Ce projet a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32201235 à Zhifei Fu), la Fondation des sciences naturelles de la province du Fujian, Chine (2022J01287 à Zhifei Fu), la Fondation de recherche pour les talents avancés de l’Université médicale du Fujian, Chine (XRCZX2021013 à Zhifei Fu), la Fondation des sciences spéciales des finances de la province du Fujian, Chine (22SCZZX002 à Zhifei Fu), Fondation du laboratoire clé du NHC pour l’évaluation technique de la régulation de la fertilité chez les primates non humains et de l’hôpital de santé maternelle et infantile du Fujian (2022-NHP-04 à Zhifei Fu). Nous remercions Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin et Yan Hu du Centre de services technologiques publics de l’Université médicale du Fujian pour leur soutien dans la préparation des échantillons EM et l’imagerie EM.

L’élevage et les expériences ont été approuvés par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du centre médical de l’Université médicale du Fujian. Le flux de travail étape par étape du protocole actuel est illustré à la figure 1.
1. Préparation des échantillons
<ol><li>Cerveau de souris<ol><li>Achetez des souris transgéniques (voir le tableau des matériaux) et des amorces oligonucléotidiques (voir le tableau des matériaux) pour génotyper ces souris.</li>
		<li>Perfuser et retirer le cerveau intact de la voûte crânienne en suivant le protocole12,13 précédemment publié.</li>
		<li>Fixez le cerveau de la souris à l’aide de 10 mL de solution fixatrice (voir le tableau des matières) à 4 °C pendant la nuit.</li>
		<li>Rincer la solution fixatrice pendant 3 x 10 min avec un tampon phosphate (PB) 0,1 M.</li>
		<li>Découper le cerveau de la souris en sections de 500 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome oscillant (voir Tableau des matériaux).</li>
		<li>Coupez les régions fluorescentes en petits blocs avec un scalpel à l’aide d’un stéréomicroscope (voir Tableau des matériaux). REMARQUE : Le volume des petits blocs ne doit pas être supérieur à 1 mm3.</li>
	</ol></li>
	<li>Cellules cultivées<ol><li>Semez les cellules HeLa dans des boîtes de culture cellulaire de 6 cm et maintenez-les dans un milieu de croissance (milieu Eagle modifié de Dulbecco [DMEM] à faible teneur en glucose, complété par 10 % de sérum bovin fœtal [FBS]).</li>
		<li>Le lendemain, transfectez les plasmides contenant mScarlet dans des cellules à l’aide d’un réactif de transfection d’ADN (voir Tableau des matériaux) en suivant le manuel d’instructions du kit de transfection.</li>
		<li>Quarante-huit heures après la transfection, trypsiniser les cellules transfectées et les centrifuger pour obtenir des pastilles cellulaires à 1 000 × g. Les pastilles cellulaires sont appelées blocs d’échantillons.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Préparation des échantillons EM
<ol><li>Fixation<ol><li>Fixez les blocs d’échantillons à l’aide d’une solution fixatrice (voir tableau des matériaux) à 4 °C pendant la nuit.</li>
		<li>Retirer la solution fixatrice et rincer la solution fixatrice pendant 3 x 10 min avec 0,1 M PB des blocs d’échantillons.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloration au tétroxyde d’osmium (OsO4)<ol><li>Fixer les blocs d’échantillons avec la solution d’OsO4 (voir tableau des matériaux) à 4 °C pendant 1 h.</li>
		<li>Retirer la solution d’OsO4 et rincer la solution d’OsO4 3 x 10 min avec du ddH2O des blocs d’échantillons.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloration à l’acétate d’uranyle (UA)<ol><li>Colorer les blocs d’échantillons avec une solution UA à 2 % (voir tableau des matériaux) à 4 °C pendant 1 h.</li>
		<li>Retirer la solution d’UA et rincer les blocs d’échantillons avec du ddH2O pendant 3 x 10 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Déshydratation par gradient<ol><li>Déshydrater les blocs d’échantillons avec de l’éthanol à gradient comme suit : 50 % pendant 10 min, 70 % pendant 10 min, 80 % pendant 10 min, 90 % pendant 10 min et 2 x 10 min dans de l’éthanol à 100 %.</li>
		<li>Déshydrater les blocs d’échantillons avec de l’acétone anhydre pendant 3 x 10 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Infiltration de résine<ol><li>Infiltrez les blocs d’échantillons avec de la résine à gradient (voir tableau des matériaux) : acétone à résine 3:1 pendant 1 h, acétone à résine 1:1 pendant 2 h, acétone à résine 1:3 pendant 3 h.</li>
		<li>Remplacer par la résine pure pendant 3 x 12 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Enrobage de résine<ol><li>Transférez les blocs d’échantillons dans des capsules (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’un cure-dent.</li>
		<li>Ajouter de la résine pure dans la capsule contenant le bloc d’échantillon et polymériser la résine au four à 60 °C pendant 14 à 16 h.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Revêtement du verre de protection avec des nanoparticules d’or
<ol><li>Nettoyage des vitres<ol><li>Lavez les couvre-verres avec un tampon de nettoyage (voir tableau des matériaux) pendant 2 h à 142 °C.</li>
		<li>Rincer le tampon de nettoyage 3 x 10 min avec ddH2O.</li>
		<li>Transférez soigneusement les couvre-verres dans un bécher contenant de l’alcool éthylique anhydre et incubez pendant la nuit.</li>
		<li>Faites sécher les couvre-verres à l’air libre sur une paillasse propre pendant plusieurs minutes.</li>
	</ol></li>
