يشكر المؤلفون الدكتورة كارين لولييه على الوصول إلى خط الماوس المعدل وراثيا MAGIC-Markers. يشكر المؤلفون أيضا مرفق RAM-Neuro الحيواني الأساسي ومرفق التصوير بالرنين المغناطيسي ، وهو عضو في البنية التحتية الوطنية France-BioImaging التي تدعمها وكالة البحوث الوطنية الفرنسية (ANR-10-INBS-04 ، "الاستثمارات من أجل المستقبل"). تم دعم هذا البحث من قبل برنامج ATIP-Avenir ، Inserm ، Région Occitanie ، جامعة مونبلييه ، الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث (ANR-21-CE17-0061) ، مؤسسة البحوث الطبية (FRM Regenerative Medicine ، REP202110014140) ، ومؤسسة Groupama.

تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل المجلس الوطني للتجارب الحيوانية.
1. الاستعدادات
<ol><li>تحضير محلول مخدر من الكيتامين زيلازين للتخدير. حقن الكيتامين بمعدل 80 ملغم/كغ والزيلازين عند 10 ملغم/كغ عن طريق تخفيف 200 ميكرولتر من الكيتامين (100 ملغم/مل) و125 ميكرولتر من الزيلازين (20 ملغ/مل) في 2175 مل من كلوريد الصوديوم المعقم 0.9٪.</li>
	<li>تحضير محلول البوبرينورفين 0.02 مجم / مل كمحلول مسكن عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 0.3 مجم / مل من البوبرينورفين إلى 1400 مل من كلوريد الصوديوم المعقم 0.9٪.</li>
	<li>تحضير محلول تلطيخ الفلورسنت.<ol><li>استخدم مقياسا دقيقا لوزن 10 مجم من ملح الفلوريسئين وقم بتخفيفه في 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) للحصول على محلول فلوريسئين 0.1٪.</li>
		<li>حماية الحل من الضوء ويهز لمدة 5 دقائق. استخدم حقنة سعة 10 مل ومرشح حقنة 0.2 ميكرومتر لتصفية المحلول. ملاحظة: يجب حماية محلول الفلورسنت من الضوء ويمكن تخزينه عند +4 درجة مئوية لمدة 5 أيام.</li>
	</ol></li>
	<li>تحضير الماوس<ol><li>وزن الفأر وتحفيز التخدير عن طريق إجراء حقن داخل الصفاق من 10 ميكرولتر / غرام من وزن الفأر (MW) من محلول التخدير. عندما يتوقف الماوس عن الحركة ، ضعه على طبق ساخن (37 درجة مئوية) وتحقق من تخديره تماما عن طريق قرص أصابع قدميه.</li>
		<li>ضع قطرة من المسيل للدموع الاصطناعية على العين التي تخضع للجراحة وقطرة من هلام العين على العين المقابلة.</li>
		<li>بمجرد أن لا يستجيب الفأر للقرص ، قم بحقن التسكين (0.02 مجم / مل من البوبرينورفين) عند 5 ميكرولتر / جم من MW لتوفير 0.1 مجم / كجم من البوبرينورفين تحت الجلد في الرقبة.</li>
	</ol></li>
</ol>2. تآكل القرنية
<ol><li>اتبع الخطوة 1.3 لتحضير محلول تلطيخ الفلورسنت.</li>
	<li>اتبع الخطوة 1.4 لتحضير الماوس.</li>
	<li>قبل القيام بالتآكل ، اغمس نتوء العين في 70٪ EtOH ثم في برنامج تلفزيوني لتنظيفه.</li>
	<li>ضع الماوس على طبق ساخن (37 درجة مئوية) على الجانب للوصول بسهولة إلى العين التي تخضع للجراحة.<ol><li>استخدم قطعة قطن لامتصاص الدموع الاصطناعية وفرشاة الرموش بعيدا دون لمس العين.</li>
		<li>قم بتشغيل لدغ العين ، وافتح جفن الماوس بإصبعين ، وقم في نفس الوقت بسد الاهتزازات لتجنب تعلقها في الأزيز.</li>
	</ol></li>
	<li>توطين التلميذ أو مركز العين وتطبيق نتوء العين على سطح العين ، والقيام بحركات دائرية. من خلال النظر عن كثب ، يمكن ملاحظة سطح الظهارة التي تمت إزالتها. خلاف ذلك ، قم بحوالي 20 حركة دائرية على القرنية.</li>
	<li>ضع الفأر مرة أخرى على بطنه وتحقق مما إذا كان هلام العين لا يزال موجودا في العين المقابلة.</li>
	<li>ضع قطرة من محلول تلطيخ الفلورسنت على العين المتآكلة وانتظر لمدة 20 ثانية. امتصاص القطرة بمنديل دون لمس العين وشطفها بقطرة من المسيل للدموع الاصطناعية. امتصاص قطرة المسيل للدموع الاصطناعية مع الأنسجة وإلقاء الضوء على العين مع مصباح الكوبالت الأزرق. ملاحظة: يجب أن يكون للتآكل شكل دائري. يتطلب بعض التدريب للحصول عليه.</li>
	<li>ضع قطرة من جل العين على العين المتآكلة واترك الماوس يستيقظ على الوسادة الساخنة. عندما يتحرك الماوس من تلقاء نفسه ، أعده إلى قفصه.</li>
