Este estudio está financiado en parte por la Fundación Janet Burros Memorial. Agradecemos a las pacientes y al Departamento de Oncología Ginecológica del Instituto Oncológico Karmanos por la recolección de muestras de epiplón. También reconocemos al Biobanco y al Núcleo de Ciencias Correlativas del Instituto Oncológico Karmanos por la coordinación del reclutamiento de pacientes y la preparación de las diapositivas de patología. El Biobanco y el Núcleo de Ciencias Correlativas están financiados en parte por la subvención P30 del Centro de los NIH CA22453 al Instituto de Cáncer Karmanos de la Universidad Estatal de Wayne.

El siguiente protocolo de investigación fue revisado y aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad Estatal de Wayne. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes antes de la cirugía. La figura 1 ilustra los tres pasos generales de este protocolo.
1. Preparación del tejido del epiplón humano
<ol><li>Preparar medios de cultivo de epiplón (DMEM/F12 + 10% de suero fetal bovino + 1% de penicilina-estreptomicina) y conservar a 4 °C. Alícuota 30-40 mL de este medio en un tubo cónico estéril de 50 mL o en un recipiente de muestras quirúrgicas.</li>
	<li>Obtener muestras quirúrgicas de una biopsia de epiplón o de una cirugía de omentectomía. Sumerja la muestra estéril en un medio de cultivo de epiplón inmediatamente después de la extracción en el quirófano. Si el flujo de trabajo no lo permite, coloque la muestra en un medio de cultivo de epiplón lo antes posible. Transfiera la muestra colocándola en hielo y guárdela a 4 °C hasta su procesamiento. NOTA: El tamaño de la muestra de epiplón extraída determinará la cantidad de tejido trabajable.</li>
	<li>Procese la muestra de epiplón dentro de 1-2 h después de la recolección utilizando una campana de flujo laminar. Asegúrese de que todos los materiales y herramientas estén estériles o esterilizados.</li>
	<li>Retire el epiplón del recipiente de recolección y transfiéralo a una placa de cultivo de 100 mm. Sumerja la muestra en 1 solución salina tamponada con fosfato (1 PBS) y lave suavemente la muestra para eliminar cualquier coágulo de sangre o desecho.</li>
	<li>Cortar el tejido en trozos (0,5 cm x 0,5 cm o 100-200 mg; Figura 2A) utilizando unas tijeras quirúrgicas pequeñas o un bisturí de 10-15 mm. Use pinzas quirúrgicas pequeñas para ayudar a manipular el tejido y evitar aplastar el epiplón. Si se utilizó un dispositivo de energía para extirpar quirúrgicamente la muestra de epiplón, evite usar el tejido distorsionado en el borde sellado.</li>
	<li>Coloque cada pieza de epiplón cortada en pocillos individuales de una placa de cultivo de 24 pocillos y llene los pocillos con 500 μL de medio de cultivo de epiplón o hasta un volumen que sea suficiente para cubrir el epiplón sin permitir que la pieza de epiplón flote sobre el piso del pocillo (Figura 2B).</li>
	<li>Almacenar los trozos de epiplón en medios de cultivo frescos a 4 °C hasta que estén listos para la inyección.</li>
</ol>2. Preparación de células de cáncer de ovario
<ol><li>Cultivar células de cáncer de ovario humano en un matraz de cultivo de 75cm2 a 37 °C y 5% de CO2 a al menos 75% de confluencia el día de la recolección del epiplón. NOTA: Este protocolo utiliza células de cáncer de ovario humano OCSC1-F2 mCherry positivas descritas anteriormente15,16,17,18. Se puede modificar a cualquier línea celular cancerosa marcada con una señal de fluorescencia.</li>
	<li>Prepare las células dentro de una campana de flujo laminar inmediatamente después de la recolección de la muestra de epiplón. Asegúrese de que todos los materiales y herramientas estén estériles o esterilizados.</li>
	<li>Añadir 10 ml de 1x PBS estéril al matraz de cultivo y lavar las células meciendo suavemente el matraz. Retire el PBS 1x y luego agregue 3 ml de tripsina-EDTA al 0,05%.</li>
	<li>Meca suavemente el matraz de cultivo para cubrir todas las células y, a continuación, colóquelo en una incubadora (37 °C y 5% de CO2) durante no más de 5 minutos. Golpee el matraz de cultivo para separar completamente las células y luego neutralice la tripsina agregando 3 ml de medio de cultivo de epiplón.</li>