	<li>Enduire les lunettes de protection de nanoparticules d’or.<ol><li>Fixez une lame de verre au centre de la rotation d’une centrifugeuse de bureau (voir Tableau des matériaux) à l’aide de ciment de verre.</li>
		<li>Montez un couvre-objet au centre de la lame de verre à l’aide de notes autocollantes.</li>
		<li>Ajouter 75 μL de pioloforme à 1 % (voir le tableau des matériaux) sur le couvre-viseur. NOTE : Nous avons également testé Formvar (voir tableau des matériaux) et il fonctionne bien.</li>
		<li>Essorer pendant 3 minutes à 1 360 × g (figure 2A) pour produire une fine couche de pioloforme à la surface du couvre-viseur.</li>
		<li>Incuber la surface du verre de protection avec 250 μL de poly-L-lysine à 0,1 % (voir le tableau des matériaux) pendant 1 h à température ambiante (figure 2B).</li>
		<li>Rincer avec du ddH2O et sécher à l’air libre pendant plusieurs minutes.</li>
		<li>Diluer 80 nm de nanoparticules d’or (voir Tableau des matériaux) avec du ddH2O à 25 % (v/v, OD600 = 0,07) (voir Tableau des matériaux) et soniser pendant 15 min.</li>
		<li>Incuber la surface du verre de couverture avec les nanoparticules d’or diluées pendant 1 h à température ambiante (figure 2C).</li>
		<li>Rincer avec du ddH2O et sécher à l’air libre pendant plusieurs minutes. REMARQUE : Il fonctionne bien 2 semaines après avoir été recouvert de nanoparticules de pioloforme et d’or. Mais nous vous recommandons de l’utiliser immédiatement après avoir été enduit.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Coupe ultrafine
<ol><li>Coupez la surface du bloc d’échantillon en un trapèze à angle droit. Couper des coupes à une épaisseur de 100 nm à l’aide d’un couteau diamanté (voir Tableau des matériaux) avec un ultramicrotome (voir Tableau des matériaux). Séparez une seule section de la bande de section et faites flotter la section unique dans le bain-marie.</li>
	<li>Ajoutez une goutte de ddH2O au centre du verre de protection recouvert de nanoparticules d’or. Prenez une section à l’aide d’une boucle d’échantillonnage et inversez la boucle d’échantillonnage sur la surface de la goutte d’eau. Retirez la boucle d’échantillonnage en laissant la section à la surface de la goutte d’eau.</li>
	<li>Séchez le couvre-objet à l’air libre pendant plusieurs minutes. Dessinez un anneau autour de la section du côté opposé du couvre-objet à l’aide d’un marqueur.</li>
</ol>5. Imagerie par microscopie optique
<ol><li>Récupération de fluorescence REMARQUE : Le flux de travail est illustré à la figure 3A.<ol><li>Ajoutez 10 μL de tampon de montage (voir tableau des matériaux) sur la section ultramince du verre de protection. Placez un nouveau couvre-objet propre sur le tampon de montage. REMARQUE : Le composant clé du tampon de montage est le DABCO, qui est utilisé pour récupérer la fluorescence des protéines fluorescentes. Ceci est très important pour la récupération de la fluorescence.</li>
		<li>Placez ces deux couvre-verres avec la section ultramince dans une chambre d’imagerie (voir le tableau des matériaux). Assurez-vous que le couvre-objet avec l’anneau dessiné est sur le dessus.</li>
	</ol></li>
	<li>Récupérez la carte de navigation.<ol><li>Trouvez la coupe en utilisant l’anneau dessiné comme marqueur en mode d’imagerie en fond clair d’un microscope à fluorescence inversée (voir Tableau des matériaux). Déplacez-vous vers un coin de la section. Allumez la lumière blanche et prenez l’image en fond clair.</li>
		<li>Éteignez la lumière blanche. Allumez le laser (561 nm) et prenez des images fluorescentes du même champ de vision (FOV).</li>
		<li>Éteignez le laser. Déplacez-vous vers le champ de vision adjacent, en vous assurant que ces deux champs de vision se chevauchent à 10 %. Prenez l’image en fond clair et l’image fluorescente du deuxième FOV.</li>
		<li>Répétez cette opération jusqu’à ce que toute la section soit couverte. Enregistrez le chemin d’imagerie qui peut être utilisé pour assembler le FOV. REMARQUE : Pour une meilleure qualité de l’image, nous vous recommandons d’utiliser le microscope confocal.</li>
	</ol></li>
	<li>Cellules d’images d’intérêt.<ol><li>Utilisez la carte de navigation pour cibler facilement les cellules d’intérêt. Allumez le laser (561 nm) et prenez 300 images fluorescentes de la cellule d’intérêt. Éteignez le laser.</li>
		<li>Allumez la lumière blanche et prenez des images séquentielles en fond clair (~100 images).</li>
		<li>Passez à une autre cellule d’intérêt.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Préparation à l’imagerie EM
REMARQUE : Le flux de travail est illustré à la figure 3B.
<ol><li>Transférez la section ultramince sur la grille de fente.<ol><li>Remplissez un bocal en verre avec du ddH2O.</li>
		<li>Retirez les couvre-verres de la chambre et séparez-les des deux couvre-verres avec une pince à épiler. Fixez le couvre-objet sur lequel se trouve la section, lavez le tampon de montage et séchez à l’air.</li>
		<li>Marquez un # autour de la section ultramince à l’aide d’une lame unilatérale et déposez 10 μL d’acide fluorhydrique à 12 % (voir le tableau des matériaux) à chaque coin du #. Mettez lentement le couvre-objet dans l’eau. REMARQUE : L’acide fluorhydrique réagit avec le verre, ce qui facilite le retrait du film pioloforme du verre de protection. L’acide fluorhydrique est toxique. Utilisez-le dans une cagoule chimique avec des gants. Le contact avec la peau nécessite des soins médicaux immédiats.</li>