	<li>تحقق من رفاهية خلال الأيام التالية 2.</li>
	<li>بعد استخدام لدغ العين ، استخدم منديلا رخويا لإزالة الخلايا الظهارية العالقة في رأس النتوء وغمسها في 70٪ EtOH ثم PBS. ملاحظة: بمجرد إزالة الخلايا الظهارية بالأنسجة الرخوة ، تأكد من عدم وجود قطع من الأنسجة عالقة في رأس الأزيز.</li>
</ol>3. استئصال أعصاب القرنية
<ol><li>اتبع الخطوة 1.4 لتحضير الماوس.</li>
	<li>ضع الفأر تحت عدسة مجهر على الجانب للوصول إلى العين التي تخضع للجراحة. ضع الجزء السفلي من طبق بتري تحت رأس الماوس حتى تكون العين أفقية. ملاحظة: سيتم تنفيذ الخطوات التالية من خلال النظر من خلال العدسة مجهر.</li>
	<li>قم بإزالة المسيل للدموع الاصطناعية بقطعة قطن وإزالة الرموش دون لمس العين.</li>
	<li>ضع كماشة منحنية ناعمة تحت عين لإخراجه من المدار. تأكد من إغلاق الزردية بما يكفي حتى لا تتمكن العين من العودة إلى المدار بمجرد الضغط ، ولكن ليس بشكل مفرط لمنع تلف العصب البصري.</li>
	<li>ضع لكمة الخزعة 2.5 مم عموديا على العين دون ضغط لضمان التلامس التام للثقب مع سطح القرنية. ملاحظة: بمجرد تطبيق اللكمة على القرنية ، قد تتداخل يد المجرب مع مجال الرؤية.</li>
	<li>ثم ابدأ في الضغط ولف اللكمة عدة مرات. ملاحظة: اعتمادا على الضغط ، قد يختلف عدد الالتواءات ، ولكن بشكل عام يكون حوالي 5. يتطلب التدريب ليشعر بالضغط والحركة المناسبين. إذا تم تطبيق الكثير من الضغط ، تمزق العين. في هذه الحالة ، يمكن ملاحظة خروج السائل من الآفة وتليين العين. يجب التضحية بالحيوان.</li>
	<li>إزالة لكمة الخزعة. يجب أن تكون الدائرة مرئية على القرنية حيث تم تطبيق لكمة الخزعة. ملاحظة: الخطوات التالية لا تتطلب العدسة مجهر.</li>
	<li>تحقق مما إذا كانت العين المقابلة لا تزال تحتوي على هلام العين وقم بتطبيق بعضها على العين المحورية.</li>
	<li>دع الفأر يستيقظ على وسادة ساخنة (37 درجة مئوية) وأعده إلى قفصه عندما يتحرك من تلقاء نفسه.</li>
	<li>تحقق من رفاهية خلال الأيام التالية 2.</li>
</ol>4. القرنية تجهيز جبل كامل
<ol><li>جمع العينات وتثبيتها.<ol><li>وزن الفأر والحث على التخدير عن طريق إجراء حقن داخل الصفاق من 10 ميكرولتر / غرام من وزن الماوس (MW) من محلول التخدير.</li>
		<li>عندما يتوقف الماوس عن الحركة وليس لديه ردود فعل عن طريق معسر إصبع القدم ، قم بإجراء خلع عنق الرحم.</li>
		<li>أخرج العين من المدار باستخدام إصبعين وقم باستئصال العين عن طريق قطع العصب البصري باستخدام مقص منحني.</li>
		<li>ضع العين في أنبوب بلاستيكي سعة 2 مل يحتوي على برنامج تلفزيوني.</li>
		<li>ثبت العين عن طريق استبدال PBS ب 4٪ بارافورمالدهيد ووضعه على شاكر (30 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة.</li>
		<li>شطف 3 مرات لمدة 10 دقائق مع برنامج تلفزيوني في RT على شاكر (30 دورة في الدقيقة).</li>
	</ol></li>
	<li>تشريح القرنية<ol><li>ضع قطرة من برنامج تلفزيوني على قطعة من البارافيلم داخل طبق بتري.</li>
		<li>ضع العين في هذه القطرة من برنامج تلفزيوني.</li>
		<li>ضع طبق بتري تحت العدسة مجهر.</li>
		<li>تشريح القرنية باستخدام مقص التشريح المجهري والملقط. قطع فوق الجسم الهدبي للحفاظ على limbus.</li>
		<li>قم بإزالة العدسة والجسم الهدبي والقزحية باستخدام ملقط ناعم.</li>
		<li>ضع القرنية مرة أخرى في أنبوب بلاستيكي سعة 2 مل.</li>
	</ol></li>
	<li>بروتوكول التألق المناعي<ol><li>احتضان القرنية في 2 مل من 2.5٪ جيلاتين جلد السمك ، 5٪ مصل الماعز ، و 0.5٪ منظف في PBS لمدة 1 ساعة في RT على شاكر (30 دورة في الدقيقة).</li>
		<li>احتضان القرنية في 150 ميكرولتر من محلول يحتوي على 2.5٪ جيلاتين جلد السمك ، و 5٪ مصل الماعز ، و 0.1٪ منظف في PBS يحتوي على الجسم المضاد الأساسي المخفف عند 1/1000 (الجسم المضاد للتوبولين βIII) طوال الليل عند 4 درجات مئوية على شاكر (30 دورة في الدقيقة).</li>