	<li>Mezcle la suspensión celular pipeteando y luego transfiera la suspensión a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar la suspensión durante 5 min a 1.200 x g a 24 °C. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 6 ml de medio de cultivo de epiplón fresco.</li>
	<li>Cuente las células con un hemacitómetro. Diluir la suspensión celular a al menos 100.000 células por cada 100-200 μL de suspensión. Este es el volumen de inyección en cada pieza cortada de epiplón.</li>
	<li>Transfiera un número adecuado de células a un nuevo matraz de cultivo para continuar el paso de las células.</li>
</ol>3. Inyección de células de cáncer de ovario
<ol><li>Use una jeringa de 1 ml para extraer la suspensión celular y luego coloque una aguja de 26 G. No extraiga la suspensión celular con la aguja, ya que esto puede fragmentar las células.</li>
	<li>Use unas pinzas quirúrgicas pequeñas para levantar un pedazo de epiplón cortado. Transfiera el epiplón a un plato estéril de trabajo separado para facilitar la inyección. Perforar suavemente el epiplón con la punta de la aguja e inyectar un pequeño volumen de suspensión celular en el tejido (Figura 2C).</li>
	<li>Repita la inyección en varias áreas de epiplón hasta un volumen total de al menos 100 μL o 100.000 células. Tenga en cuenta que gran parte de la suspensión celular puede parecer que se acumula alrededor del espécimen. Si existe preocupación con respecto a la calidad de la inyección, repita la inyección o inyecte un volumen mayor de suspensión celular en la muestra.</li>
	<li>Regrese las muestras de epiplón inyectadas a cada pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos. Tenga en cuenta que el volumen de los medios de cultivo de epiplón está a un nivel que cubre el epiplón sin permitir que flote. Manipule con cuidado la placa y colóquela dentro de una incubadora (37 °C y 5% de CO2).</li>
	<li>OPCIONAL: Use Matrigel (matriz de membrana basal) para suspender el tejido del epiplón en una matriz sólida para permitir una inyección más fácil y una administración de suspensión celular más concentrada.<ol><li>Descongelar la matriz de la membrana basal a 4 °C y mezclar en una proporción de 1:1 con medios de cultivo de epiplón inmediatamente antes de su uso. Almacenar la mezcla de la matriz de membrana basal en hielo o a 4 °C hasta la inyección. Llene los pozos vacíos con suficiente mezcla de matriz de membrana basal para sumergir un trozo cortado de epiplón.</li>
		<li>Coloque las muestras en la mezcla de matriz de membrana basal y luego coloque la placa de cultivo de 24 pocillos en una incubadora (37 °C y 5% de CO2) durante 20 min. Una vez que la mezcla se haya solidificado, continúe con la inyección como se describió anteriormente.</li>
	</ol></li>
	<li>Confirme que la inyección se ha realizado correctamente mediante imágenes fluorescentes. Asegúrese de que se visualice una raya de señal fluorescente en los sitios de inyección (Figura 2D). Tenga en cuenta que el número real de células adheridas al epiplón después de la inyección es impredecible.</li>
</ol>4. Cocultivo de epiplón humano y células de cáncer de ovario
<ol><li>Cambie el medio cada 48-72 h añadiendo 500-2000 μL de medio de cultivo de epiplón fresco. No pipetee los medios directamente sobre el tejido del epiplón, ya que esto puede desplazar las células cancerosas. Tenga en cuenta que si el color del medio cambia a amarillo, cambie el medio. NOTA: La frecuencia del cambio de medio dependerá del volumen de medios utilizados y de la trayectoria de crecimiento de las células cancerosas. Una vez que las células cancerosas han sembrado el epiplón, ya no es importante si el fragmento de epiplón está flotando o no.</li>
	<li>OPCIONAL: Si se utilizara una matriz de membrana basal, la matriz normalmente se disolvería en el momento del primer cambio de medio.</li>
	<li>Monitorear el crecimiento de los tumores de cáncer de ovario mediante imágenes fluorescentes. La frecuencia de las imágenes queda a discreción del investigador. Anticipe la evidencia de tumores pequeños a los 14 días (Figura 3A-C). Los resultados pueden variar dependiendo de la calidad de la inyección.</li>
	<li>Finalice el experimento en función del punto de conexión del experimento. NOTA: Se ha observado crecimiento tumoral e integridad del tejido epiplático después de 50 días.</li>
</ol>

