تم دعم هذا المشروع من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32201235 إلى Zhifei Fu) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة فوجيان ، الصين (2022J01287 إلى Zhifei Fu) ، ومؤسسة أبحاث المواهب المتقدمة في جامعة فوجيان الطبية ، الصين (XRCZX2021013 إلى Zhifei Fu) ، ومؤسسة العلوم المالية الخاصة بمقاطعة فوجيان ، الصين (22SCZZX002 إلى Zhifei Fu) ، تأسيس مختبر NHC الرئيسي للتقييم الفني لتنظيم الخصوبة للرئيسيات غير البشرية ، ومستشفى فوجيان لصحة الأمومة والطفل (2022-NHP-04 إلى Zhifei Fu). نشكر Linying Zhou و Minxia Wu و Xi Lin و Yan Hu في مركز خدمة التكنولوجيا العامة بجامعة فوجيان الطبية على الدعم في إعداد عينات EM والتصوير الكهرومغناطيسي.

بروتوكول جديد للتألق المتزامن والحفاظ على البنية التحتية

<ol>
	<li>de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopy:+ultrastructure+lights+up.">Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up.</a> Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).</li><li>Kopek, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+protocols+for+correlative+super-resolution+fluorescence+imaging+and+electron+microscopy+of+chemically+fixed+samples.">Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples.</a> Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy.">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).</li><li>Johnson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+in-resin+super-resolution+and+electron+microscopy+using+standard+fluorescent+proteins.">Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins.</a> Sci Rep. 5 (1), 9583 (2015).</li><li>Paez-Segala, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation-resistant+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+CLEM.">Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM.</a> Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).</li><li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mEosEM+withstands+osmium+staining+and+Epon+embedding+for+super-resolution+CLEM.">mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM.</a> Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).</li><li>Kukulski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision.">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).</li><li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+fluorescent+proteins+for+dual-colour+post-embedding+CLEM.">Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM.</a> Cells. 11 (7), 1077 (2022).</li><li>Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+stable+fluorescent+proteins+for+advanced+microscopy.">Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy.</a> Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).</li><li>Tanida, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+in-resin+CLEM+of+Epon-embedded+cells+using+osmium+resistant+green+and+red+fluorescent+proteins.">Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins.</a> Sci Rep. 10 (1), 21871 (2020).</li><li>Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cytoplasmic+organelles+via+in-resin+CLEM+using+an+osmium-resistant+far-red+protein.">Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein.</a> Sci Rep. 10 (1), 11314 (2020).</li><li>MacManus, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excision+of+whole+intact+mouse+brain.">Excision of whole intact mouse brain.</a> MethodsX. 10, 102246 (2023).</li><li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+extracellular+space+for+high-quality+optical+and+ultrastructural+studies+of+whole+mammalian+brains.">Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains.</a> Cell Rep Methods. 3 (7), 24 (2023).</li><li>Paul-Gilloteaux, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eC-CLEM:+flexible+multidimensional+registration+software+for+correlative+microscopies.">eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies.</a> Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).</li><li>Fenno, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+dual-+and+triple-feature+intersectional+single-vector+delivery+of+diverse+functional+payloads+to+cells+of+behaving+mammals.">Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals.</a> Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).</li><li>Shcherbo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+fluorescent+tags+for+protein+imaging+in+living+tissues.">Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues.</a> Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).</li><li>Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+mCherry+variants+with+long+Stokes+shift,+red-shifted+fluorescence,+and+low+cytotoxicity.">Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity.</a> PLoS One. 12 (2), e0171257 (2017).</li><li>Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hue-shifted+monomeric+variants+of+Clavularia+cyan+fluorescent+protein:+identification+of+the+molecular+determinants+of+color+and+applications+in+fluorescence+imaging.">Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging.</a> BMC Biol. 6 (13), 1741 (2008).</li><li>Ogoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-color-emitting+green+fluorescent+protein+from+the+sea+cactus+Cavernularia+obesa+and+its+use+as+a+pH+indicator+for+fluorescence+microscopy.">Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy.</a> Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).</li><li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mScarlet:+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging.">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li><li>Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+Epon-embedding-based+correlative+super-resolution+light+and+electron+microscopy.">A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy.</a> Research Square. , (2019).</li><li>Johnson, E., Kaufmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+the+photoswitching+ability+of+standard+fluorescent+proteins+for+correlative+in-resin+super-resolution+and+electron+microscopy.">Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-liquid+phase+separation+mediates+the+formation+of+herpesvirus+assembly+compartments.">Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments.</a> J Cell Biol. 222 (1), 17 (2023).</li><li>Tao, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+characterization+of+excitatory+and+inhibitory+synapses+by+cryo-electron+tomography+and+correlative+microscopy.">Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy.</a> J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