		<li>شطف 3 مرات لمدة 1 ساعة مع 0.1 ٪ المنظفات في PBS في RT على شاكر (30 دورة في الدقيقة).</li>
		<li>احتضان القرنية في نفس المحلول كما في الخطوة 4.3.2 ، التي تحتوي على الجسم المضاد الثانوي المخفف عند 1/500 طوال الليل عند 4 درجات مئوية على شاكر (30 دورة في الدقيقة).</li>
		<li>شطف 3 مرات لمدة 1 ساعة مع PBS في RT على شاكر (30 دورة في الدقيقة).</li>
		<li>احتضان القرنية لمدة 10 دقائق مع 150 ميكرولتر من مقحم الحمض النووي المخفف عند 1/5000 في RT على شاكر (30 دورة في الدقيقة).</li>
		<li>شطف 2 مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني.</li>
	</ol></li>
	<li>تصاعد القرنية<ol><li>ضع القرنية على شريحة ، ظهارة تواجه الشريحة ، واستخدم مشرطا لإنشاء أربعة أقسام دون الوصول إلى المركز. ملاحظة: قم بعمل الأقسام المقابلة لبعضها البعض لتشكيل شكل زهرة.</li>
		<li>ضع بطانة القرنية في مواجهة الشريحة وقم بإزالة PBS حول القرنية باستخدام منديل. ملاحظة: لا تقم بإزالة برنامج تلفزيوني تحت القرنية; خلاف ذلك ، قد تظهر فقاعات الهواء. إذا كان الأمر كذلك ، أضف برنامج تلفزيوني إلى القرنية وقم بإزالة فقاعة الهواء. ثم أعد التشغيل من الخطوة 4.3.2.</li>
		<li>أضف لصق النموذج على الزوايا الأربع لغطاء مستطيل. ملاحظة: يرفع معجون النموذج غطاء الغطاء لأن القرنية عبارة عن نسيج سميك.</li>
		<li>قم بإسقاط 50 ميكرولتر من وسط التثبيت على القرنية وضع الغطاء أعلاه بعناية لتجنب تكوين الفقاعة.</li>
		<li>أغلق الغطاء بطلاء الأظافر.</li>
	</ol></li>
	<li>التصوير<ol><li>ضع الشريحة تحت المجهر الفلوري.</li>
		<li>حدد حجم الفسيفساء وعمق الصورة وابدأ عملية الاستحواذ.</li>
		<li>قم بتطبيق برنامج إزالة الضبابية وإزالة الالتفاف على الصورة المكتسبة. ملاحظة: الخطوة 4.6.3 هي خيار محدد في برنامج الاستحواذ (المقاصة الحسابية كبيرة الحجم [LVCC])</li>
	</ol></li>
</ol>5. الاجتثاث بالليزر الموضعي لأعصاب القرنية
<ol><li>قم بتشغيل المجهر متعدد الفوتون المستقيم والليزر جنبا إلى جنب مع مذبذب حدودي بصري. قم بتنشيط المرحلة الساخنة للمجهر (37 درجة مئوية) واضبط الليزر على 850 نانومتر و 1100 نانومتر ، بما يتوافق مع الأطوال الموجية المطلوبة لنموذج الماوس.</li>
	<li>استخدم مقياس الطاقة لضبط طاقة الليزر في وقت واحد عند حوالي 20 ميجاوات.</li>
	<li>اتبع الخطوة 1.4 لتحضير الماوس وتطبيق هلام العين على كلتا العينين. ملاحظة: يجب أن يكون المستخدم في هذا البروتوكول من خط فأر معدل وراثيا (MAGIC-Marker للفأرالمعدل وراثيا 21) يعبر عن فلوروفور داخلي المنشأ في الألياف العصبية للقرنية.</li>
	<li>تثبيت في حامل الرأس. أدر 90 درجة للعين المثيرة للاهتمام لمواجهة السقف.</li>
	<li>اربط اهتزازات لتنظيف منطقة العين. اربط جسم لتقليل حركة الرأس الناتجة عن التنفس.</li>
	<li>ضع غطاء دائريا على العين فوق جل العين. يجب أن يكون غطاء الغطاء أفقيا. لا تتردد في تحريك رأس حتى يتم وضع الغطاء بشكل صحيح.</li>
	<li>أضف قطرة من PBS فوق قسيمة الغلاف. ضع على مرحلة المجهر بعناية واضبط البرج الموضوعي على المسافة الصحيحة.</li>
	<li>استخدم الهدف المائي 20x و epifluorescence لتوطين العين والتعصيب من خلال العدسة.</li>
	<li>قم بتنشيط الليزر وتحديد العمق الذي يجب إضاءته.</li>
	<li>احصل على صورة بدقة 1024 × 1024 (بكسل) بسرعة اكتساب تتراوح بين 70٪ و85٪ من الحد الأقصى لسرعة المسح الضوئي.</li>
	<li>بمجرد الحصول على الصورة ، أخرج من المجهر وقم بإزالة غطاء الغطاء والأشرطة. أخرج من حامل الرأس ، وأضف المزيد من جل العين إذا لزم الأمر ، واتركه يستيقظ في قفص على طبق ساخن. ملاحظة: يمكن ملاحظة تدمير التعصيب بعد 1 أسبوع من التصوير. يمكن تكرار هذا البروتوكول مرة واحدة في الأسبوع لعدة أسابيع لزيادة الضرر الناجم عن الليزر.</li>
	<li>عندما يتحرك من تلقاء نفسه ، ضع القفص مرة أخرى في الإسطبل وتحقق من سلامته لمدة 2 أيام التالية.</li>
</ol>

