Bu çalışma kısmen Janet Burros Memorial Vakfı tarafından finanse edilmektedir. Omentum örneklerinin toplanması için hastalara ve Karmanos Kanser Enstitüsü Jinekolojik Onkoloji Bölümü'ne teşekkür ederiz. Ayrıca, hasta alımının koordinasyonu ve patoloji slaytlarının hazırlanması için Karmanos Kanser Enstitüsü'ndeki Biobank ve Korelasyon Bilimleri Çekirdeği'ne de teşekkür ediyoruz. Biobank ve Correlative Sciences Core, kısmen NIH Center'ın Wayne State Üniversitesi'ndeki Karmanos Kanser Enstitüsü'ne verdiği P30 CA22453 tarafından desteklenmektedir.

Aşağıdaki araştırma protokolü, Wayne State Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Ameliyat öncesi tüm hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı. Şekil 1 , bu protokoldeki üç genel adımı göstermektedir.
1. İnsan omentum dokusunun hazırlanması
<ol><li>Omentum kültür ortamını hazırlayın (DMEM/F12 + %10 fetal sığır serumu + %1 penisilin-streptomisin) ve 4 °C'de saklayın. Bu ortamın 30-40 mL'sini steril bir 50 mL konik tüpe veya cerrahi numune kabına alın.</li>
	<li>Omental biyopsi veya omentektomi ameliyatından cerrahi örnekler alın. Steril numuneyi ameliyathanede çıkarıldıktan hemen sonra omentum kültür ortamına daldırın. İş akışı buna izin vermiyorsa, numuneyi mümkün olan en kısa sürede omentum kültür ortamına yerleştirin. Numuneyi buz üzerine koyarak aktarın ve işlenene kadar 4 °C'de saklayın. NOT: Çıkarılan omentum örneğinin boyutu, işlenebilir doku miktarını belirleyecektir.</li>
	<li>Omentum örneğini bir laminer akış başlığı kullanarak toplandıktan sonraki 1-2 saat içinde işleyin. Tüm malzemelerin ve aletlerin steril veya sterilize edildiğinden emin olun.</li>
	<li>Omentumu toplama kabından çıkarın ve 100 mm'lik bir kültür kabına aktarın. Numuneyi 1x fosfat tamponlu salin (1x PBS) içine daldırın ve kan pıhtılarını veya kalıntılarını gidermek için numuneyi nazikçe yıkayın.</li>
	<li>Dokuyu parçalara ayırın (0,5 cm x 0,5 cm veya 100-200 mg; Şekil 2A) küçük cerrahi makas veya 10-15 mm'lik bir neşter kullanarak. Dokuyu manipüle etmeye yardımcı olmak ve omentumun ezilmesini önlemek için küçük cerrahi forseps kullanın. Omentum örneğini cerrahi olarak çıkarmak için bir enerji cihazı kullanılmışsa, kapalı kenardaki çarpık dokuyu kullanmaktan kaçının.</li>
	<li>Her bir kesilmiş omentum parçasını 24 oyuklu bir kültür plakasının ayrı oyuklarına yerleştirin ve kuyucukları 500 μL omentum kültür ortamı ile veya omentum parçasının kuyu tabanının üzerinde yüzmesine izin vermeden omentumu kaplamaya yetecek bir hacme kadar doldurun (Şekil 2B).</li>
	<li>Omentum parçalarını enjeksiyona hazır olana kadar 4 °C'de taze kültür ortamında saklayın.</li>
</ol>2. Yumurtalık kanseri hücrelerinin hazırlanması
<ol><li>İnsan yumurtalık kanseri hücrelerini 75cm2'lik bir kültür şişesinde 37 ° C'de ve% 5 CO2 ila en az% 75 birleşme gününe kadar kültürleyin. NOT: Bu protokol, daha önceaçıklanan mCherry pozitif OCSC1-F2 insan yumurtalık kanseri hücrelerini kullanır 15,16,17,18. Bir floresan sinyali ile etiketlenmiş herhangi bir kanser hücresi hattına modifiye edilebilir.</li>
	<li>Omentum örneğinin toplanmasından hemen sonra hücreleri laminer akış başlığı içinde hazırlayın. Tüm malzemelerin ve aletlerin steril veya sterilize edildiğinden emin olun.</li>
	<li>Kültür şişesine 10 mL steril 1x PBS ekleyin ve şişeyi hafifçe sallayarak hücreleri yıkayın. 1x PBS'yi çıkarın ve ardından 3 mL% 0.05 Tripsin-EDTA ekleyin.</li>
	<li>Tüm hücreleri kaplamak için kültür şişesini hafifçe sallayın ve ardından şişeyi 5 dakikadan fazla olmamak üzere bir inkübatöre (37 °C ve %5 CO2) yerleştirin. Hücreleri tamamen ayırmak için kültür şişesine dokunun ve ardından 3 mL omentum kültür ortamı ekleyerek tripsini nötralize edin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu pipetleme ile karıştırın ve ardından süspansiyonu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Süspansiyonu 24 °C'de 1.200 x g'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 6 mL taze omentum kültürü ortamında yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın. Hücre süspansiyonunu 100-200 μL süspansiyon başına en az 100.000 hücreye seyreltin. Bu, kesilen her bir omentum parçasına enjeksiyon hacmidir.</li>