		<li>Faites flotter le film pioloforme et la section ultramince à la surface de l’eau ensemble. Placez une grille de fente non revêtue sur la section pour capturer la section au centre de la grille.</li>
		<li>Recouvrez une lame de verre de parafilm (voir tableau des matériaux) et prenez la grille avec le film pioloforme. Séchez la grille à l’air libre à température ambiante.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloration de la section<ol><li>Tachez la section avec 2% d’UA et la triple avance de Sato. Pour plus de détails, voir le protocole2 publié précédemment.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Analyse d’images
<ol><li>Assemblez la carte de navigation.<ol><li>Trouvez l’emplacement des données brutes. Ouvrez le logiciel ImageJ (voir Table des matériaux) pour assembler la carte de navigation.</li>
		<li>Cliquez sur Plugins | Couture | Coutures quadrillées/collection | (Type) Grille : serpent par colonne | (Ordonnance) Haut et gauche (selon la séquence de tournage) | Définir la taille de la tranche | Sélectionner le chemin d’accès aux données | Définir le nom du fichier | Cochez la case Fusion d’affichage. Observez le résultat, qui est une carte de navigation composée de plusieurs images en fond clair de différents champs de vision.</li>
		<li>Utilisez la même méthode pour assembler une carte de navigation par fluorescence.</li>
	</ol></li>
	<li>Fusionnez les images en fond clair avec les images de fluorescence.<ol><li>Dans le logiciel ImageJ, cliquez sur Fichier | Importation | Séquence d’images pour importer les images séquentielles en fond clair de la cellule d’intérêt.</li>
		<li>Cliquez sur l’image | Piles | Projection Z | Additionner les tranches pour obtenir l’image SIP (Sum Intensity Projection) des images séquentielles en fond clair.</li>
		<li>Cliquez sur Modifier | Inverser pour inverser l’image SIP du fond clair afin que les signaux des nanoparticules d’or deviennent des points blancs brillants.</li>
		<li>Dans ImageJ, cliquez sur Fichier | Importation | Séquence d’images pour importer les images FM séquentielles.</li>
		<li>Cliquez sur l’image | Piles | Projection Z | Additionnez les tranches pour obtenir l’image SIP des images FM séquentielles.</li>
		<li>Cliquez sur l’image | Couleur | Fusionner les canaux pour fusionner l’image en fond clair SIP avec l’image SIP FM en tant qu’image composite.</li>
		<li>Les nanoparticules d’or sont vertes et la protéine fluorescente est rouge. Cliquez sur l’image | Type | Couleur RVB pour convertir le format de l’image composite en RVB.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Imagerie EM
<ol><li>Placez la grille sur la prise d’échantillon, en gardant le côté section de la grille vers le haut.</li>
	<li>Utilisez la carte de navigation pour identifier approximativement la position des cellules correspondantes au microscope électronique à travers quatre distances relatives aux quatre coins différents du trapèze droit de la section ultramince.</li>
	<li>Confirmez les cellules à l’aide des nanoparticules d’or.</li>
	<li>Prenez des images EM à différents grossissements (4 200x, 6 000x ou 8 200x) avec un microscope électronique à transmission (MET) (voir Tableau des matériaux).</li>
</ol>9. Enregistrement de l’image FM avec l’image EM
<ol><li>Ouvrez le logiciel d’enregistrement (voir Tableau des matériaux). Tapez easyCLEMv014dans la fenêtre de recherche. Cliquez sur easyCLEMv0 pour ouvrir easyCLEMv0. Cliquez sur Image/Séquence | Ouvre pour importer l’image EM et l’image composite dans le panneau du logiciel.</li>
	<li>Dans la fenêtre EasyCLEMv0, cliquez sur 2D (x,y,[T]) pour choisir non rigide (2D ou 3D) comme mode d’alignement.</li>
	<li>Dans la fenêtre EasyCLEMv0, cliquez sur la liste déroulante à droite de Sélectionner l’image qui sera transformée et redimensionnée (probablement FM) pour choisir Composite (RVB)color.tif. Ensuite, cliquez sur la liste déroulante à droite de Sélectionner l’image qui ne sera pas modifiée (probablement EM) pour choisir EMimage. tif.</li>
	<li>Cliquez sur Démarrer pour commencer l’inscription.</li>
	<li>Dans la fenêtre d’image EM nommée EMimage. tif, cliquez sur une nanoparticule d’or pour placer le point 1 sur la nanoparticule d’or. Dans la fenêtre d’image FM nommée Couleur composite (RVB).tif, cliquez sur la nanoparticule d’or correspondante pour placer le point 1 sur la nanoparticule d’or.</li>
	<li>Cliquez sur Mettre à jour la transformation pour confirmer le signal LM avec le signal EM des nanoparticules d’or.</li>
	<li>Répétez l’opération ci-dessus dans la fenêtre d’image EM nommée EMimage. tif et faites correspondre le signal LM avec le signal EM de la même nanoparticule d’or un par un.</li>
	<li>Cliquez sur Arrêter pour terminer l’inscription.</li>
	<li>Après l’alignement de l’image, cliquez sur Image superposée et cliquez sur Image/Séquence | Enregistrer sous pour exporter une pile d’images contenant quatre images de canaux (rouge, vert, bleu, gris).</li>
	<li>Ouvrez ImageJ et cliquez sur Fichier | Ouvrir pour importer l’image superposée . Cliquez sur l’image | Piles | Empiler sur les images pour séparer l’image superposée en quatre images de canal.</li>
	<li>Cliquez sur l’image | Couleur | Fusionner les canaux pour fusionner les images de trois canaux (rouge, vert et gris) en une image composite.</li>
	<li>Cliquez sur l’image | Type | Couleur RVB pour convertir l’image composite en image CLEM.</li>
</ol>