بروتوكولات تلف الألياف الحسية للقرنية لدراسات تجديد المحور العصبي

<ol>
	<li>Marfurt, C. F., Cox, J., Deek, S., Dvorscak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+human+corneal+innervation.">Anatomy of the human corneal innervation.</a> Exp Eye Res. 90 (4), 478-492 (2010).</li><li>Al-Aqaba, M. A., Dhillon, V. K., Mohammed, I., Said, D. G., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+nerves+in+health+and+disease.">Corneal nerves in health and disease.</a> Prog Retin Eye Res. 73, 100762 (2019).</li><li>Dua, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+keratopathy.">Neurotrophic keratopathy.</a> Prog Retin Eye Res. 66, 107-131 (2018).</li><li>Bonini, S., Rama, P., Olzi, D., Lambiase, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+keratitis.">Neurotrophic keratitis.</a> Eye. 17 (8), 989-995 (2003).</li><li>Barrientez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+Injury:+Clinical+and+molecular+aspects.">Corneal Injury: Clinical and molecular aspects.</a> Exp Eye Res. 186, 107709 (2019).</li><li>Willmann, D., Fu, L., Melanson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+Injury.">Corneal Injury.</a> StatPearls. , (2023).</li><li>Kalha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1++progenitor+cell+dynamics+in+murine+cornea+during+homeostasis+and+wound+healing.">Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing.</a> Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).</li><li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+roles+of+nitrate+and+nitrite+in+nitric+oxide+metabolism+in+the+eye.">Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye.</a> Sci Rep. 10 (1), 13166 (2020).</li><li>Ikkala, K., Stratoulias, V., Michon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+corneal+insult+in+Zebrafish+results+in+a+bilateral+cell+shape+and+identity+modification,+supporting+wound+closure.">Unilateral corneal insult in Zebrafish results in a bilateral cell shape and identity modification, supporting wound closure.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substance+P+promotes+diabetic+corneal+epithelial+wound+healing+through+molecular+mechanisms+mediated+via+the+Neurokinin-1+receptor.">Substance P promotes diabetic corneal epithelial wound healing through molecular mechanisms mediated via the Neurokinin-1 receptor.</a> Diabetes. 63 (12), 4262-4274 (2014).</li><li>Zhao, W., He, X., Liu, R., Ruan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+corneal+wound+healing+using+exosome-mediated+targeting+of+NF-&#954;B+c-Rel.">Accelerating corneal wound healing using exosome-mediated targeting of NF-&#954;B c-Rel.</a> Inflamm Regen. 43 (1), 6 (2023).</li><li>Downie, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+the+sub-basal+nerve+plexus+and+superficial+nerve+terminals+after+corneal+epithelial+injury+in+mice.">Recovery of the sub-basal nerve plexus and superficial nerve terminals after corneal epithelial injury in mice.</a> Exp Eye Res. 171, 92-100 (2018).</li><li>He, J., Pham, T. L., Kakazu, A. H., Bazan, H. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+substance+P+sensory+nerves+and+transient+receptor+potential+melastatin+8+(TRPM8)+cold+receptors+after+corneal+experimental+surgery.">Remodeling of substance P sensory nerves and transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) cold receptors after corneal experimental surgery.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (7), 2449-2460 (2019).</li><li>Bandeira, F., Yusoff, N. Z., Yam, G. H. -. F., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+reinnervation+following+refractive+surgery+treatments.">Corneal reinnervation following refractive surgery treatments.</a> Neural Regen Res. 14 (4), 557-565 (2019).</li><li>Erie, J. C., McLaren, J. W., Hodge, D. O., Bourne, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+corneal+subbasal+nerve+density+after+PRK+and+LASIK.">Recovery of corneal subbasal nerve density after PRK and LASIK.</a> Am J Ophthalmol. 140 (6), 1059-1064.e1 (2005).</li><li>Coleman, M. P., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration,+WldS,+and+Nmnat.">Wallerian degeneration, WldS, and Nmnat.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).</li><li>Arenas, E., Esquenazi, S., Anwar, M., Terry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellar+corneal+transplantation.">Lamellar corneal transplantation.</a> Surv Ophthalmol. 57 (6), 510-529 (2012).</li><li>Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+innervation+and+cellular+changes+after+corneal+transplantation:+An+in+vivo+confocal+microscopy+study.">Corneal innervation and cellular changes after corneal transplantation: An in vivo confocal microscopy study.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (2), 621-626 (2007).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).</li><li>Volatier, T., Schumacher, B., Cursiefen, C., Notara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+protection+in+the+cornea:+Failure+and+rescue.">UV protection in the cornea: Failure and rescue.</a> Biology. 11 (2), 278 (2022).</li><li>Loulier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+cell+and+lineage+tracking+with+combinatorial+labels.">Multiplex cell and lineage tracking with combinatorial labels.</a> Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).</li><li>Dana, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+on+the+identification,+diagnosis,+and+treatment+of+neurotrophic+keratopathy.">Expert consensus on the identification, diagnosis, and treatment of neurotrophic keratopathy.</a> BMC Ophthalmol. 21 (1), 327 (2021).</li><li>Matsumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+serum+application+in+the+treatment+of+neurotrophic+keratopathy.">Autologous serum application in the treatment of neurotrophic keratopathy.</a> Ophthalmology. 111 (6), 1115-1120 (2004).</li><li>Bonini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+randomized,+double-masked,+vehicle-controlled+trial+of+recombinant+human+nerve+growth+factor+for+neurotrophic+keratitis.">Phase II randomized, double-masked, vehicle-controlled trial of recombinant human nerve growth factor for neurotrophic keratitis.</a> Ophthalmology. 125 (9), 1332-1343 (2018).</li><li>Aggarwal, S., Colon, C., Kheirkhah, A., Hamrah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+autologous+serum+tears+for+treatment+of+neuropathic+corneal+pain.">Efficacy of autologous serum tears for treatment of neuropathic corneal pain.</a> Ocul Surf. 17 (3), 532-539 (2019).</li><li>Singh, N. P., Said, D. G., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellar+keratoplasty+techniques.">Lamellar keratoplasty techniques.</a> Indian J Ophthalmol. 66 (9), 1239-1250 (2018).</li><li>Gautier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV2/9-mediated+gene+transfer+into+murine+lacrimal+gland+leads+to+a+long-term+targeted+tear+film+modification.">AAV2/9-mediated gene transfer into murine lacrimal gland leads to a long-term targeted tear film modification.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 1-16 (2022).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

يعتبر التهاب القرنية العصبي مرضا نادرا يصيب 5 من كل 10000 فرد. ومع ذلك ، فإن الأشخاص الذين يعانون من NK بسبب إصابة جسدية مثل الحروق الكيميائية ، أو متلازمات مثل مرض السكري أو التصلب المتعدد غير مدرجين في تلك الإحصاءات3. علاوة على ذلك ، لا تزال هذه الحالة غير مشخصة بشكل كبير<sup class="xref"...