	<li>Hücre geçişine devam etmek için uygun sayıda hücreyi yeni bir kültür şişesine aktarın.</li>
</ol>3. Yumurtalık kanseri hücrelerinin enjeksiyonu
<ol><li>Hücre süspansiyonunu hazırlamak için 1 mL'lik bir şırınga kullanın, ardından 26 G'lik bir iğne takın. Hücreleri parçalayabileceğinden, iğneyi kullanarak hücre süspansiyonunu çizmeyin.</li>
	<li>Bir parça kesilmiş omentum almak için küçük cerrahi forseps kullanın. Enjeksiyonu kolaylaştırmak için omentumu ayrı bir çalışan steril kaba aktarın. Omentumu iğne ucuyla nazikçe delin ve dokuya küçük bir hacimde hücre süspansiyonu enjekte edin (Şekil 2C).</li>
	<li>En az 100 μL veya 100.000 hücrelik toplam hacme kadar birkaç omentum alanına enjeksiyonu tekrarlayın. Hücre süspansiyonunun çoğunun numunenin etrafında toplanmış gibi görünebileceğini unutmayın. Enjeksiyonun kalitesiyle ilgili endişeler varsa, enjeksiyonu tekrarlayın veya numuneye daha büyük hacimde hücre süspansiyonu enjekte edin.</li>
	<li>Enjekte edilen omentum örneklerini 24 oyuklu bir kültür plakasının her bir oyuğuna geri koyun. Omentum kültür ortamının hacminin, omentumun yüzmesine izin vermeden üzerini örtecek düzeyde olduğuna dikkat edin. Plakayı dikkatlice tutun ve bir inkübatörün içine yerleştirin (37 °C ve %5 CO2).</li>
	<li>İSTEĞE BAĞLI: Daha kolay enjeksiyon ve daha konsantre hücre süspansiyonu iletimi sağlamak için omentum dokusunu katı bir matriste askıya almak için Matrigel (bazal membran matrisi) kullanın.<ol><li>Bazal membran matrisini 4 °C'de çözdürün ve kullanımdan hemen önce omentum kültür ortamı ile 1:1 oranında karıştırın. Bazal membran matris karışımını enjeksiyona kadar buz üzerinde veya 4 °C'de saklayın. Kesilmiş bir omentum parçasını daldırmak için boş kuyuları yeterli bazal membran matris karışımı ile doldurun.</li>
		<li>Numuneleri bazal membran matris karışımına yerleştirin ve ardından 24 kuyulu kültür plakasını 20 dakika boyunca bir inkübatöre (37 °C ve %5CO2) yerleştirin. Karışım katılaştıktan sonra, yukarıda tarif edildiği gibi enjeksiyona devam edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Floresan görüntüleme kullanarak enjeksiyonun başarılı olduğunu onaylayın. Enjeksiyon bölgelerinde bir floresan sinyal çizgisinin görüntülendiğinden emin olun (Şekil 2D). Enjeksiyondan sonra omentuma bağlı gerçek hücre sayısının tahmin edilemez olduğunu unutmayın.</li>
</ol>4. İnsan omentum ve yumurtalık kanseri hücrelerinin birlikte kültürü
<ol><li>Her 48-72 saatte bir 500-2000 μL taze omentum kültür ortamı ekleyerek ortamı değiştirin. Kanser hücrelerinin yerini alabileceğinden ortamı doğrudan omentum dokusunun üzerine pipetlemeyin. Ortam rengi sarıya dönerse, ortamı değiştirin. NOT: Ortam değişiminin sıklığı, kullanılan ortamın hacmine ve kanser hücresi büyümesinin gidişatına bağlı olacaktır. Kanser hücreleri omentumu tohumladıktan sonra, omentum parçasının yüzer olup olmadığı artık önemli değildir.</li>
	<li>İSTEĞE BAĞLI: Bir bazal membran matrisi kullanılmışsa, matris tipik olarak ilk ortam değişikliği sırasında çözülür.</li>
	<li>Floresan görüntüleme kullanarak yumurtalık kanseri tümörlerinin büyümesini izleyin. Görüntüleme sıklığı araştırıcının takdirindedir. Küçük tümörlerin kanıtlarını yaklaşık 14 gün önceden tahmin edin (Şekil 3A-C). Sonuçlar enjeksiyonun kalitesine bağlı olarak değişebilir.</li>
	<li>Denemeyi deneme uç noktasına göre sonlandırın. NOT: Tümör büyümesi ve omentum dokusunun bütünlüğü 50 günden fazla gözlenmiştir.</li>
</ol>