Nouveau protocole pour la fluorescence simultanée et la préservation des ultrastructures

<ol>
	<li>de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopy:+ultrastructure+lights+up.">Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up.</a> Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).</li><li>Kopek, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+protocols+for+correlative+super-resolution+fluorescence+imaging+and+electron+microscopy+of+chemically+fixed+samples.">Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples.</a> Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy.">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).</li><li>Johnson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+in-resin+super-resolution+and+electron+microscopy+using+standard+fluorescent+proteins.">Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins.</a> Sci Rep. 5 (1), 9583 (2015).</li><li>Paez-Segala, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation-resistant+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+CLEM.">Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM.</a> Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).</li><li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mEosEM+withstands+osmium+staining+and+Epon+embedding+for+super-resolution+CLEM.">mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM.</a> Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).</li><li>Kukulski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision.">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).</li><li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+fluorescent+proteins+for+dual-colour+post-embedding+CLEM.">Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM.</a> Cells. 11 (7), 1077 (2022).</li><li>Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+stable+fluorescent+proteins+for+advanced+microscopy.">Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy.</a> Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).</li><li>Tanida, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+in-resin+CLEM+of+Epon-embedded+cells+using+osmium+resistant+green+and+red+fluorescent+proteins.">Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins.</a> Sci Rep. 10 (1), 21871 (2020).</li><li>Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cytoplasmic+organelles+via+in-resin+CLEM+using+an+osmium-resistant+far-red+protein.">Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein.</a> Sci Rep. 10 (1), 11314 (2020).</li><li>MacManus, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excision+of+whole+intact+mouse+brain.">Excision of whole intact mouse brain.</a> MethodsX. 10, 102246 (2023).</li><li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+extracellular+space+for+high-quality+optical+and+ultrastructural+studies+of+whole+mammalian+brains.">Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains.</a> Cell Rep Methods. 3 (7), 24 (2023).</li><li>Paul-Gilloteaux, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eC-CLEM:+flexible+multidimensional+registration+software+for+correlative+microscopies.">eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies.</a> Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).</li><li>Fenno, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+dual-+and+triple-feature+intersectional+single-vector+delivery+of+diverse+functional+payloads+to+cells+of+behaving+mammals.">Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals.</a> Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).</li><li>Shcherbo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+fluorescent+tags+for+protein+imaging+in+living+tissues.">Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues.</a> Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).</li><li>Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+mCherry+variants+with+long+Stokes+shift,+red-shifted+fluorescence,+and+low+cytotoxicity.">Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity.</a> PLoS One. 12 (2), e0171257 (2017).</li><li>Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hue-shifted+monomeric+variants+of+Clavularia+cyan+fluorescent+protein:+identification+of+the+molecular+determinants+of+color+and+applications+in+fluorescence+imaging.">Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging.</a> BMC Biol. 6 (13), 1741 (2008).</li><li>Ogoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-color-emitting+green+fluorescent+protein+from+the+sea+cactus+Cavernularia+obesa+and+its+use+as+a+pH+indicator+for+fluorescence+microscopy.">Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy.</a> Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).</li><li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mScarlet:+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging.">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li><li>Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+Epon-embedding-based+correlative+super-resolution+light+and+electron+microscopy.">A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy.</a> Research Square. , (2019).</li><li>Johnson, E., Kaufmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+the+photoswitching+ability+of+standard+fluorescent+proteins+for+correlative+in-resin+super-resolution+and+electron+microscopy.">Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-liquid+phase+separation+mediates+the+formation+of+herpesvirus+assembly+compartments.">Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments.</a> J Cell Biol. 222 (1), 17 (2023).</li><li>Tao, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+characterization+of+excitatory+and+inhibitory+synapses+by+cryo-electron+tomography+and+correlative+microscopy.">Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy.</a> J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).</li></ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Le protocole présenté ici est une méthode d’imagerie polyvalente, qui peut combiner les informations de localisation de la protéine cible par microscopie optique (LM) et le contexte entourant la protéine cible par microscopie électronique (EM)6. Avec les limites des protéines fluorescentes actuelles, la méthode largement utilisée est la microscopie corrélative à la lumière et à l’électronium (CLEM), ce qui signifie que l’imagerie LM est effectuée avant la préparation de l’?...