البروتوكول المقدم هنا هو طريقة تصوير متعددة الاستخدامات ، والتي يمكن أن تجمع بين معلومات توطين البروتين المستهدف من المجهر الضوئي (LM) والسياق المحيط بالبروتين المستهدف من المجهر الإلكتروني (EM) 6. مع قيود البروتينات الفلورية الحالية ، فإن الطريقة المستخدمة على نطاق واسع هي الت...

يمكن استخدام المجهر الفلوري (FM) للحصول على توطين وتوزيع البروتين المستهدف. ومع ذلك ، يتم فقدان السياق الذي يحيط بالبروتين المستهدف ، وهو أمر بالغ الأهمية للتحقيق في البروتين المستهدف بدقة. يتمتع المجهر الإلكتروني (EM) بأعلى دقة تصوير ، حيث يوفر العديد من التفاصيل تحت الخلوية. ومع ذلك ، تفتقر EM إلى وضع العلامات المستهدفة. من خلال الدمج الدقيق للصورة الفلورية التي التقطتها FM مع الصورة الرمادية التي حصلت عليها EM ، يمكن للضوء المترابط والمجهر الإلكتروني (CLEM) الجمع بين المعلومات التي تم الحصول عليها من خلال وضعيتي التصويرهذين 1،2،3،4.
CLEM هو مفاضلة بين التألق والبنية التحتية1. نظرا لقيود البروتينات الفلورية الحالية وإجراءات تحضير عينات EM التقليدية ، وخاصة استخدام حمض الأسميك (OsO4) والراتنجات الكارهة للماء مثل Epon ، فإن البنية التحتية الفائقة دائما ما تعرض التألق5 للخطر. OsO4 هو كاشف لا غنى عنه في تحضير عينات EM ، والذي يستخدم لتحسين تباين صور EM. بالمقارنة مع راتنجات التضمين الأخرى ، فإن Epon متفوقة في الحفاظ على البنية التحتية وخصائص التقسيم5. ومع ذلك ، لا يمكن لأي بروتينات فلورية الاحتفاظ بإشارة التألق بعد معالجة OsO4 وتضمين Epon6. للتغلب على قيود البروتينات الفلورية ، تم تطوير CLEM قبل التضمين ، حيث يتم تصوير FM قبل تحضير عينة EM6. ومع ذلك ، فإن عيب التضمين المسبق CLEM هو التسجيل غير الدقيق بين صور FM و EM5.
على العكس من ذلك ، تقوم طريقة CLEM بعد التضمين بإجراء تصوير FM بعد تحضير عينة EM ، والتي يمكن أن تصل دقة تسجيلها إلى 6-7 نانومتر 5,6. للاحتفاظ بمضان البروتينات الفلورية ، تم استخدام تركيزات منخفضة جدا من OsO4 (0.001٪) 3 أو طرق تحضير EM المجمدة ذات الضغط العالي (HPF) واستبدال التجميد (FS) 4,7 على حساب البنية التحتية المخترقة أو تباين صورة EM. يعزز تطوير mEos4b بشكل كبير تقدم CLEM بعد التضمين ، على الرغم من استخدام غليسيديل ميثاكريلات كراتننجالتضمين 5. مع تطوير mEosEM ، الذي يمكنه البقاء على قيد الحياة من تلطيخ OsO4 وتضمين Epon ، تم تحقيق CLEM فائق الدقة لتضمين Epon اللاحق لأول مرة ، مع الحفاظ على التألق والبنية التحتية في وقت واحد6. بعد mEosEM ، تم تطوير العديد من البروتينات الفلورية التي يمكن أن تنجو من تلطيخ OsO4 وتضمين Epon8،9،10،11. هذا يعزز إلى حد كبير تطوير CLEM.
هناك ثلاثة جوانب رئيسية ل Epon بعد تضمين CLEM. الأول هو البروتين الفلوري ، الذي يجب أن يحافظ على إشارة الفلورسنت بعد تحضير عينة EM. وفقا لتجربتنا ، يتفوق mScarlet على بروتينات الفلورسنت الأخرى المبلغ عنها. والثاني هو كيفية العثور على نفس الخلية التي تم تصويرها بواسطة التصوير FM في التصوير الكهرومغناطيسي. لحل هذه المشكلة ، نقوم بتحسين الإجراء الخاص بهذه الخطوة حتى يتمكن المرء من العثور بسهولة على الخلية المستهدفة. الأخير هو طريقة محاذاة صورة FM مع صورة EM. هنا ، نقوم بتفصيل التسجيل بين صور FM و EM. في هذا البروتوكول ، نعبر عن mScarlet في الخلايا العصبية VGLUT2 ونثبت أن mScarlet يمكن أن يستهدف الجسيمات الحالة الثانوية باستخدام Epon بعد تضمين CLEM. نحن نقدم تفاصيل خطوة بخطوة ل Epon بعد التضمين CLEM ، دون المساس بالتألق والبنية الفائقة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 M Phosphate Buffer (PB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaH2PO4 &#183; 2H2O+Na2HPO4 &#183; 12H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 M Tris-Cl (pH 8.5)</td>
			<td>Shanghai yuanye Bio-Technology</td>
			<td>R26284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% Glutaraldehyde (GA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A17876</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abbelight 3D</td>