Over Kanseri-Omentum Etkileşimi için 3 Boyutlu Ex Vivo Model Oluşturulması

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).</li><li>Berek, J. S., Renz, M., Kehoe, S., Kumar, L., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+of+the+ovary,+fallopian+tube,+and+peritoneum:+2021+update.">Cancer of the ovary, fallopian tube, and peritoneum: 2021 update.</a> Int J Gynaecol Obstet. 155 (Suppl 1), 61-85 (2021).</li><li>Ledermann, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+diagnosed+and+relapsed+epithelial+ovarian+carcinoma:+ESMO+clinical+practice+guidelines+for+diagnosis,+treatment+and+follow-up.">Newly diagnosed and relapsed epithelial ovarian carcinoma: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Ann Oncol. 24 (Suppl 6), vi24-32 (2013).</li><li>Jelovac, D., Armstrong, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+diagnosis+and+treatment+of+ovarian+cancer.">Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer.</a> CA Cancer J Clin. 61 (3), 183-203 (2011).</li><li>Morgan, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer.+Clinical+practice+guidelines+in+oncology.">Ovarian cancer. Clinical practice guidelines in oncology.</a> J Natl Compr Canc Netw. 6 (8), 766-794 (2008).</li><li>Nieman, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocytes+promote+ovarian+cancer+metastasis+and+provide+energy+for+rapid+tumor+growth.">Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth.</a> Nat Med. 17 (11), 1498-1503 (2011).</li><li>Motohara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolving+story+of+the+metastatic+voyage+of+ovarian+cancer+cells:+cellular+and+molecular+orchestration+of+the+adipose-rich+metastatic+microenvironment.">An evolving story of the metastatic voyage of ovarian cancer cells: cellular and molecular orchestration of the adipose-rich metastatic microenvironment.</a> Oncogene. 38 (16), 2885-2898 (2019).</li><li>Di Nicola, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omentum+a+powerful+biological+source+in+regenerative+surgery.">Omentum a powerful biological source in regenerative surgery.</a> Regen Ther. 11, 182-191 (2019).</li><li>Meza-Perez, S., Randall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+functions+of+the+omentum.">Immunological functions of the omentum.</a> Trends Immunol. 38 (7), 526-536 (2017).</li><li>Liu, M., Silva-Sanchez, A., Randall, T. D., Meza-Perez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+immune+responses+in+the+peritoneal+cavity+and+omentum.">Specialized immune responses in the peritoneal cavity and omentum.</a> J Leukoc Biol. 109 (4), 717-729 (2021).</li><li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+facilitate+ovarian+cancer+premetastatic+niche+formation+in+the+omentum.">Neutrophils facilitate ovarian cancer premetastatic niche formation in the omentum.</a> J Exp Med. 216 (1), 176-194 (2019).</li><li>Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+microenvironment+promotes+Bclxl+expression+and+confers+chemoresistance+in+ovarian+cancer+cells.">Adipocyte microenvironment promotes Bclxl expression and confers chemoresistance in ovarian cancer cells.</a> Apoptosis. 22 (4), 558-569 (2017).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+adipocytes:+key+players+in+breast+cancer+progression.">Cancer-associated adipocytes: key players in breast cancer progression.</a> J Hematol Oncol. 12 (1), 95 (2019).</li><li>Zhang, Z., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue:+The+dysfunctional+adipocyte+-+a+cancer+cell's+best+friend.">Adipose tissue: The dysfunctional adipocyte - a cancer cell's best friend.</a> Nat Rev Endocrinol. 14 (3), 132-134 (2018).</li><li>Alvero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRX-E-002-1+Induces+c-Jun-dependent+apoptosis+in+ovarian+cancer+stem+cells+and+prevents+recurrence+in+vivo.">TRX-E-002-1 Induces c-Jun-dependent apoptosis in ovarian cancer stem cells and prevents recurrence in vivo.</a> Mol Cancer Ther. 15 (6), 1279-1290 (2016).</li><li>Alvero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+for+the+detection+of+intraperitoneal+micrometastasis+using+an+ovarian+cancer+mouse+model.">Novel approach for the detection of intraperitoneal micrometastasis using an ovarian cancer mouse model.</a> Sci Rep. 7, 40989 (2017).</li><li>Craveiro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+modifications+in+ovarian+cancer+stem+cells+following+Paclitaxel+treatment.">Phenotypic modifications in ovarian cancer stem cells following Paclitaxel treatment.</a> Cancer Med. 2 (6), 751-762 (2013).</li><li>Sumi, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+for+non-invasive+imaging+to+detect+and+monitor+ovarian+cancer+recurrence.">Murine model for non-invasive imaging to detect and monitor ovarian cancer recurrence.</a> J Vis Exp. (93), e51815 (2014).</li><li>Agarwal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+migration+inhibitory+factor+expression+in+ovarian+cancer.">Macrophage migration inhibitory factor expression in ovarian cancer.</a> Am J Obstet Gynecol. 196 (4), 348.e1-348.e5 (2007).</li><li>Kelly, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-4+signaling+promotes+tumor+growth+and+paclitaxel+chemoresistance+in+ovarian+cancer.">TLR-4 signaling promotes tumor growth and paclitaxel chemoresistance in ovarian cancer.</a> Cancer Res. 66 (7), 3859-3868 (2006).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBX7+binds+the+E-box+to+inhibit+TWIST-1+function+and+inhibit+tumorigenicity+and+metastatic+potential.">CBX7 binds the E-box to inhibit TWIST-1 function and inhibit tumorigenicity and metastatic potential.</a> Oncogene. 39 (20), 3965-3979 (2020).</li><li>Tedja, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+epithelial-mesenchymal+hybrid+cancer+cells+with+tumorigenic+potential.">Generation of stable epithelial-mesenchymal hybrid cancer cells with tumorigenic potential.</a> Cancers (Basel). 15 (3), 15030684 (2023).</li><li>Dauleh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+cultured+mesothelial+cells+derived+from+the+murine+adult+omentum.">Characterisation of cultured mesothelial cells derived from the murine adult omentum.</a> PLoS One. 11 (7), e0158997 (2016).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bu protokol kullanılarak, temel in vitro ve ex vivo tekniklerin bir kombinasyonu kullanılarak yumurtalık kanseri için klinik öncesi bir peritoneal karsinomatoz modeli geliştirilmiştir. Omentum örneklerinin mCherry + OCSC1-F2 insan yumurtalık kanseri hücreleri ile tohumlanmasından sonra 50 günlük ko-kültür boyunca ilerleyici bir tümör büyümesi gözlendi. Bu yöntem, farklı omentum örnekleri kullanılarak yapılan çeşitli deneysel çalışmalarda geliştirilmiş ve optimize edilmiş...