La microscopie à fluorescence (FM) peut être utilisée pour obtenir la localisation et la distribution de la protéine cible. Cependant, le contexte qui entoure la protéine cible est perdu, ce qui est crucial pour étudier la protéine cible de manière approfondie. La microscopie électronique (EM) a la résolution d’imagerie la plus élevée, fournissant plusieurs détails subcellulaires. Néanmoins, EM manque d’étiquetage cible. En fusionnant avec précision l’image de fluorescence prise par FM avec l’image grise acquise par EM, la microscopie corrélative et électronique (CLEM) peut combiner les informations obtenues par ces deux modes d’imagerie 1,2,3,4.
CLEM est un compromis entre la fluorescence et l’ultrastructure1. En raison des limites des protéines fluorescentes actuelles et des procédures traditionnelles de préparation des échantillons EM, en particulier l’utilisation d’acide osmique (OsO4) et de résines hydrophobes telles que l’Epon, l’ultrastructure compromet toujours la fluorescence5. OsO4 est un réactif indispensable dans la préparation des échantillons EM, qui est utilisé pour améliorer le contraste des images EM. Comparé à d’autres résines d’enrobage, Epon est supérieur en termes de propriétés de conservation et de coupe des ultrastructures5. Cependant, aucune protéine fluorescente ne peut retenir le signal de fluorescence après le traitement d’OsO4 et d’Epon embedding6. Pour surmonter les limites des protéines fluorescentes, le CLEM de pré-intégration a été développé, dans lequel l’imagerie FM est effectuée avant la préparation de l’échantillon EM6. Cependant, l’inconvénient du CLEM pré-intégré est le recalage imprécis entre les images FM et EM5.
Au contraire, la méthode CLEM post-intégration effectue l’imagerie FM après la préparation de l’échantillon EM, dont la précision de repérage peut atteindre 6-7 nm 5,6. Pour conserver la fluorescence des protéines fluorescentes, de très faibles concentrations d’OsO4 (0,001 %)3 ou les méthodes de préparation EM congelées à haute pression (HPF) et de substitution par congélation (FS) 4,7 ont été utilisées au détriment de l’ultrastructure compromise ou du contraste de l’image EM. Le développement de mEos4b favorise grandement les progrès de CLEM post-intégration, bien que le méthacrylate de glycidyle soit utilisé comme résine d’enrobage5. Avec le développement de mEosEM, qui peut survivre à la coloration OsO4 et à l’enrobage d’Epon, le CLEM de super-encastrement post-enrobage d’Epon a été réalisé pour la première fois, en maintenant la fluorescence et l’ultrastructure simultanément6. Après mEosEM, plusieurs protéines fluorescentes capables de survivre à la coloration OsO4 et à l’enrobage d’Epon ont été développées 8,9,10,11. Cela favorise grandement le développement de CLEM.
Il y a trois aspects clés à Epon post-intégration CLEM. La première est la protéine fluorescente, qui doit maintenir le signal fluorescent après la préparation de l’échantillon EM. D’après notre expérience, mScarlet est supérieur aux autres protéines fluorescentes signalées. La seconde est de savoir comment trouver la même cellule imagée par imagerie FM en imagerie EM. Pour résoudre ce problème, nous améliorons la procédure de cette étape afin que l’on puisse facilement trouver la cellule ciblée. La dernière est la méthode pour aligner l’image FM avec l’image EM. Ici, nous détaillons le recalage entre les images FM et EM. Dans ce protocole, nous exprimons mScarlet dans les neurones VGLUT2 et démontrons que mScarlet peut cibler les lysosomes secondaires en utilisant le CLEM post-intégration d’Epon. Nous fournissons des détails étape par étape pour le CLEM post-enrobage Epon, sans compromettre la fluorescence et l’ultrastructure.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 M Phosphate Buffer (PB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaH2PO4 &#183; 2H2O+Na2HPO4 &#183; 12H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 M Tris-Cl (pH 8.5)</td>
			<td>Shanghai yuanye Bio-Technology</td>
			<td>R26284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% Glutaraldehyde (GA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A17876</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abbelight 3D</td>
			<td>Nanolnsights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10000418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>335213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioPhotometer D30</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaning buffer of cover glasses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-0715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>290734</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA</td>
			<td>SPI company</td>
			<td>GS02827</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop centrifuge</td>
			<td>WIGGENS</td>
			<td>MINICEN 10E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>DiATOME</td>
			<td>MX6353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30</td>
			<td>SPI company</td>
			<td>GS02823</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>2696953</td>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epon 812&#160;</td>
			<td>SPI company</td>
			<td>GS02659</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji image J</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10010618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold nanoparticles</td>
			<td>Corpuscular</td>
			<td>790120-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient resin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrofluoric acid</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10011118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10011218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Easy CLEMv0 Plugin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>A7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large gelatin capsules</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-89-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#160;&#382;12H2O</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10020318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#160;&#382;2H2O</td>
			<td>SCR</td>
			<td>20040718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMA</td>
			<td>SPI company</td>
			<td>GS02828</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide primers</td>
			<td>Takara Biomedical Technology (Beijing)</td>
			<td></td>
			<td>Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers&#160; 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscillating microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>SCR</td>
			<td>L01210302</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsO4 solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6&#183;3H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>SCR</td>
			<td>80096618</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4% PFA+0.1 M PB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pioloform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63148-65-2</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>25986-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6&#183;3H2O)&#160;</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10016818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S2771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handles</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S2896-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 &#176;C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2&#8211;3 months old, weight range 20-30 g.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope (TEM)</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>TECNAL G2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UA solution (2% UA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA EM UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate (UA)</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>19481</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epon post embedding correlative light and electron microscopy