Establecimiento de un modelo 3D ex vivo para la interacción entre el cáncer de ovario y el epiplón

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).</li><li>Berek, J. S., Renz, M., Kehoe, S., Kumar, L., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+of+the+ovary,+fallopian+tube,+and+peritoneum:+2021+update.">Cancer of the ovary, fallopian tube, and peritoneum: 2021 update.</a> Int J Gynaecol Obstet. 155 (Suppl 1), 61-85 (2021).</li><li>Ledermann, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+diagnosed+and+relapsed+epithelial+ovarian+carcinoma:+ESMO+clinical+practice+guidelines+for+diagnosis,+treatment+and+follow-up.">Newly diagnosed and relapsed epithelial ovarian carcinoma: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Ann Oncol. 24 (Suppl 6), vi24-32 (2013).</li><li>Jelovac, D., Armstrong, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+diagnosis+and+treatment+of+ovarian+cancer.">Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer.</a> CA Cancer J Clin. 61 (3), 183-203 (2011).</li><li>Morgan, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer.+Clinical+practice+guidelines+in+oncology.">Ovarian cancer. Clinical practice guidelines in oncology.</a> J Natl Compr Canc Netw. 6 (8), 766-794 (2008).</li><li>Nieman, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocytes+promote+ovarian+cancer+metastasis+and+provide+energy+for+rapid+tumor+growth.">Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth.</a> Nat Med. 17 (11), 1498-1503 (2011).</li><li>Motohara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolving+story+of+the+metastatic+voyage+of+ovarian+cancer+cells:+cellular+and+molecular+orchestration+of+the+adipose-rich+metastatic+microenvironment.">An evolving story of the metastatic voyage of ovarian cancer cells: cellular and molecular orchestration of the adipose-rich metastatic microenvironment.</a> Oncogene. 38 (16), 2885-2898 (2019).</li><li>Di Nicola, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omentum+a+powerful+biological+source+in+regenerative+surgery.">Omentum a powerful biological source in regenerative surgery.</a> Regen Ther. 11, 182-191 (2019).</li><li>Meza-Perez, S., Randall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+functions+of+the+omentum.">Immunological functions of the omentum.</a> Trends Immunol. 38 (7), 526-536 (2017).</li><li>Liu, M., Silva-Sanchez, A., Randall, T. D., Meza-Perez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+immune+responses+in+the+peritoneal+cavity+and+omentum.">Specialized immune responses in the peritoneal cavity and omentum.</a> J Leukoc Biol. 109 (4), 717-729 (2021).</li><li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+facilitate+ovarian+cancer+premetastatic+niche+formation+in+the+omentum.">Neutrophils facilitate ovarian cancer premetastatic niche formation in the omentum.</a> J Exp Med. 216 (1), 176-194 (2019).</li><li>Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+microenvironment+promotes+Bclxl+expression+and+confers+chemoresistance+in+ovarian+cancer+cells.">Adipocyte microenvironment promotes Bclxl expression and confers chemoresistance in ovarian cancer cells.</a> Apoptosis. 22 (4), 558-569 (2017).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+adipocytes:+key+players+in+breast+cancer+progression.">Cancer-associated adipocytes: key players in breast cancer progression.