Over kanseri dünya çapında en ölümcül jinekolojik malignitedir1. Bu kansere yakalanma riski yaklaşık 70'de 1'dir ve ortalama tanı yaşı 63'tür2. Primer over maligniteleri histolojik olarak epitelyal ve epitelyal olmayan olarak sınıflandırılır. Epitelyal over kanserleri (EOC) tümörlerin %90'ından fazlasını oluşturur ve en sık görülen alt tip, EOC'lerin yaklaşık %70-80'ini oluşturan yüksek dereceli seröz karsinomdur (HGSC). Şu anda, hastalığı erken teşhis etmek için etkili bir tarama yöntemi yoktur. Bu nedenle çoğu hasta, kanser periton boşluğuna yayıldıktan sonra ileri bir aşamada (yani, Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique [FIGO] evre III veya IV) teşhis edilir2.
Standart ön cephe tedavisi, tüm görünür makroskopik hastalıkları ortadan kaldırmak için sitoredüktif cerrahi ve ardından herhangi bir kalıntı mikroskobik hastalığı yok etmek için adjuvan platin bazlı kemoterapidir. Son yirmi yılda yumurtalık kanseri tedavisinde birçok ilerleme olmasına rağmen, ilerlemiş hastalığı olan hastaların yaklaşık %70'i tedaviden sonraki 3 yıl içinde nüksedecektir3. Bu hastaların genel olarak kötü prognozu göz önüne alındığında, EOC'de devam eden ve gelecekteki translasyonel araştırma çabaları, erken teşhis için biyobelirteçleri tanımlamayı, metastazı önlemeyi, dirençten kaçınmak için mevcut tedavileri iyileştirmeyi ve yeni kişiselleştirilmiş kanser tedavileri geliştirmeyi amaçlamaktadır.
Periton boşluğu içindeki jeneralize metastaz ve buna bağlı kemorezistans, yumurtalık kanserli hastaların tedavisinin iyileştirilmesi için en önemli sınırlamalardan ikisidir 4,5. Mideden bağırsakların üzerine sarkan yağlı önlük benzeri bir yapı olan omentum, yumurtalık kanseri metastazının ana bölgesidir 6,7. Fiziksel bir bariyer olarak işlevine ek olarak, omentumun rejeneratif ve anjiyojenik kapasitelere sahip olduğu ve birlikte vaskülarizasyonu destekleyen, yara iyileşmesini hızlandıran ve enfeksiyonu sınırlayan bağışıklık aktivitelerine sahip olduğu gösterilmiştir8. Çeşitli hücre tiplerine farklılaşabilen ve hasarlı dokuların onarılmasına yardımcı olabilen yüksek konsantrasyonda kök hücre içerir. Omentum, yaralanma veya enfeksiyona yanıt olarak iltihaplanabilir, bu da bağışıklık hücrelerinin yaralanma bölgesinegöçünü tetikler 9. Bu bağışıklık hücreleri, hasarlı dokunun onarımını ve yenilenmesini desteklemeye yardımcı olan büyüme faktörlerini ve diğer molekülleri serbest bırakır. Omentumda lokalize olan makrofajlar, lenfositler ve plazma hücreleri gibi bağışıklık hücreleri, patojenleri tespit etmekten ve bunlara saldırmaktan ve periton bağışıklığını düzenlemekten sorumlu olan "sütlü lekeler" olarak bilinen yapılardır. Omentumun ayrıca, bağışıklık sisteminin kendi antijenlerini tolere etme ve sağlıklı dokulara saldırmama yeteneği olan bağışıklık toleransını10 indüklemede rol oynadığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, aynı bağışıklıkla ilgili aktiviteler, omental tümörlerin büyümesi, metastaz ve bağışıklık sürveyansından kaçış gibi patolojik yanıtlarda da rol oynar 9,11. Laboratuvarımızdan ve diğerlerinden yapılan önceki çalışmalar, anti-tümöral immün yanıtların inhibisyonunda ve kemodirenç12,13,14 kazanılmasında adipoz mikroçevrenin benzersiz ve aktif bir rolünü göstermiştir. Ne yazık ki, omentumun pro-tümöral bir mikroçevre sağladığı hücresel ve moleküler mekanizmalar hakkında sınırlı bilgiye sahibiz.
Kanser hücreleri ve omentum arasındaki etkileşimleri daha iyi anlamak için, insan yumurtalık kanseri hücreleri ve hasta kaynaklı omentum eksplantlarından oluşan bir 3D kültür sistemi geliştirilmiştir. Burada tarif edilen protokol, peritoneal karsinomatozisin yeni bir ex vivo modelini temsil etmektedir. Bu model, bu yağ açısından zengin dokuda yumurtalık kanseri tümör oluşumunun doğal ilerlemesini taklit eder. Önerilen modelin üretilmesi kolaydır, ucuzdur ve yumurtalık kanseri araştırmalarında translasyonel araştırmalara potansiyel olarak uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>329652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipets</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229010B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 Tissue Culture Flask</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Counter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9819000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 imager</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1043028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel</td>
			<td>Integra-Miltex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revolve microscope</td>
			<td>Echo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo model of ovarian cancer peritoneal metastasis using human omentum