			<td>Nanolnsights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10000418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>335213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioPhotometer D30</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaning buffer of cover glasses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-0715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>290734</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA</td>
			<td>SPI company</td>
			<td>GS02827</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop centrifuge</td>
			<td>WIGGENS</td>
			<td>MINICEN 10E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>DiATOME</td>
			<td>MX6353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30</td>
			<td>SPI company</td>
			<td>GS02823</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>2696953</td>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epon 812&#160;</td>
			<td>SPI company</td>
			<td>GS02659</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji image J</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10010618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold nanoparticles</td>
			<td>Corpuscular</td>
			<td>790120-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient resin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrofluoric acid</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10011118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10011218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Easy CLEMv0 Plugin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>A7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large gelatin capsules</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-89-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#160;&#382;12H2O</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10020318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#160;&#382;2H2O</td>
			<td>SCR</td>
			<td>20040718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMA</td>
			<td>SPI company</td>
			<td>GS02828</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide primers</td>
			<td>Takara Biomedical Technology (Beijing)</td>
			<td></td>
			<td>Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers&#160; 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscillating microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>SCR</td>
			<td>L01210302</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsO4 solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6&#183;3H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>SCR</td>
			<td>80096618</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4% PFA+0.1 M PB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pioloform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63148-65-2</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>25986-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6&#183;3H2O)&#160;</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10016818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S2771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handles</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S2896-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 &#176;C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2&#8211;3 months old, weight range 20-30 g.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope (TEM)</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>TECNAL G2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UA solution (2% UA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA EM UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate (UA)</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>19481</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epon post embedding correlative light and electron microscopy