La microscopie corrélative à la lumière et aux électrons (CLEM) est une microscopie complète qui combine les informations de localisation fournies par la microscopie à fluorescence (FM) et le contexte de l’ultrastructure cellulaire acquise par microscopie électronique (EM). CLEM est un compromis entre la fluorescence et l’ultrastructure, et généralement, l’ultrastructure compromet la fluorescence. Comparé à d’autres résines d’enrobage hydrophiles, telles que le méthacrylate de glycidyle, HM20 ou K4M, Epon est supérieur en termes de propriétés de préservation des ultrastructures et de sectionnement. Auparavant, nous avions démontré que mEosEM peut survivre à la fixation au tétroxyde d’osmium et à l’intégration d’Epon. En utilisant mEosEM, nous avons obtenu, pour la première fois, Epon post embedded CLEM, qui maintient simultanément la fluorescence et l’ultrastructure. Ici, nous fournissons des détails étape par étape sur la préparation de l’échantillon EM, l’imagerie FM, l’imagerie EM et l’alignement de l’image. Nous améliorons également les procédures d’identification de la même cellule imagée par imagerie FM pendant l’imagerie EM et détaillons l’alignement entre les images FM et EM. Nous pensons que l’on peut facilement réaliser la microscopie corrélative à la lumière et à la microscopie électronique post-intégration d’Epon en suivant ce nouveau protocole dans les installations EM traditionnelles.