Over kanseri en ölümcül jinekolojik malignitedir. Omentum, metastatik yumurtalık kanseri hücrelerine destekleyici bir mikro çevrenin yanı sıra tümör toleransına izin veren immün modülatör sinyallerin sağlanmasında önemli bir rol oynar. Bununla birlikte, yumurtalık kanseri hücreleri ile yağdan zengin dokular arasındaki etkileşimi yakından taklit eden sınırlı modellerimiz var. Omentumun pro-tümöral bir mikroçevre sağladığı hücresel ve moleküler mekanizmaları daha iyi anlamak için, kanser hücresi-omentum etkileşiminin benzersiz bir 3D ex vivo modelini geliştirdik. İnsan omentumunu kullanarak, bu yağ açısından zengin mikro çevre içinde yumurtalık kanseri hücrelerini büyütebilir ve tümör büyümesi ve bağışıklık regülasyonundan sorumlu faktörleri izleyebiliriz. Model, bu adipoz açısından zengin tümör mikroçevresinin incelenmesi için bir platform sağlamanın yanı sıra, bu niş içindeki metastatik kanser hücrelerini hedeflemek için yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesi ve değerlendirilmesi için mükemmel bir platform sağlar. Önerilen modelin üretilmesi kolaydır, ucuzdur ve translasyonel araştırmalara uygulanabilir.