</a> J Hematol Oncol. 12 (1), 95 (2019).</li><li>Zhang, Z., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue:+The+dysfunctional+adipocyte+-+a+cancer+cell's+best+friend.">Adipose tissue: The dysfunctional adipocyte - a cancer cell's best friend.</a> Nat Rev Endocrinol. 14 (3), 132-134 (2018).</li><li>Alvero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRX-E-002-1+Induces+c-Jun-dependent+apoptosis+in+ovarian+cancer+stem+cells+and+prevents+recurrence+in+vivo.">TRX-E-002-1 Induces c-Jun-dependent apoptosis in ovarian cancer stem cells and prevents recurrence in vivo.</a> Mol Cancer Ther. 15 (6), 1279-1290 (2016).</li><li>Alvero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+for+the+detection+of+intraperitoneal+micrometastasis+using+an+ovarian+cancer+mouse+model.">Novel approach for the detection of intraperitoneal micrometastasis using an ovarian cancer mouse model.</a> Sci Rep. 7, 40989 (2017).</li><li>Craveiro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+modifications+in+ovarian+cancer+stem+cells+following+Paclitaxel+treatment.">Phenotypic modifications in ovarian cancer stem cells following Paclitaxel treatment.</a> Cancer Med. 2 (6), 751-762 (2013).</li><li>Sumi, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+for+non-invasive+imaging+to+detect+and+monitor+ovarian+cancer+recurrence.">Murine model for non-invasive imaging to detect and monitor ovarian cancer recurrence.</a> J Vis Exp. (93), e51815 (2014).</li><li>Agarwal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+migration+inhibitory+factor+expression+in+ovarian+cancer.">Macrophage migration inhibitory factor expression in ovarian cancer.</a> Am J Obstet Gynecol. 196 (4), 348.e1-348.e5 (2007).</li><li>Kelly, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-4+signaling+promotes+tumor+growth+and+paclitaxel+chemoresistance+in+ovarian+cancer.">TLR-4 signaling promotes tumor growth and paclitaxel chemoresistance in ovarian cancer.</a> Cancer Res. 66 (7), 3859-3868 (2006).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBX7+binds+the+E-box+to+inhibit+TWIST-1+function+and+inhibit+tumorigenicity+and+metastatic+potential.">CBX7 binds the E-box to inhibit TWIST-1 function and inhibit tumorigenicity and metastatic potential.</a> Oncogene. 39 (20), 3965-3979 (2020).</li><li>Tedja, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+epithelial-mesenchymal+hybrid+cancer+cells+with+tumorigenic+potential.">Generation of stable epithelial-mesenchymal hybrid cancer cells with tumorigenic potential.</a> Cancers (Basel). 15 (3), 15030684 (2023).</li><li>Dauleh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+cultured+mesothelial+cells+derived+from+the+murine+adult+omentum.">Characterisation of cultured mesothelial cells derived from the murine adult omentum.</a> PLoS One. 11 (7), e0158997 (2016).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Utilizando este protocolo, se desarrolló un modelo preclínico de carcinomatosis peritoneal para el cáncer de ovario utilizando una combinación de técnicas básicas in vitro y ex vivo. Se observó un crecimiento tumoral progresivo a lo largo de 50 días de cocultivo después de sembrar muestras de epiplón con células de cáncer de ovario humano mCherry+ OCSC1-F2. Este método fue desarrollado y optimizado a través de varios ensayos experimentales utilizando diferentes especímenes de epiplón. El...