Fluorescence microscopy (FM) can be used to obtain the localization and distribution of the target protein. However, the context that surrounds the target protein is lost, which is crucial for investigating the target protein thoroughly. Electron microscopy (EM) has the highest imaging resolution, providing several subcellular details. Nevertheless, EM lacks target labeling. By accurately merging the fluorescence image taken by FM with the gray image acquired by EM, correlative light and electron microscopy (CLEM) can combine the information obtained by these two imaging modes1,2,3,4.
CLEM is a trade-off between fluorescence and the ultrastructure1. Because of the limitations of current fluorescent proteins and the traditional EM sample preparation procedures, especially the use of osmic acid (OsO4) and hydrophobic resins such as Epon, the ultrastructure always compromises fluorescence5. OsO4 is an indispensable reagent in EM sample preparation, which is used to improve the contrast of EM images. Compared with other embedding resins, Epon is superior in ultrastructure preservation and sectioning properties5. However, no fluorescent proteins can retain the fluorescence signal after the treatment of OsO4 and Epon embedding6. To overcome the limitations of fluorescent proteins, pre embedding CLEM was developed, in which FM imaging is done before EM sample preparation6. However, the drawback of pre embedding CLEM is the imprecise registration between the FM and the EM images5.
On the contrary, post embedding CLEM method performs the FM imaging after the EM sample preparation, the registration accuracy of which can reach 6-7 nm5,6. To retain the fluorescence of fluorescent proteins, very low concentrations of OsO4 (0.001%)3 or the high-pressure frozen (HPF) and freeze substitution (FS) EM preparation methods4,7 have been used at the expense of compromised ultrastructure or the contrast of the EM image. The development of mEos4b greatly promotes the progress of post embedding CLEM, although glycidyl methacrylate is used as the embedding resin5. With the development of mEosEM, which can survive the OsO4 staining and Epon embedding, Epon post embedding super-resolution CLEM was achieved for the first time, maintaining the fluorescence and ultrastructure simultaneously6. After mEosEM, several fluorescent proteins that can survive the OsO4 staining and the Epon embedding were developed8,9,10,11. This greatly promotes the development of CLEM.
There are three key aspects to Epon post-embedding CLEM. The first is the fluorescent protein, which should maintain the fluorescent signal after EM sample preparation. According to our experience, mScarlet is superior to other reported fluorescent proteins. The second is how to find the same cell imaged by FM imaging in EM imaging. To solve this problem, we improve the procedure for this step so that one can readily find the targeted cell. The last is the method to align the FM image with the EM image. Here, we detail the registration between the FM and the EM images. In this protocol, we express mScarlet in VGLUT2 neurons and demonstrate that mScarlet can target secondary lysosomes using Epon post-embedding CLEM. We provide step-by-step details for Epon post-embedding CLEM, without compromising the fluorescence and the ultrastructure.