تتكون القرنية، وهي السطح الشفاف للعين، من ثلاث طبقات متميزة: الظهارة، والسدى والبطانة. يحتوي هذا العضو على أعلى كثافة للتعصيب في الجسم ويتكون بشكل أساسي من ألياف حسية (النوعان Aδ و C) تنشأ من فرع العيون من العقدة ثلاثية التوائم. تخترق الألياف الحسية محيط القرنية في منتصف السدى على شكل حزم كبيرة تتفرع لتغطية السطح. ثم تتشعب لتخترق غشاء بومان وتشكل الضفيرة تحت القاعدية ، والتي يمكن التعرف عليها بسهولة عن طريق تكوين دوامة في وسط القرنية. تنتهي هذه الألياف كنهايات عصبية حرة على السطح الخارجي للظهارة. فهي قادرة على تحويل المحفزات الحرارية والميكانيكية والكيميائية وإطلاق العوامل الغذائية الضرورية لتوازن الظهارة 1,2. التهاب القرنية العصبي (NK) هو مرض تنكسي يؤثر على التعصيب الحسي للقرنية. ينبع هذا المرض النادر من انخفاض أو فقدان حساسية القرنية مما يؤدي إلى انخفاض إنتاج الدموع وضعف خصائص الشفاء من القرنية3. يتقدم NK من خلال ثلاث مراحل موصوفة جيدا ، من المرحلة 1 حيث يعاني المرضى من عيوب ظهارية ، إلى المرحلة 3 حيث يحدث ذوبان اللحمة و / أو ثقب القرنية4.
سريريا ، يمكن أن تكون أصول هذا المرض متنوعة. يمكن للمرضى فقدان تعصيب القرنية بعد الإصابة الجسدية للعين أو الجراحة أو من خلال الأمراض المزمنة ، مثل مرض السكري 5,6. حتى الآن ، لا تزال عملية التسبب في NK غير مفهومة بشكل جيد ، والخيارات العلاجية لهذه الحالة التي تهدد البصر محدودة للغاية. لذلك ، هناك حاجة إلى فهم أفضل لخصائص العيوب الظهارية لفهم الآليات الكامنة وراء تجديد تلك الألياف بشكل أفضل وربما تعزيزها. هنا ، نقترح عدة نماذج لإصابة القرنية التي تحفز NK في الفئران.
النموذج الأول هو تآكل الطبقة الظهارية للقرنية مع لدغ العين. تمت دراسة هذا النموذج بشكل أساسي في سياق تجديد الظهارة في المختلفة ، مثل القوارض والأسماك7،8،9 ، واختبار الجزيئات التي تعزز شفاء القرنية10،11. من الناحية الفسيولوجية ، يستغرق الأمر 2-3 أيام حتى تغلق الخلايا الظهارية الجرح. ومع ذلك ، فإن النمط الفسيولوجي للتعصيب يستغرق أكثر من أربعة أسابيع للتعافي من التآكل12,13. أثناء الجراحة ، يزيل نتوء العين الطبقة الظهارية للقرنية التي تحتوي على الضفيرة تحت القاعدية والنهايات العصبية الحرة للألياف. يمكن مقارنة هذا الإجراء سريريا بالمرضى الذين يعانون من استئصال القرنية الانكساري الضوئي (PRK) لتصحيح عيوب انكسار العين. يتكون الإجراء من إزالة ظهارة القرنية ثم إعادة تشكيل السدى باستخدام الليزر14. يمكن للمرضى تجربة العديد من الآثار الجانبية بعد هذه الجراحة ، مثل انخفاض كثافة عصب القرنية لمدة 2 سنوات وانخفاض في الحساسية لمدة 3 أشهر إلى سنة واحدة بعدالجراحة 15. بالنظر إلى أن الجراحة تؤدي إلى هشاشة البيئة المكروية للقرنية ، يمكن أن يساعد هذا النموذج في التحقيق في هذه الآثار الجانبية وتطوير مناهج علاجية من شأنها تعزيز إعادة التعصيب بشكل أسرع ، وبالتالي تقليل الآثار الجانبية المعنية.
يتكون النموذج الثاني من تقسيم المحاور العصبية في محيط القرنية باستخدام خزعة ، مما يؤدي إلى تنكس والر للتعصيب المركزي 16. سريريا ، يمكن مقارنة هذه الطريقة برأب القرنية الصفائحي الأمامي ، حيث يدرك الجراح عملية نقوش جزئية للقرنية لإزالة جزء من السماكة الأمامية للقرنية واستبدالها بزرع متبرع 17. بعد رأب القرنية الرقائقي ، قد يعاني المرضى من عدد من الأعراض بما في ذلك جفاف العين وفقدان تعصيب القرنية ورفض الكسب غير المشروع18. يمكن أن يوفر نموذج بضع البديهية هذا الذي يتم إجراؤه على أعصاب القرنية نظرة ثاقبة لآليات تنكس الألياف ، والذي يحدث بعد الكسب غير المشروع ، يليه تجديد المحاور.
الطريقة الثالثة تدمر أعصاب القرنية بالليزر. باستخدام مجهر متعدد الفوتونات على قرنية المخدرة ، يحدث تنكس الأعصاب المترجمة في المجال البصري نتيجة لتكوين أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، مما يؤدي إلى تلف الحمض النووي والتجويف الخلوي19. تلخص هذه الطريقة التلف الضوئي للقرنية الناجم عن التعرض المفرط للأشعة فوق البنفسجية الطبيعية (حروق الشمس) ، والتي تؤدي أيضا إلى تكوين أنواع الأكسجين التفاعلية ، مما يؤدي إلى تلف الحمض النووي20. يعاني المرضى الذين يعانون من حروق الشمس في القرنية من ألم شديد ، حيث أن تدهور الخلايا الظهارية يحرم أطراف ألياف القرنية من الجميع.
تم تصميم الطرق الثلاث الموضحة هنا لتمكين التحقيق في عملية التسبب في NK وتجديد المحور العصبي. فهي قابلة للتكرار بسهولة ودقيقة. علاوة على ذلك ، فهي تسمح بالشفاء السريع والمراقبة السهلة للحيوانات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m seringe filter</td>
			<td>CLEARLINE</td>
			<td>51733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm rust ring remover</td>
			<td>Alger Equipment Company</td>
			<td>BU-5S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL plastic tubes</td>
			<td>Eppendrof&#160;</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Algerbrush burr, Complete instrument</td>
			<td>Alger Equipment Company</td>
			<td>BR2-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta III Tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigenfix</td>
			<td>Diapath</td>
			<td>P0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tear</td>
			<td>Larmes artificielles Martinet</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprecare</td>
			<td>Animalcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Any provider</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SGM 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated plate</td>
			<td>BIOSEB LAB instruments</td>
			<td>BIO-HE002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalgene 1000</td>
			<td>BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France</td>
			<td>N/A</td>
			<td>French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Large volume computational clearing (LVCC) process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Chameleon Ultra II</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser power meter</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Thunder Imager Tissue microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocry-gel</td>
			<td>TVM lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parametric oscillator</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penlights with blue cobalt filtercap</td>
			<td>Bernell</td>
			<td>ALPEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td>Axotomy protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td>Cornea whole-mount processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun 2%</td>
			<td>Elanco</td>
			<td>N/A</td>
			<td>French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile biopsy punch 2.5 mm</td>
			<td>LCH medical</td>
			<td>LCH-PUK-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>EuroBioSciences</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three strategies to induce neurotrophic keratitis and nerve regeneration in murine cornea