El cáncer de ovario es la neoplasia maligna ginecológica más mortal en todo el mundo1. El riesgo de por vida de desarrollar este cáncer es de aproximadamente 1 en 70, con una mediana de edad de diagnóstico de 63 años2. Las neoplasias malignas primarias de ovario se clasifican histológicamente como epiteliales o no epiteliales. Los cánceres epiteliales de ovario (COE) representan más del 90% de los tumores, y el subtipo más común es el carcinoma seroso de alto grado (HGSC), que representa aproximadamente el 70-80% de los COE. En la actualidad, no existen métodos de cribado eficaces para detectar la enfermedad de forma precoz. Por lo tanto, la mayoría de los pacientes son diagnosticados en una etapa avanzada (es decir, la Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique [FIGO] etapa III o IV) después de que el cáncer se ha diseminado por toda la cavidad peritoneal2.
El tratamiento estándar de primera línea es la cirugía citorreductora para extirpar toda la enfermedad macroscópica visible, seguida de quimioterapia adyuvante basada en platino para destruir cualquier enfermedad microscópica residual. Si bien ha habido muchos avances en el tratamiento del cáncer de ovario en las últimas dos décadas, aproximadamente el 70% de las pacientes con enfermedad avanzada recaerán dentro de los 3 años posterioresal tratamiento. Dado el mal pronóstico general de estos pacientes, los esfuerzos de investigación traslacional en curso y futuros en EOC tienen como objetivo identificar biomarcadores para la detección temprana, prevenir la metástasis, mejorar las terapias actuales para evadir la resistencia y desarrollar nuevos tratamientos personalizados contra el cáncer.
La metástasis generalizada dentro de la cavidad peritoneal y su quimiorresistencia asociada son dos de las principales limitaciones para la mejora del tratamiento de las pacientes con cáncer de ovario 4,5. El epiplón, una estructura grasosa parecida a un delantal que cuelga desde el estómago sobre los intestinos, es un sitio principal de metástasis de cáncer de ovario 6,7. Además de su función como barrera física, se ha demostrado que el epiplón tiene capacidades regenerativas y angiogénicas y posee actividades inmunitarias, que en conjunto promueven la vascularización, aceleran la cicatrización de heridas y limitan la infección8. Contiene una alta concentración de células madre que pueden diferenciarse en varios tipos de células y pueden ayudar a reparar los tejidos dañados. El epiplón puede inflamarse en respuesta a una lesión o infección, lo que desencadena la migración de las células inmunitarias al sitio dela lesión. Estas células inmunitarias liberan factores de crecimiento y otras moléculas que ayudan a promover la reparación y regeneración del tejido dañado. Las células inmunitarias, como los macrófagos, los linfocitos y las células plasmáticas, localizadas en el epiplón son estructuras conocidas como "manchas lechosas", que se encargan de detectar y atacar a los patógenos y de regular la inmunidad peritoneal. También se ha demostrado que el epiplón desempeña un papel en la inducción de la tolerancia inmunitaria10, que es la capacidad del sistema inmunitario para tolerar los autoantígenos y no atacar los tejidos sanos. Sin embargo, las mismas actividades relacionadas con el sistema inmunitario también están involucradas en las respuestas patológicas, como el crecimiento de tumores de epiplón, la metástasis y el escape de la vigilancia inmune 9,11. Estudios previos de nuestro laboratorio y de otros han demostrado un papel único y activo del microambiente adiposo en la inhibición de las respuestas inmunes antitumorales y en la adquisición de quimiorresistencia12,13,14. Desafortunadamente, tenemos información limitada sobre los mecanismos celulares y moleculares por los cuales el epiplón proporciona un microambiente protumoral.
Para comprender mejor las interacciones entre las células cancerosas y el epiplón, se desarrolló un sistema de cultivo en 3D que consiste en células de cáncer de ovario humano y explantes de epiplón derivados de pacientes. El protocolo descrito aquí representa un nuevo modelo ex vivo de carcinomatosis peritoneal. Este modelo imita la progresión natural de la tumorigénesis del cáncer de ovario en este tejido rico en adiposo. El modelo propuesto es fácil de generar, económico y potencialmente aplicable a las investigaciones traslacionales en la investigación del cáncer de ovario.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>329652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipets</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229010B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 Tissue Culture Flask</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Counter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9819000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 imager</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1043028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel</td>
			<td>Integra-Miltex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revolve microscope</td>
			<td>Echo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo model of ovarian cancer peritoneal metastasis using human omentum