Pleins feux sur l’auteur : Progrès de la microscopie corrélative à la lumière et de la microscopie électronique avec préservation des protéines fluorescentes

Microscopie corrélative à la lumière et à la microscopie électronique post-intégration d’Epon

Correlative light and electron microscopy is a completely stable microscopy technique, which can combine the localization information provided by fluorescent microscopy and is the ultra structure by electron microscopy. However, the mentality of this technique is to preserve the fluorescence of after you have a simple preparation. Using this fluorescent protein, we can achieve correlative light and the electron microscope which can maintain fluorescence and ultra structure simultaneously.

Des rapports antérieurs ont démontré que mScarlet peut cibler le lysosome15. Dans ce protocole, mScarlet exprimant l’AAV (rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA) a été injecté dans le M1 (ML : ±1,2 AP : +1,3 DV : -1,5) du cerveau de souris Vglut2-ires-cre à l’aide d’instruments stéréotaxiques. En suivant le protocole décrit ci-dessus, l’image corrélée finale est présentée à la figure 4A. L’image FM peut être alignée avec précision...

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Nous présentons un protocole détaillé pour la microscopie corrélative à la lumière et à la lumière électronique post-intégration d’Epon en utilisant une protéine fluorescente appelée mScarlet. Cette méthode permet de maintenir simultanément la fluorescence et l’ultrastructure. Cette technique se prête à une grande variété d’applications biologiques.

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a comprehensive microscopy that combines the localization information provided by fluorescence ...

La microscopie corrélative à la lumière et à l’électronique est une technique de microscopie totalement stable, qui peut combiner les informations de localisation fournies par la microscopie fluorescente et constitue l’ultrastructure par microscopie électronique. Cependant, la mentalité de cette technique est de préserver la fluorescence après avoir une préparation simple. En utilisant cette protéine fluorescente, nous pouvons obtenir une lumière corrélative et le microscope électronique qui peut maintenir simultanément la fluorescence et l’ultra-structure.

epon-post-embedding-correlative-light-and-electron-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

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Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Progrès de la microscopie corrélative à la lumière et de la microscopie électronique avec préservation des protéines fluorescentes