المجهر الضوئي والإلكتروني المترابط (CLEM) هو فحص مجهري شامل يجمع بين معلومات التوطين التي يوفرها المجهر الفلوري (FM) وسياق البنية الخلوية الفائقة المكتسبة بواسطة المجهر الإلكتروني (EM). CLEM هو مفاضلة بين التألق والبنية التحتية ، وعادة ما تعرض البنية التحتية الفائقة التألق للخطر. بالمقارنة مع راتنجات التضمين المحبة للماء الأخرى ، مثل غليسيديل ميثاكريلات أو HM20 أو K4M ، فإن Epon متفوقة في الحفاظ على البنية التحتية وخصائص التقسيم. في السابق ، أثبتنا أن mEosEM يمكن أن ينجو من تثبيت رابع أكسيد الأوزميوم وتضمين Epon. باستخدام mEosEM ، حققنا ، لأول مرة ، Epon post تضمين CLEM ، الذي يحافظ على التألق والبنية التحتية في وقت واحد. هنا ، نقدم تفاصيل خطوة بخطوة حول إعداد عينة EM ، وتصوير FM ، والتصوير EM ، ومحاذاة الصورة. نقوم أيضا بتحسين إجراءات تحديد نفس الخلية التي تم تصويرها بواسطة تصوير FM أثناء التصوير الكهرومغناطيسي وتفصيل التسجيل بين صور FM و EM. نعتقد أنه يمكن للمرء بسهولة تحقيق Epon بعد تضمين الضوء المترابط والمجهر الإلكتروني باتباع هذا البروتوكول الجديد في مرافق EM التقليدية.

Fluorescence microscopy (FM) can be used to obtain the localization and distribution of the target protein. However, the context that surrounds the target protein is lost, which is crucial for investigating the target protein thoroughly. Electron microscopy (EM) has the highest imaging resolution, providing several subcellular details. Nevertheless, EM lacks target labeling. By accurately merging the fluorescence image taken by FM with the gray image acquired by EM, correlative light and electron microscopy (CLEM) can combine the information obtained by these two imaging modes1,2,3,4.
CLEM is a trade-off between fluorescence and the ultrastructure1. Because of the limitations of current fluorescent proteins and the traditional EM sample preparation procedures, especially the use of osmic acid (OsO4) and hydrophobic resins such as Epon, the ultrastructure always compromises fluorescence5. OsO4 is an indispensable reagent in EM sample preparation, which is used to improve the contrast of EM images. Compared with other embedding resins, Epon is superior in ultrastructure preservation and sectioning properties5. However, no fluorescent proteins can retain the fluorescence signal after the treatment of OsO4 and Epon embedding6. To overcome the limitations of fluorescent proteins, pre embedding CLEM was developed, in which FM imaging is done before EM sample preparation6. However, the drawback of pre embedding CLEM is the imprecise registration between the FM and the EM images5.
On the contrary, post embedding CLEM method performs the FM imaging after the EM sample preparation, the registration accuracy of which can reach 6-7 nm5,6. To retain the fluorescence of fluorescent proteins, very low concentrations of OsO4 (0.001%)3 or the high-pressure frozen (HPF) and freeze substitution (FS) EM preparation methods4,7 have been used at the expense of compromised ultrastructure or the contrast of the EM image. The development of mEos4b greatly promotes the progress of post embedding CLEM, although glycidyl methacrylate is used as the embedding resin5. With the development of mEosEM, which can survive the OsO4 staining and Epon embedding, Epon post embedding super-resolution CLEM was achieved for the first time, maintaining the fluorescence and ultrastructure simultaneously6. After mEosEM, several fluorescent proteins that can survive the OsO4 staining and the Epon embedding were developed8,9,10,11. This greatly promotes the development of CLEM.
There are three key aspects to Epon post-embedding CLEM. The first is the fluorescent protein, which should maintain the fluorescent signal after EM sample preparation. According to our experience, mScarlet is superior to other reported fluorescent proteins. The second is how to find the same cell imaged by FM imaging in EM imaging. To solve this problem, we improve the procedure for this step so that one can readily find the targeted cell. The last is the method to align the FM image with the EM image. Here, we detail the registration between the FM and the EM images. In this protocol, we express mScarlet in VGLUT2 neurons and demonstrate that mScarlet can target secondary lysosomes using Epon post-embedding CLEM. We provide step-by-step details for Epon post-embedding CLEM, without compromising the fluorescence and the ultrastructure.