El cáncer de ovario es la neoplasia maligna ginecológica más mortal. El epiplón desempeña un papel clave en la provisión de un microambiente de apoyo a las células de cáncer de ovario metastásico, así como señales inmunomoduladoras que permiten la tolerancia tumoral. Sin embargo, tenemos modelos limitados que imitan de cerca la interacción entre las células de cáncer de ovario y los tejidos ricos en tejido adiposo. Para comprender mejor los mecanismos celulares y moleculares por los cuales el epiplón proporciona un microambiente protumoral, desarrollamos un modelo único ex vivo en 3D de la interacción entre la célula cancerosa y el epiplón. Utilizando epiplón humano, podemos cultivar células de cáncer de ovario dentro de este microambiente rico en tejido adiposo y controlar los factores responsables del crecimiento tumoral y la regulación inmunitaria. Además de proporcionar una plataforma para el estudio de este microambiente tumoral rico en adiposo, el modelo proporciona una excelente plataforma para el desarrollo y la evaluación de nuevos enfoques terapéuticos para atacar las células cancerosas metastásicas en este nicho. El modelo propuesto es fácil de generar, económico y aplicable a investigaciones traslacionales.

El establecimiento exitoso de células de cáncer de ovario en especímenes de epiplón fue evidente alrededor del día 14 (Figura 3A-C). Se prepararon e inyectaron al menos 24 réplicas por espécimen recolectado para permitir una mayor experimentación. El crecimiento tumoral se monitorizó mediante la toma de imágenes fluorescentes (Figura 3D,E). Las imágenes tuvieron que ser interpretadas cuidadosamente, y...

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Autor destacado: Modelo ex vivo avanzado para investigar la interacción entre el cáncer y el microambiente adiposo 

Este protocolo describe el establecimiento de un modelo ex vivo tridimensional (3D) de la interacción entre la célula cancerosa y el epiplón. El modelo proporciona una plataforma para dilucidar los mecanismos protumorales dentro del nicho adiposo y para probar nuevas terapias.

Un modelo ex vivo de metástasis peritoneal de cáncer de ovario con epiplón humano

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian ...

Los estudios actuales utilizan sistemas de cocultivo compuestos por adipocitos aislados y células de cáncer de ovario. Estos adipocitos se diferencian in vitro de los preadipocitos. Estas células se separan a través de un inserto transpocillo y, por lo tanto, carecen de contacto directo de célula a célula.Este método de cultivo ex vivo ofrece un modelo para estudiar la interacción directa de las células cancerosas con el microambiente adiposo. Nuestro modelo preserva la estructura del momento humano y, por lo tanto, mantiene los diversos tipos de células que se encuentran típicamente en este órgano. Además de los adipocitos, estas células incluyen fibroblastos de soporte, así como células inmunitarias.Este modelo también mantiene estas células en su matriz inherente. Este modelo proporciona una excelente plataforma para el desarrollo y la evaluación de nuevos enfoques terapéuticos para atacar las células cancerosas metastásicas en este nicho.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

An Ex Vivo Model of Ovarian Cancer Peritoneal Metastasis Using Human Omentum

1.7K vistas.  Karmanos Cancer Institute. Los estudios actuales utilizan sistemas de cocultivo compuestos por adipocitos aislados y células de cáncer de ovario. Estos adipocitos se diferencian in vitro de los preadipocitos. Estas células se separan a través de un inserto transpocillo y, por lo tanto, carecen de contacto directo de célula a célula.Este método de cultivo ex vivo ofrece un modelo para estudiar la interacción directa de las células cancerosas con el microambiente adiposo. Nuestro modelo preserva la estruc...

Video: Autor destacado: Modelo ex vivo avanzado para investigar la interacción entre el cáncer y el microambiente adiposo 

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is important to control peritoneal dissemination. However, it is still unclear how tumor cells detach from primary lesions and attach to the mesothelium. The establishment of an appropriate animal model is needed to gain an understanding of the mechanism of peritoneal dissemination in vivo. In the current study, we introduce the process from the local injection of EOC cells into the murine ovarian surface to the development of metastasis, including the peritoneum and distant organs. Female nude mice (BALB/c nu/nu) at 8 weeks of age were used. Under a microscopic field of view, EOC cells (1 x 105 cells/&#181;l of medium-extracellular matrix (ECM)-based hydrogel/unilateral ovary/mouse) were injected into murine ovaries through a retroperitoneal approach from the dorsal flank. This proposed method is a less invasive procedure for the mouse and minimizes damage to the ovary. Here, we describe the methodological steps in the development of the original and metastatic tumor formation of EOC.

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

To clarify the multistep process of peritoneal dissemination of ovarian carcinoma, the current study presents a murine experimental model of original tumor development and peritoneal metastasis via orthotopic inoculation with these tumor cells.

Murino modelo experimental de desarrollo del tumor original y la metástasis peritoneal<em&gt; vía</em&gt; Ortotópico La inoculación con células de carcinoma de ovario

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm3. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.