Yumurtalık kanseri hücrelerinin omentum örneklerine başarılı bir şekilde yerleşmesi yaklaşık 14. günde belirgindi. Daha fazla deneye izin vermek için toplanan örnek başına en az 24 kopya hazırlandı ve enjekte edildi. Tümör büyümesi floresan görüntüler alınarak izlendi (Şekil 3D,E). Görüntülerin dikkatli bir şekilde yorumlanması gerekiyordu, çünkü omentuma bağlı olmayan her kuy...

Watch this Scientific Journal Video about Advanced Ex Vivo Model for Investigating Cancer-Adipose Microenvironment Interaction at JoVE.com

Yazar Spotlight: Kanser-Adipoz Mikroçevre Etkileşimini Araştırmak için Gelişmiş Ex Vivo Model 

Bu protokol, kanser hücresi-omentum etkileşiminin üç boyutlu (3D) ex vivo modelinin kurulmasını açıklar. Model, yağ nişi içindeki pro-tümör mekanizmalarını aydınlatmak ve yeni tedavileri test etmek için bir platform sağlar.

İnsan Omentumu Kullanılarak Over Kanseri Periton Metastazının Ex Vivo Modeli

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian ...

Mevcut çalışmalar, izole adipositler ve yumurtalık kanseri hücrelerinden oluşan ko-kültür sistemlerini kullanmaktadır. Bu adipositler, in vitro olarak pre adipositlerden ayırt edilir. Bu hücreler daha sonra bir transwell eki ile ayrılır ve bu nedenle hücreden hücreye doğrudan temastan yoksundur.Bu ex vivo kültür yöntemi, kanser hücrelerinin yağ mikroçevresi ile doğrudan etkileşimini incelemek için bir model sunar. Modelimiz insan momentumunun yapısını korur ve bu nedenle tipik olarak bu organda bulunan çeşitli hücre tiplerini korur. Adipositlere ek olarak, bu hücreler destekleyici fibroblastların yanı sıra bağışıklık hücrelerini de içerir.Bu model aynı zamanda bu hücreleri kendi doğal matrislerinde tutar. Bu model, bu niş içindeki metastatik kanser hücrelerini hedeflemek için yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesi ve değerlendirilmesi için mükemmel bir platform sağlar.

an-ex-vivo-model-ovarian-cancer-peritoneal-metastasis-using-human

Research

JoVE Journal

Cancer Research

An Ex Vivo Model of Ovarian Cancer Peritoneal Metastasis Using Human Omentum

2.4K Görüntüleme.  Karmanos Cancer Institute. Mevcut çalışmalar, izole adipositler ve yumurtalık kanseri hücrelerinden oluşan ko-kültür sistemlerini kullanmaktadır. Bu adipositler, in vitro olarak pre adipositlerden ayırt edilir. Bu hücreler daha sonra bir transwell eki ile ayrılır ve bu nedenle hücreden hücreye doğrudan temastan yoksundur.Bu ex vivo kültür yöntemi, kanser hücrelerinin yağ mikroçevresi ile doğrudan etkileşimini incelemek için bir model sunar. Modelimiz insan momentumunun yapısını korur ...

Video: Yazar Spotlight: Kanser-Adipoz Mikroçevre Etkileşimini Araştırmak için Gelişmiş Ex Vivo Model 

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is important to control peritoneal dissemination. However, it is still unclear how tumor cells detach from primary lesions and attach to the mesothelium. The establishment of an appropriate animal model is needed to gain an understanding of the mechanism of peritoneal dissemination in vivo. In the current study, we introduce the process from the local injection of EOC cells into the murine ovarian surface to the development of metastasis, including the peritoneum and distant organs. Female nude mice (BALB/c nu/nu) at 8 weeks of age were used. Under a microscopic field of view, EOC cells (1 x 105 cells/&#181;l of medium-extracellular matrix (ECM)-based hydrogel/unilateral ovary/mouse) were injected into murine ovaries through a retroperitoneal approach from the dorsal flank. This proposed method is a less invasive procedure for the mouse and minimizes damage to the ovary. Here, we describe the methodological steps in the development of the original and metastatic tumor formation of EOC.

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

To clarify the multistep process of peritoneal dissemination of ovarian carcinoma, the current study presents a murine experimental model of original tumor development and peritoneal metastasis via orthotopic inoculation with these tumor cells.

Orijinal Tümör Geliştirme Murin Deneysel Modeli ve Periton Metastaz<em&gt; yoluyla</emYumurtalık Kanseri Hücreleri ile&gt; Ortotopik aşılama

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

Kanser Araştırmaları

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm3. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.