القرنية هي نسيج شفاف يغطي العين وهو ضروري لرؤية واضحة. هذا هو النسيج الأكثر تعصبا في الجسم. يوفر هذا التعصيب الإحساس والوظيفة الغذائية للعين ويساهم في الحفاظ على سلامة القرنية. يسمى الاضطراب المرضي لهذا التعصيب التهاب القرنية العصبي. يمكن أن يحدث هذا بسبب إصابة العين أو الجراحة أو المرض. في هذه الدراسة ، نقترح ثلاثة بروتوكولات مختلفة لإلحاق الضرر بالتعصيب بطرق تلخص الأنواع الثلاثة من الحالات التي تتم مواجهتها بشكل عام في العيادة.
تتمثل الطريقة الأولى في عمل تآكل للظهارة باستخدام لدغ عيني. يتضمن ذلك إزالة الطبقة الظهارية والنهايات العصبية الحرة والضفيرة تحت القاعدية بطريقة مشابهة لجراحة استئصال القرنية الانكسارية الضوئية التي يتم إجراؤها في العيادة. الطريقة الثانية تستهدف فقط التعصيب عن طريق تقسيمه في المحيط بلكمة خزعة ، والحفاظ على سلامة الظهارة. تشبه هذه الطريقة الخطوات الأولى من رأب القرنية الصفائحي وتؤدي إلى تنكس التعصيب يليه إعادة نمو المحاور العصبية في القرنية المركزية. الطريقة الأخيرة تدمر تعصيب نموذج الماوس المعدل وراثيا باستخدام مجهر متعدد الفوتونات ، والذي يحدد على وجه التحديد موقع الكي للألياف العصبية الفلورية. هذه الطريقة تلحق نفس الضرر مثل التهاب القرنية الضوئي ، وهو التعرض المفرط للأشعة فوق البنفسجية.
تصف هذه الدراسة خيارات مختلفة للتحقيق في علم الأمراض الفسيولوجي لتعصيب القرنية ، وخاصة تنكس وتجديد المحاور. تعزيز التجديد أمر بالغ الأهمية لتجنب مضاعفات مثل عيوب الظهارة أو حتى ثقب القرنية. يمكن أن تساعد النماذج المقترحة في اختبار جزيئات دوائية جديدة أو علاج جيني يعزز تجديد الأعصاب ويحد من تطور المرض.