Modelo In Vivo para Pruebas Efecto de la hipoxia sobre la metástasis tumoral

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Una inyección Modelo vena porta del hígado para estudiar la metástasis del cáncer de mama

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the tumor microenvironment and respond adequately to tumor antigens. The recent development of improved imaging approaches, such as 2-photon microscopy, and the use of powerful mouse tumor models have shed light on some of the mechanisms that regulate anti-tumor T cell activities. Whereas such systems have provided valuable insights, they do not always predict human responses. In human, our knowledge in the field mainly comes from a description of fixed tumor samples from human patients, as well as in vitro studies. However, in vitro models lack the complex three-dimensional tumor milieu and, therefore, are incomplete approximations of in vivo T cell activities. Fresh slices made from explanted tissue represent a complex multi-cellular tumor environment that can act as an important link between co-cultured studies and animal models. Originally set up in murine lymph nodes1 and previously described in a JoVE article2, this approach has now been transposed to human tumors to examine the dynamics of both plated3&#160;as well as resident&#160;T cells4.
Here, a protocol for the preparation of human lung tumor slices, immunostaining of resident CD8 T and tumor cells, and tracking of CD8 T lymphocytes within the tumor microenvironment using confocal microscopy is described. This system is uniquely placed to screen for novel immunotherapy agents favoring T cell migration in tumors.

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

This protocol describes a method to image resident tumor-infiltrating CD8 T cells labeled with fluorescently coupled antibodies within human lung tumor slices. This technique permits real-time analyses of CD8 T cell migration using confocal microscopy.

Ex Vivo Proyección de imagen de los linfocitos de T CD8 residente en Tumor de pulmón humano rebanadas utilizando Microscopía Confocal

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve microenvironment. This type of invasion is exhibited by a variety of cancer types, and very frequently is found in pancreatic cancer. The microscopic size of nerve fibers within mouse pancreas renders the study of PNI difficult in orthotopic murine models. Here, we describe a heterotopic in vivo model of PNI, where we inject syngeneic pancreatic cancer cell line Panc02-H7 into the murine sciatic nerve. In this model, sciatic nerves of anesthetized mice are exposed and injected with cancer cells. The cancer cells invade in the nerves proximally toward the spinal cord from the point of injection. The invaded sciatic nerves are then extracted and processed with OCT for frozen sectioning. H&amp;E and immunofluorescence staining of these sections allow quantification of both the degree of invasion and changes in protein expression. This model can be applied to a variety of studies on PNI given its versatility. Using mice with different genetic modifications and/or different types of cancer cells allows for investigation of the cellular and molecular mechanisms of PNI and for different cancer types. Furthermore, the effects of therapeutic agents on nerve invasion can be studied by applying treatment to these mice.

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

We describe an in vivo murine model of perineural invasion by injecting syngeneic pancreatic cancer cells into the sciatic nerve. The model allows for quantification of the extent of nerve invasion, and supports investigation of the cellular and molecular mechanisms of perineural invasion.

Un modelo de nervio ciático murinos In Vivo de invasión Perineural

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

Modelo de pez cebra de metástasis de neuroblastoma

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical outcomes. Preclinical mouse models of breast cancer brain metastatic (BCBM) growth are useful but are expensive, and it is difficult to track live cells and tumor cell invasion within the brain parenchyma. Presented here is a protocol for ex vivo brain slice cultures from xenografted mice containing intracranially injected breast cancer brain-seeking clonal sublines. MDA-MB-231BR luciferase tagged cells were injected intracranially into the brains of Nu/Nu female mice, and following tumor formation, the brains were isolated, sliced, and cultured ex vivo. The tumor slices were imaged to identify tumor cells expressing luciferase and monitor their proliferation and invasion in the brain parenchyma for up to 10 days. Further, the protocol describes the use of time-lapse microscopy to image the growth and invasive behavior of the tumor cells following treatment with ionizing radiation or chemotherapy. The response of tumor cells to treatments can be visualized by live-imaging microscopy, measuring bioluminescence intensity, and performing histology on the brain slice containing BCBM cells. Thus, this ex vivo slice model may be a useful platform for rapid testing of novel therapeutic agents alone or in combination with radiation to identify drugs personalized to target an individual patient&#39;s breast cancer brain metastatic growth within the brain microenvironment.

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

We introduce a protocol for measuring real-time drug and radiation response of breast cancer brain metastatic cells in an organotypic brain slice model. The methods provide a quantitative assay to investigate the therapeutic effects of various treatments on brain metastases from breast cancer in an ex vivo manner within the brain microenvironment interface.