تسليط الضوء على المؤلف: التطورات في الضوء المترابط والمجهر الإلكتروني مع الحفاظ على البروتين الفلوري

Epon Post تضمين الضوء المترابط والمجهر الإلكتروني

Correlative light and electron microscopy is a completely stable microscopy technique, which can combine the localization information provided by fluorescent microscopy and is the ultra structure by electron microscopy. However, the mentality of this technique is to preserve the fluorescence of after you have a simple preparation. Using this fluorescent protein, we can achieve correlative light and the electron microscope which can maintain fluorescence and ultra structure simultaneously.

أظهرت التقارير السابقة أن mScarlet يمكن أن يستهدف الليزوزوم15. في هذا البروتوكول ، تم حقن AAV المعرب عن mScarlet (rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA) في M1 (ML: ±1.2 AP: +1.3 DV: -1.5) من دماغ الفأر Vglut2-ires-cre باستخدام أدوات مجسمة. باتباع البروتوكول الموضح أعلاه ، تظهر الصورة النهائية المرتبطة في الشكل 4 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy at JoVE.com

نقدم بروتوكولا مفصلا لفحص Epon بعد التضمين للضوء المترابط والمجهر الإلكتروني باستخدام بروتين فلوري يسمى mScarlet. يمكن لهذه الطريقة الحفاظ على التألق والبنية التحتية في وقت واحد. هذه التقنية قابلة لمجموعة واسعة من التطبيقات البيولوجية.

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a comprehensive microscopy that combines the localization information provided by fluorescence ...

المجهر الضوئي والإلكتروني المترابط هو تقنية مجهرية مستقرة تماما ، والتي يمكن أن تجمع بين معلومات التوطين التي يوفرها المجهر الفلوري وهي البنية الفائقة بواسطة المجهر الإلكتروني. ومع ذلك ، فإن عقلية هذه التقنية هي الحفاظ على مضان بعد أن يكون لديك إعداد بسيط. باستخدام هذا البروتين الفلوري ، يمكننا تحقيق الضوء المترابط والمجهر الإلكتروني الذي يمكنه الحفاظ على التألق والبنية الفائقة في وقت واحد.

epon-post-embedding-correlative-light-and-electron-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

846 Views.  Fujian Medical University. المجهر الضوئي والإلكتروني المترابط هو تقنية مجهرية مستقرة تماما ، والتي يمكن أن تجمع بين معلومات التوطين التي يوفرها المجهر الفلوري وهي البنية الفائقة بواسطة المجهر الإلكتروني. ومع ذلك ، فإن عقلية هذه التقنية هي الحفاظ على مضان بعد أن يكون لديك إعداد بسيط. باستخدام هذا ال?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: التطورات في الضوء المترابط والمجهر الإلكتروني مع الحفاظ على البروتين الفلوري

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a comprehensive microscopy that combines the localization information provided by fluorescence microscopy (FM) and the context of cellular ultrastructure acquired by electron microscopy (EM). CLEM is a trade-off between fluorescence and ultrastructure, and usually, ultrastructure compromises fluorescence. Compared with other hydrophilic embedding resins, such as glycidyl methacrylate, HM20, or K4M, Epon is superior in ultrastructure preservation and sectioning properties. Previously, we had demonstrated that mEosEM can survive osmium tetroxide fixation and Epon embedding. Using mEosEM, we achieved, for the first time, Epon post embedding CLEM, which maintains the fluorescence and the ultrastructure simultaneously. Here, we provide step-by-step details about the EM sample preparation, the FM imaging, the EM imaging, and the image alignment. We also improve the procedures for identifying the same cell imaged by FM imaging during the EM imaging and detail the registration between the FM and EM images. We believe one can easily achieve Epon post embedding correlative light and electron microscopy following this new protocol in traditional EM facilities.

We present a detailed protocol for Epon post-embedding correlative light and electron microscopy using a fluorescent protein called mScarlet. This method can maintain the fluorescence and the ultrastructure simultaneously. This technique is amenable to a wide variety of biological applications.