The cornea, which is the transparent surface of the eye, is composed of three distinct layers: the epithelium, the stroma, and the endothelium. This organ has the highest density of innervation in the body and is composed mainly of sensory fibers (types A&#948; and C) originating from the ophthalmic branch of the trigeminal ganglion. Sensory fibers penetrate the periphery of the cornea in the mid-stroma in the form of big bundles that branch out to cover the surface. They then bifurcate to pierce the Bowmann&#39;s membrane and form the subbasal plexus, which is easily recognizable by the formation of a vortex in the center of the cornea. Those fibers terminate as free nerve endings at the external surface of the epithelium. They are able to transduce thermal, mechanical, and chemical stimuli and to release trophic factors that are essential for epithelium homeostasis1,2. Neurotrophic keratitis (NK) is a degenerative disease affecting the corneal sensory innervation. This rare disease stems from a decrease or a loss of corneal sensitivity that results in lower tear production and poor healing properties of the cornea3. NK progresses through three well-described stages, from stage 1 where patients suffer epithelial defects, to stage 3 where stromal melting and/or corneal perforation occur4.
Clinically, the origins of this disease can be diverse. Patients can lose corneal innervation after physical injury to the eye, surgery, or through chronic diseases, such as diabetes5,6. To date, the NK pathogenesis process remains poorly understood, and therapeutical options for this sight-threatening condition are very limited. Therefore, a better understanding of the characteristics of epithelial defects is needed to better understand the mechanisms behind the regeneration of those fibers and potentially promote them. Here, we propose several models of corneal injury that induce NK in mice.
The first model is the abrasion of the epithelial layer of the cornea with an ocular burr. This model has mainly been studied in the context of the regeneration of the epithelium in different animals, such as rodents and fish7,8,9, and to test molecules promoting corneal healing10,11. Physiologically, it takes 2-3 days for the epithelial cells to close the wound. The physiological pattern of the innervation, however, takes more than four weeks to recover from the abrasion12,13. During the surgery, the ocular burr removes the epithelial layer of the cornea that contains the subbasal plexus and the fibers&#39; free nerve endings. This procedure can be clinically compared to patients with photorefractive keratectomy (PRK) to correct eye refractive defects. The procedure consists of removing the epithelium of the cornea and then reshaping the stroma with a laser14. Patients can experience several side effects following such surgery, such as a decrease of corneal nerve density for 2 years and a reduction in sensitivity for a duration of 3 months to one year post-surgery15. Given that the surgery induces a fragility of the corneal microenvironment, this model could help investigate these side effects and develop therapeutical approaches that would promote faster reinnervation, thus reducing the side effects in question.
The second model consists of sectioning the axons at the periphery of the cornea with a biopsy punch, inducing a Wallerian degeneration of the central innervation 16. Clinically, this method could be compared to anterior lamellar keratoplasty, in which the surgeon realizes a partial trephination of the cornea to remove a part of the anterior thickness of the cornea and replace it with a donor transplant 17. Following lamellar keratoplasty, patients may suffer from a number of symptoms including dry eye, loss of corneal innervation and graft rejection18. This axotomy model performed on corneal nerves could provide insight into the mechanisms of fiber degeneration, which occurs after a graft, followed by the axons&#39; regeneration.
The third method damages the corneal nerves with a laser. By using a multiphoton microscope on the cornea of anesthetized animals, degeneration of the nerves localized in the optical field is induced as a result of reactive oxygen species (ROS) formation, which leads to DNA damage and cellular cavitation19. This method recapitulates the corneal photodamage induced by overexposure to natural UV (sunburn), which also triggers ROS formation, leading to DNA damage20. Patients who suffer from corneal sunburn experience great pain, as the deterioration of epithelial cells deprives the corneal fibers&#39; extremities of all.
The three methods described here are designed to enable the investigation of the NK pathogenesis process and axon regeneration. They are easily reproducible and precise. Moreover, they allow quick recovery and easy monitoring of the animals.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير أبحاث تعصيب القرنية من خلال نماذج مبتكرة 

ثلاث استراتيجيات للحث على التهاب القرنية العصبي وتجديد الأعصاب في قرنية الفئران

The cornea, which is the transparent tissue covering the eye, requires a balanced microenvironment to maintain its integrity. The dense innervation of the cornea participates to this microenvironment. If there is a loss, which could be partial or total, of this innervation, then a specific condition arises, which is called neurotrophic keratitis.To find new cures and efficient cures for this disease, we need to have specific models. The expansion of the use of transgenic animal bearing fluorescent reporters and microscopic advances have opened new possibilities in visualizing axonary generation. In vivo imagine has become more accessible to any research lab willing to follow the neurogeneration process.The various causes inducing neurotrophic keratitis underlying the difficulties of having only one model to test nerve regeneration therapies. These three models are reproducing various situations seen in clinics, and sharing those methods will allow other labs to uncover new aspects of corneal innervation from which innovative treatments will be designed.

تقترح هذه الدراسة عدة بروتوكولات لإلحاق الضرر بتعصيب القرنية في الفئران. بينما تم استخدام بروتوكولات مماثلة للتحقيق في علم الأمراض الفسيولوجي لشفاء الظهارة ، اخترنا تكييف وتطوير طرق جديدة للتحقيق في تجديد تعصيب القرنية. لمراقبة التعصيب ، استخدمنا تقنيتين. أولا ، استخدمنا تقنية التألق ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Corneal Innervation Research Through Innovative Models at JoVE.com

هنا ، نقترح ثلاث طرق مختلفة لإتلاف الألياف الحسية التي تعصب القرنية. تسهل هذه الطرق دراسة تجديد المحور العصبي في الفئران. هذه الطرق الثلاث ، القابلة للتكيف مع النماذج الحيوانية الأخرى ، مثالية لدراسة فسيولوجيا تعصيب القرنية وتجديدها.

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation ...

تتطلب القرنية ، وهي النسيج الشفاف الذي يغطي العين ، بيئة دقيقة متوازنة للحفاظ على سلامتها. يشارك التعصيب الكثيف للقرنية في هذه البيئة المكروية. إذا كان هناك خسارة ، والتي يمكن أن تكون جزئية أو كلية ، من هذا التعصيب ، ثم تنشأ حالة محددة ، والتي تسمى التهاب القرنية العصبي.للعثور على علاجات جديدة وعلاجات فعالة لهذا المرض ، نحتاج إلى نماذج محددة. فتح التوسع في استخدام مراسلي الفلورسنت الحاملين للحيوانات المعدلة وراثيا والتقدم المجهري إمكانيات جديدة في تصور توليد المحور. في الجسم الحي ، أصبح التخيل في متناول أي مختبر أبحاث على استعداد لمتابعة عملية التوليد العصبي.الأسباب المختلفة التي تحفز التهاب القرنية العصبي الكامنة وراء صعوبات وجود نموذج واحد فقط لاختبار علاجات تجديد الأعصاب. هذه النماذج الثلاثة تعيد إنتاج المواقف المختلفة التي شوهدت في العيادات ، ومشاركة هذه الأساليب ستسمح للمختبرات الأخرى بالكشف عن جوانب جديدة من تعصيب القرنية التي سيتم تصميم علاجات مبتكرة منها.

three-strategies-to-induce-neurotrophic-keratitis-nerve-regeneration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Three Strategies to Induce Neurotrophic Keratitis and Nerve Regeneration in Murine Cornea