Tümör metastaz üzerinde Hipoksi Test Etkisinin Vivo Modeli

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Bir Portal Ven Enjeksiyon Modeli Karaciğer Metastazı Meme Kanseri Eğitim için

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the tumor microenvironment and respond adequately to tumor antigens. The recent development of improved imaging approaches, such as 2-photon microscopy, and the use of powerful mouse tumor models have shed light on some of the mechanisms that regulate anti-tumor T cell activities. Whereas such systems have provided valuable insights, they do not always predict human responses. In human, our knowledge in the field mainly comes from a description of fixed tumor samples from human patients, as well as in vitro studies. However, in vitro models lack the complex three-dimensional tumor milieu and, therefore, are incomplete approximations of in vivo T cell activities. Fresh slices made from explanted tissue represent a complex multi-cellular tumor environment that can act as an important link between co-cultured studies and animal models. Originally set up in murine lymph nodes1 and previously described in a JoVE article2, this approach has now been transposed to human tumors to examine the dynamics of both plated3&#160;as well as resident&#160;T cells4.
Here, a protocol for the preparation of human lung tumor slices, immunostaining of resident CD8 T and tumor cells, and tracking of CD8 T lymphocytes within the tumor microenvironment using confocal microscopy is described. This system is uniquely placed to screen for novel immunotherapy agents favoring T cell migration in tumors.

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

This protocol describes a method to image resident tumor-infiltrating CD8 T cells labeled with fluorescently coupled antibodies within human lung tumor slices. This technique permits real-time analyses of CD8 T cell migration using confocal microscopy.

Ex Vivo İnsan akciğer tümörü içinde ikamet CD8 T lenfositlerin görüntüleme Confocal mikroskobu kullanma dilim

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve microenvironment. This type of invasion is exhibited by a variety of cancer types, and very frequently is found in pancreatic cancer. The microscopic size of nerve fibers within mouse pancreas renders the study of PNI difficult in orthotopic murine models. Here, we describe a heterotopic in vivo model of PNI, where we inject syngeneic pancreatic cancer cell line Panc02-H7 into the murine sciatic nerve. In this model, sciatic nerves of anesthetized mice are exposed and injected with cancer cells. The cancer cells invade in the nerves proximally toward the spinal cord from the point of injection. The invaded sciatic nerves are then extracted and processed with OCT for frozen sectioning. H&amp;E and immunofluorescence staining of these sections allow quantification of both the degree of invasion and changes in protein expression. This model can be applied to a variety of studies on PNI given its versatility. Using mice with different genetic modifications and/or different types of cancer cells allows for investigation of the cellular and molecular mechanisms of PNI and for different cancer types. Furthermore, the effects of therapeutic agents on nerve invasion can be studied by applying treatment to these mice.

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

We describe an in vivo murine model of perineural invasion by injecting syngeneic pancreatic cancer cells into the sciatic nerve. The model allows for quantification of the extent of nerve invasion, and supports investigation of the cellular and molecular mechanisms of perineural invasion.

Vivo fare siyatik sinir modeli Perineural işgali

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

Nöroblastom Metastaz Zebra Balığı Modeli

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical outcomes. Preclinical mouse models of breast cancer brain metastatic (BCBM) growth are useful but are expensive, and it is difficult to track live cells and tumor cell invasion within the brain parenchyma. Presented here is a protocol for ex vivo brain slice cultures from xenografted mice containing intracranially injected breast cancer brain-seeking clonal sublines. MDA-MB-231BR luciferase tagged cells were injected intracranially into the brains of Nu/Nu female mice, and following tumor formation, the brains were isolated, sliced, and cultured ex vivo. The tumor slices were imaged to identify tumor cells expressing luciferase and monitor their proliferation and invasion in the brain parenchyma for up to 10 days. Further, the protocol describes the use of time-lapse microscopy to image the growth and invasive behavior of the tumor cells following treatment with ionizing radiation or chemotherapy. The response of tumor cells to treatments can be visualized by live-imaging microscopy, measuring bioluminescence intensity, and performing histology on the brain slice containing BCBM cells. Thus, this ex vivo slice model may be a useful platform for rapid testing of novel therapeutic agents alone or in combination with radiation to identify drugs personalized to target an individual patient&#39;s breast cancer brain metastatic growth within the brain microenvironment.

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

We introduce a protocol for measuring real-time drug and radiation response of breast cancer brain metastatic cells in an organotypic brain slice model. The methods provide a quantitative assay to investigate the therapeutic effects of various treatments on brain metastases from breast cancer in an ex vivo manner within the brain microenvironment interface.