Un modelo de corte de cerebro ex vivo para estudiar y atacar el crecimiento del tumor metastásico cerebral con cáncer de mama

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular diversity, as well as complex interactions between tumor microenvironments, can make finding effective treatments a challenge. Traditional adherent or sphere culture methods can mask such complexities, whereas three-dimensional organoid culture can recapitulate regional microenvironmental gradients. Organoids are a method of three-dimensional GBM culture that better mimics patient tumor architecture, contains phenotypically diverse cell populations, and can be used for medium-throughput experiments. Although three-dimensional organoid culture is more laborious and time-consuming compared to traditional culture, it offers unique benefits and can serve to bridge the gap between current in vitro and in vivo systems. Organoids have established themselves as invaluable tools in the arsenal of cancer biologists to better understand tumor behavior and mechanisms of resistance, and their applications only continue to grow. Here, details are provided about methods for generating and maintaining GBM organoids. Instructions of how to perform organoid sample embedding and sectioning using both frozen and paraffin-embedding techniques, as well as recommendations for immunohistochemistry and immunofluorescence protocols on organoid sections, and measurement of total organoid cell viability, are all also described.

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Here, we describe a method of generating glioblastoma (GBM) organoids from primary patient specimens or patient-derived cell cultures and maintaining them to maturity. These GBM organoids contain phenotypically diverse cell populations and recreate tumor microenvironments ex vivo.

Mantenimiento de la diversidad celular del glioblastoma humano ex vivo mediante cultivo de organoides tridimensionales

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites have been the gold standards for conditional or inducible gene targeting. To provide faster and more efficient experimental models, an ex vivo organoid culture system is developed using adenovirus Cre and normal urothelial cells carrying multiple loxP alleles of the tumor suppressors Trp53, Pten, and Rb1. Normal urothelial cells are enzymatically disassociated from four bladders of triple floxed mice (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). The urothelial cells are transduced ex vivo with adenovirus-Cre driven by a CMV promoter (Ad5CMVCre). The transduced bladder organoids are cultured, propagated, and characterized in vitro and in vivo. PCR is used to confirm gene deletions in Trp53, Pten, and Rb1. Immunofluorescence (IF) staining of organoids demonstrates positive expression of urothelial lineage markers (CK5 and p63). The organoids are injected subcutaneously into host mice for tumor expansion and serial passages. The immunohistochemistry (IHC) of xenografts exhibits positive expression of CK7, CK5, and p63 and negative expression of CK8 and Uroplakin 3. In summary, adenovirus-mediated gene deletion from mouse urothelial cells engineered with loxP sites is an efficient method to rapidly test the tumorigenic potential of defined genetic alterations.

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

This protocol describes the process of the generation and characterization of mouse urothelial organoids harboring deletions in genes of interest. The methods include harvesting mouse urothelial cells, ex vivo transduction with adenovirus driving Cre expression with a CMV promoter, and in vitro as well as in vivo characterization.

Ex Vivo Modelo organoide de deleciones genéticas mediadas por adenovirus-Cre en células uroteliales de ratón

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Intra-Cardiac Injection of Human Prostate Cancer Cells to Create a Bone Metastasis Xenograft Mouse Model

As the most common male malignancy, prostate cancer (PC) ranks second in mortality, primarily due to a 65%-75% bone metastasis rate. Therefore, it is essential to understand the process and related mechanisms of prostate cancer bone metastasis for developing new therapeutics. For this, an animal model of bone metastasis is an essential tool. Here, we report detailed procedures to generate a bone metastasis mouse model via intra-cardiac injection of prostate cancer cells. A bioluminescence imaging system can determine whether prostate cancer cells have been accurately injected into the heart and monitor cancer cell metastasis since it has great advantages in monitoring metastatic lesion development. This model replicates the natural development of disseminated cancer cells to form micro-metastases in the bone and imitates the pathological process of prostate cancer bone metastasis. It provides an effective tool for further exploration of the molecular mechanisms and the in vivo therapeutic effects of this disease.

Here, we present a protocol for the intra-cardiac injection of human prostate cancer cells to generate a mouse model with bone metastasis lesions.

Inyección intracardíaca de células de cáncer de próstata humano para crear un modelo de ratón xenoinjerto de metástasis ósea

As the most common male malignancy, prostate cancer (PC) ranks second in mortality, primarily due to a 65%-75% bone metastasis rate. Therefore, it is ...