1.0K Views.  University of  Montpellier, INSERM. تتطلب القرنية ، وهي النسيج الشفاف الذي يغطي العين ، بيئة دقيقة متوازنة للحفاظ على سلامتها. يشارك التعصيب الكثيف للقرنية في هذه البيئة المكروية. إذا كان هناك خسارة ، والتي يمكن أن تكون جزئية أو كلية ، من هذا التعصيب ، ثم تنشأ حالة محددة ، والتي تسمى التهاب القرنية العصبي.?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تطوير أبحاث تعصيب القرنية من خلال نماذج مبتكرة 

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation provides sensation and trophic function to the eye and contributes to preserving corneal integrity. The pathological disruption of this innervation is termed neurotrophic keratitis. This can be triggered by injury to the eye, surgery, or disease. In this study, we propose three different protocols for inflicting damage on the innervation in ways that recapitulate the three types of cases generally encountered in the clinic.
The first method consists in making an abrasion of the epithelium with an ophthalmic burr. This involves the removal of the epithelial layer, the free nerve endings, and the subbasal plexus in a manner similar to the photorefractive keratectomy surgery performed in the clinic. The second method&#160;only targets the innervation by sectioning it at the periphery with a biopsy punch, maintaining the integrity of the epithelium. This method is similar to the first steps of lamellar keratoplasty and leads to a degeneration of the innervation followed by regrowth of the axons in the central cornea. The last method damages the innervation of a transgenic mouse model using a multiphoton microscope, which specifically localizes the site of cauterization of the fluorescent nerve fibers. This method inflicts the same damage as photokeratitis, an overexposure to UV light.
This study describes different options for investigating the physiopathology of corneal innervation, particularly the degeneration and regeneration of the axons. Promoting regeneration is crucial for avoiding such complications as epithelium defects or even perforation of the cornea. The proposed models can help test new pharmacological molecules or gene therapy that enhance nerve regeneration and limit disease progression.

Here, we propose three different methods of damaging the sensory fibres innervating the cornea. These methods facilitate the study of axon regeneration in mice. These three methods, which are adaptable to other animal models, are ideal for the study of corneal innervation physiology and regeneration.

Murine Corneal Nerve Abrasion for the Induction of Neurotrophic Keratitis

To begin corneal abrasion, place an anesthetized mouse on a table. Apply a drop of artificial tear on the eye undergoing the surgery. Apply a drop of ocular gel on the contralateral eye.Next, position the mouse on its side on a heated plate. Gently use a cotton swab to absorb the artificial tear, and brush aside the mouse's eyelashes without making contact with the eye. Turn on the ocular burr, and carefully open the mouse's eyelid with two fingers.Simultaneously shield the vibrancy to prevent them from entangling in the burr. Locate the pupil or the eye center and gently apply the ocular burr to the eye's surface in circular motions until the epithelium is removed. Alternatively, perform about 20 circular movements on the cornea.Now apply a drop of fluorescent staining solution on the abraided eye. After 20 seconds, dab the eye with a tissue to absorb the solution. Then rinse it with a drop of artificial tear.Finally, absorb the artificial tear with a tissue, and illuminate the eye using a blue cobalt lamp. Prior to the surgery, the basal epithelium was intact and the nerve fibers in the sub basal plexus formed a vortex. The burr tip removed the outer corneal layer, leaving the stroma and endothelium intact with a visible gap at the basal epithelium and sub basal plexus.Regeneration of the epithelium occurred over a week post-surgery. However, the vortex remained absent from the corneal center.

الفئران تآكل العصب القرني لتحريض التهاب القرنية العصبي

Murine Corneal Nerve Axotomy for the Induction of Neurotrophic Keratitis

To begin corneal nerve axotomy, place an anesthetized mouse on a table. Apply a drop of artificial tear on the eye undergoing the surgery. Apply a drop of ocular gel on the contralateral eye.Position the mouse under a binocular loupe to assess the eye that is being operated on. Place the bottom of a Petri dish under the mouse's head to keep the eye horizontal. With a cotton swab, carefully dad the artificial tear from the eye and remove the eyelashes without touching the eye.Place a pair of smooth curved pillars under the animal's eye and gently pop it out of the orbit. Gently place a biopsy punch vertically against the cornea surface, apply pressure, and twist the punch several times. Then, remove the biopsy punch and a circular mark should be visible on the cornea.A thin peripheral ring was seen at the point where the biopsy punch was applied, which damaged the basal epithelium. The peripheral nerves appeared to be sectioned, triggering the Wallerian axon degeneration. Heavy degeneration was observed, leading to total loss of innervation in the cornea center.This resulted in the disintegration of the epithelial layer, creating an ulcer.

الفئران القرنية المعصب التصنيفي لتحريض التهاب القرنية العصبي

Localized Laser Ablation of Murine Corneal Nerves for the Induction of Neurotrophic Keratitis

To begin, place an anesthetized mouse on a table. Apply a drop of ocular gel on both eyes. Place the animal in a head holder to secure its position.Rotate the animal by 90 degrees so that the eye being operated on faces the ceiling. Secure the animal's vibrancy to clear the area around the eye. Secure the animal's body to minimize head movements caused by breathing.Place a circular cover slip horizontally over the eye on top of the ocular gel. Adjust the animal's head as necessary to correctly position the cover slip. Add a drop of PBS on top of the cover slip, then carefully place the animal onto a microscope stage.Adjust the objective turret of the microscope to the appropriate distance for observation. Activate the lasers to induce corneal nerve ablation. Once nerve ablation is complete, remove the animal from the head holder and place it in a cage on a heated plate.The vortex was visibly absent one week after laser ablation. A group of immune cells were observed to have migrated to the illumination site. The stromal fiber bundles appeared to have thinned out.