Meme Kanseri Beyin Metastatik Tümör Büyümesini İncelemek ve Hedeflemek için Ex Vivo Beyin Dilimi Modeli

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular diversity, as well as complex interactions between tumor microenvironments, can make finding effective treatments a challenge. Traditional adherent or sphere culture methods can mask such complexities, whereas three-dimensional organoid culture can recapitulate regional microenvironmental gradients. Organoids are a method of three-dimensional GBM culture that better mimics patient tumor architecture, contains phenotypically diverse cell populations, and can be used for medium-throughput experiments. Although three-dimensional organoid culture is more laborious and time-consuming compared to traditional culture, it offers unique benefits and can serve to bridge the gap between current in vitro and in vivo systems. Organoids have established themselves as invaluable tools in the arsenal of cancer biologists to better understand tumor behavior and mechanisms of resistance, and their applications only continue to grow. Here, details are provided about methods for generating and maintaining GBM organoids. Instructions of how to perform organoid sample embedding and sectioning using both frozen and paraffin-embedding techniques, as well as recommendations for immunohistochemistry and immunofluorescence protocols on organoid sections, and measurement of total organoid cell viability, are all also described.

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Here, we describe a method of generating glioblastoma (GBM) organoids from primary patient specimens or patient-derived cell cultures and maintaining them to maturity. These GBM organoids contain phenotypically diverse cell populations and recreate tumor microenvironments ex vivo.

Üç Boyutlu Organoid Kültür Kullanarak İnsan Glioblastoma Hücresel Çeşitliliğinin Ex vivo Korunması

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites have been the gold standards for conditional or inducible gene targeting. To provide faster and more efficient experimental models, an ex vivo organoid culture system is developed using adenovirus Cre and normal urothelial cells carrying multiple loxP alleles of the tumor suppressors Trp53, Pten, and Rb1. Normal urothelial cells are enzymatically disassociated from four bladders of triple floxed mice (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). The urothelial cells are transduced ex vivo with adenovirus-Cre driven by a CMV promoter (Ad5CMVCre). The transduced bladder organoids are cultured, propagated, and characterized in vitro and in vivo. PCR is used to confirm gene deletions in Trp53, Pten, and Rb1. Immunofluorescence (IF) staining of organoids demonstrates positive expression of urothelial lineage markers (CK5 and p63). The organoids are injected subcutaneously into host mice for tumor expansion and serial passages. The immunohistochemistry (IHC) of xenografts exhibits positive expression of CK7, CK5, and p63 and negative expression of CK8 and Uroplakin 3. In summary, adenovirus-mediated gene deletion from mouse urothelial cells engineered with loxP sites is an efficient method to rapidly test the tumorigenic potential of defined genetic alterations.

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

This protocol describes the process of the generation and characterization of mouse urothelial organoids harboring deletions in genes of interest. The methods include harvesting mouse urothelial cells, ex vivo transduction with adenovirus driving Cre expression with a CMV promoter, and in vitro as well as in vivo characterization.

Eski Vivo Fare Ürotelyal Hücrelerinde Adenovirüs-Cre Aracılı Gen Delesyonlarının Organoid Modeli

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Intra-Cardiac Injection of Human Prostate Cancer Cells to Create a Bone Metastasis Xenograft Mouse Model

As the most common male malignancy, prostate cancer (PC) ranks second in mortality, primarily due to a 65%-75% bone metastasis rate. Therefore, it is essential to understand the process and related mechanisms of prostate cancer bone metastasis for developing new therapeutics. For this, an animal model of bone metastasis is an essential tool. Here, we report detailed procedures to generate a bone metastasis mouse model via intra-cardiac injection of prostate cancer cells. A bioluminescence imaging system can determine whether prostate cancer cells have been accurately injected into the heart and monitor cancer cell metastasis since it has great advantages in monitoring metastatic lesion development. This model replicates the natural development of disseminated cancer cells to form micro-metastases in the bone and imitates the pathological process of prostate cancer bone metastasis. It provides an effective tool for further exploration of the molecular mechanisms and the in vivo therapeutic effects of this disease.

Here, we present a protocol for the intra-cardiac injection of human prostate cancer cells to generate a mouse model with bone metastasis lesions.

Kemik Metastazı Ksenograft Fare Modeli Oluşturmak için İnsan Prostat Kanseri Hücrelerinin İntrakardiyak Enjeksiyonu

As the most common male malignancy, prostate cancer (PC) ranks second in mortality, primarily due to a 65%-75% bone metastasis rate. Therefore, it is ...