה במטריצה הטבועה בהם. מודל זה מספק פלטפורמה מצוינת לפיתוח והערכה של גישות טיפוליות חדשניות למיקוד תאי סרטן גרורתיים בנישה זו.

an-ex-vivo-model-ovarian-cancer-peritoneal-metastasis-using-human

Research

JoVE Journal

Cancer Research

An Ex Vivo Model of Ovarian Cancer Peritoneal Metastasis Using Human Omentum

1.6K Views.  Karmanos Cancer Institute. מחקרים עכשוויים משתמשים במערכות תרבית משותפת המורכבות מאדיפוציטים מבודדים ותאי סרטן השחלות. אדיפוציטים אלה נבדלים במבחנה מקדם-אדיפוציטים. תאים אלה מופרדים לאחר מכן באמצעות החדרת טרנסוול ולכן חסרים מגע ישיר בין תא לתא.שיטת תרבית ex vivo זו מציעה מודל לחקר האינטראקציה היש...

Video: מחבר זרקור: מודל מתקדם Ex Vivo לחקר אינטראקציה בין סרטן לשומן מיקרו-סביבה 

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian cancer cells as well as immune modulatory signals that allow tumor tolerance. However, we have limited models that closely mimic the interaction between ovarian cancer cells and adipose-rich tissues. To further understand the cellular and molecular mechanisms by which the omentum provides a pro-tumoral microenvironment, we developed a unique 3D ex vivo model of cancer cell-omentum interaction. Using human omentum, we are able to grow ovarian cancer cells within this adipose-rich microenvironment and monitor the factors responsible for tumor growth and immune regulation. In addition to providing a platform for the study of this adipose-rich tumor microenvironment, the model provides an excellent platform for the development and evaluation of novel therapeutic approaches to target metastatic cancer cells in this niche. The proposed model is easy to generate, inexpensive, and applicable to translational investigations.

This protocol describes the establishment of a three-dimensional (3D) ex vivo model of cancer cell-omentum interaction. The model provides a platform for elucidating pro-tumor mechanisms within the adipose niche and for testing novel therapies.